Manipulacja pojedynczymi neuronalnymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu za pomocą mikroiniekcji robotycznej

Technika ta umożliwia bliższe przyjrzenie się pojedynczym komórkom w żywej tkance. Śledząc i manipulując pojedynczymi komórkami, możemy lepiej zrozumieć tworzenie się tkanek podczas rozwoju. Wizualna demonstracja tej metody pozwala potencjalnym użytkownikom zdecydować, czy ta technika może być pomocna w ich pracy.

Dodatkowo umożliwia użytkownikom zobaczenie, w jaki sposób aplikacja jest uruchomiona, co byłoby trudne do uchwycenia z samego tekstu. Protokół ten można zastosować do każdej tkanki o możliwej do oceny powierzchni. Skupialiśmy się na różnych komórkach w tych samych tkankach, różnych tkankach tego samego gatunku, a także różnych gatunków.

Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby zachować koncentrację i pracować szybko. Cały sprzęt należy przygotować przed rozpoczęciem sekcji. Zacznij od zainstalowania oprogramowania automatycznego wstrzykiwacza i wyciągnięcia pipet do mikroiniekcji z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet.

Pipety należy przechowywać do trzech dni w celu ochrony przed kurzem. Rozpuść agarozę o szerokości 3% za pomocą kuchenki mikrofalowej. Nie pozwól, aby agaroza zastygła, trzymając ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Rozmrozić podwielokrotność SCM i podgrzać od 10 do 12 mililitrów karty SIM i 20 mililitrów roztworu Tyrode'a do 37 stopni Celsjusza za pomocą łaźni wodnej. Wymieszać znacznik fluorescencyjny z innymi substancjami chemicznymi, które mają być wstrzyknięte, a następnie odwirować roztwór do mikroiniekcji w temperaturze 16 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.

Roztwór do mikroiniekcji należy przechowywać na lodzie do czasu użycia. Użyj głów zarodków myszy od E13.5 do E16.5, aby przygotować organotypowe wycinki tkanki kresomózgowia. Usuń skórę i otwórz czaszkę za pomocą kleszczy poruszających się wzdłuż linii środkowej.

Wypreparuj mózg embrionalny z otwartej czaszki i usuń opony mózgowe pokrywające tkankę mózgową, zaczynając od brzusznej strony mózgu. Pozostaw wypreparowany cały mózg w roztworze Tyrode'a na bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wlej szeroką gamę stopionej agarozy do jednorazowej formy do zatapiania.

Gdy ostygnie do 38 do 39 stopni Celsjusza, ostrożnie przenieś do czterech mózgów do agarozy za pomocą pipety Pasteura. Wymieszaj agarozę wokół tkanki za pomocą szpatułki lub pary kleszczy Dumonta numer jeden, nie dotykając tkanki. Niech agaroza zestali się w temperaturze pokojowej.

Gdy agaroza zastygnie, odetnij nadmiar otaczający tkankę. Napełnij tacę buforową PBS. Ustaw mózg tak, aby rostralna oś ogonowa tkanki była prostopadła do tacy i wytnij 250 mikrometrów za pomocą wibratomu.

Napełnij 3,5-centymetrową szalkę Petriego dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża, a następnie użyj plastikowej pipety Pasteura, aby przenieść 10 do 15 plasterków do tego naczynia. Po zakończeniu przenieś szalkę Petriego z plastrami do inkubatora do hodowli plastrów. Utrzymuj plastry w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze.

Włącz komputer, mikroskop, kamerę mikroskopową, manipulatory, zestaw ciśnieniowy i czujnik ciśnienia. Załaduj aplikację, klikając plik, uruchom app. py w głównym folderze pobranym z GitHub i określ ustawienia urządzenia na wyskakującym ekranie.

Aby zapobiec niepożądanemu zatkaniu, przed zanurzeniem pipety w roztworze należy wytworzyć ciśnienie na zewnątrz. Przesuń pasek ciśnienia kompensacji do 24 do 45% i kliknij ustaw wartości. Następnie dostosuj ciśnienie, przekręcając pokrętło mechanicznego zaworu ciśnieniowego na jeden lub dwa PSI, zgodnie ze wskazaniami czujnika ciśnienia.

Przenieś plastry na środek 3,5-centymetrowej szalki Petriego zawierającej dwa mililitry wstępnie podgrzanej karty SIM, a następnie umieść szalkę Petriego na etapie mikroiniekcji, który został wstępnie podgrzany do 37 stopni Celsjusza. Załadować pipetę do mikroiniekcji 1,4 do 1,6 mikrolitra roztworu do mikroiniekcji za pomocą plastikowej pipety z długą końcówką i włożyć pipetę do mikroiniekcji do uchwytu na pipety. Używając najmniejszego powiększenia mikroskopu, ustaw ostrość wycinka i skieruj mikropipetę do tego pola widzenia, tak aby była skupiona na tej samej płaszczyźnie co cel plasterka.

Przełącz wyjście mikroskopu na kamerę, aby zobaczyć pole widzenia i aplikację. Kliknij przycisk powiększenia w lewym górnym rogu interfejsu, aby rozpocząć kalibrację urządzenia. Gdy w oknie pojawi się monit o wybranie powiększenia, wybierz 10X i naciśnij OK. Oprogramowanie zakłada, że wewnętrzna soczewka obiektywu ma powiększenie 10X.

Ponownie ustaw ostrość końcówki pipety za pomocą pokrętła mikrometrycznego mikroskopu i kliknij końcówkę pipety kursorem. Następnie naciśnij przycisk kroku 1.1 i naciśnij OK w wyskakującym okienku. Pipeta przesunie się w kierunku y.

Kliknij końcówkę pipety i naciśnij przycisk kroku 1.2. Na koniec wprowadź 45 w polu kąta pipety i naciśnij ustawiony kąt. Wprowadź żądane parametry do panelu sterowania automatycznym mikrowtryskiem i ustaw prędkość na 100%Po zakończeniu kliknij ustaw wartości.

Kliknij przycisk rysowania krawędzi i przeciągnij kursor wzdłuż żądanej trajektorii w wyskakującym okienku, aby zdefiniować trajektorię wstrzykiwania. W przypadku mikroiniekcji neuronów należy skupić się na podstawowej stronie kresomózgowia. Ustawić pipetę na początku linii i kliknąć jej końcówkę, a następnie kliknąć przycisk Uruchom trajektorię, aby rozpocząć mikroiniekcję.

Powtórzyć ten krok dla każdej docelowej płaszczyzny wstrzyknięcia. Zanurz plastry w mieszaninie kolagenu, a następnie przenieś plastry razem z 200 do 300 mikrolitrami kolagenu do 14-milimetrowego dołka w 35-milimetrowym szklanym naczyniu. Upewnij się, że plastry są pokryte jak najmniejszą ilością kolagenu, co jest optymalnym warunkiem dla pobierania składników odżywczych i tlenu.

Ułóż plastry za pomocą dwóch par kleszczy i inkubuj szalkę Petriego przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bloku grzewczym, aby kolagen mógł się zestalić. Przenieś szalkę Petriego z powrotem do inkubatora do hodowli plastrów na dodatkowe 40 minut, a następnie dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego SCM. Pod koniec hodowli wyjmij plastry z inkubatora do hodowli plastrów i odessaj SCM.

Umyj plastry zatopione kolagenem PBS, a następnie dodaj 4% paraformaldehydu i pozostaw tkankę w temperaturze pokojowej na 30 minut. Przesuń go do czterech stopni Celsjusza, aby utrwalić przez noc. Następnego dnia odessać roztwór paraformaldehydu i umyć plastry PBS.

Usuń plastry z kolagenu za pomocą dwóch par kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby stopić agarozę o niskiej temperaturze topnienia, a następnie wlej ją do jednorazowej formy do zatapiania i pozwól jej ostygnąć do około 38 lub 39 stopni Celsjusza. Przenieś plasterki tkanki do tej formy, upewniając się, że strona obierana plasterka jest skierowana do góry, a następnie pozwól agarozie ostygnąć do temperatury pokojowej i zestalić się.

Przytnij dodatkową agarozę otaczającą plastry. Ustaw blok agarozy tak, aby powierzchnia cięcia była równoległa do ostrza tnącego wibratomu i wytnij odcinki o grubości 50 mikrometrów. Napełnij 24-dołkowe naczynie PBS i przenieś skrawki do tego naczynia za pomocą pędzla z cienką końcówką, a następnie wykonaj immunofluorescencję zgodnie ze standardowymi protokołami.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy pomyślnie wstrzykniętych komórek progenitorowych i nowo narodzonych neuronów. Po wstrzyknięciu Dextran Alexa 488 komórki wydają się w pełni wypełnione barwnikiem. Zautomatyzowana mikroiniekcja może zapewnić znacznie wyższą przepustowość w porównaniu z ręczną mikroiniekcją.

Co więcej, etykietowanie EDU potwierdza, że automatyzacja nie ma wpływu na żywotność komórek. Utrzymanie wycinka organotypowego w hodowli umożliwia śledzenie progresji linii komórkowych, którym poddano mikrowstrzyknięte komórki. Mikroiniekcja do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych zapewnia doskonałą rozdzielczość pojedynczych komórek.

Dlatego został wykorzystany do analizy biologii komórki pod kątem progresji nerwowych komórek macierzystych i przejścia losu. Protokół ten został wykorzystany do zbadania sprzężenia połączeniowego w nowonarodzonych neuronach poprzez wstrzyknięcie żółtego Lucyfera wraz z Dekstranem A555. Część nowonarodzonych neuronów piramidowych była sprzężona za pomocą połączeń szczelinowych z sąsiednimi neuronami, co jest zgodne z ideą, że niedojrzałe neurony komunikują się za pośrednictwem połączenia szczelinowego.

Wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania biologii rozwoju i ewolucji mózgu w komórkach. Przebadaliśmy kilka genów kandydujących, które wpływają na zachowanie nerwowych komórek macierzystych i byliśmy w stanie odkryć i zrozumieć, jak one działają, jak wpływają na progresję linii nerwowych komórek macierzystych i produkcję neuronów podczas rozwoju mózgu.