Name: Pomiary FLIM-FRET interakcji białko-białko u żywych bakterii. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj technikę FLIM-FRET do badania interakcji białko-białko w żywych komórkach Pseudomonas aeruginosa. Metoda umożliwia analizę interakcji przy niezrównoważonych poziomach ekspresji białek dawcy i akceptora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Ludovicowi Richertowi za jego cenną pomoc w pozyskiwaniu danych FLIM oraz za techniczną konserwację i rozwój konfiguracji FLIM. Praca ta została sfinansowana z grantów Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN jest finansowany przez Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906). YM jest wdzięczny Institut Universitaire de France (IUF) za wsparcie i zapewnienie dodatkowego czasu na badania. IJS i JG dziękują Instytutowi Dostarczania Leków w Strasburgu za wsparcie finansowe.

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+From+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li>
<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).</li>
<li>Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein-protein+interactions%3A+Progress%2C+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions.</a> Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).</li>
<li>Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+protein+dynamics+of+the+siderophore+pyoverdine+pathway+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).</li>
<li>Ringel, M. T., Brüser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+pyoverdines%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of pyoverdines.</a> Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).</li>
<li>Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+siderophore+biosynthesis+among+fluorescent+Pseudomonads+and+new+insights+into+their+complex+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization.</a> Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+detecting+protein-protein+interactions+in+living+cells%3A+principles%2C+limitations%2C+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress.</a> Science China Life Sciences. , (2019).</li>
<li>Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDay%2C+RN+%22Springer+Series+in+Chemical+Physics%22">Springer Series in Chemical Physics</a>. 111, 249-276 (2015).</li>
<li>Bastiaens, P. I. H., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+Spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).</li>
<li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).</li>
<li>Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+CFP%2FYFP+and+GFP%2FmCherry+Pairs+to+Donor+Photobleaching+on+FRET+Determination+by+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Leray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+of+a+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscope+for+fret+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements.</a> Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).</li>
<li>Elson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+including+single-shot+acquisition+with+a+segmented+optical+image+intensifier%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier.</a> New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).</li>
<li>Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM-FRET+for+Cancer+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">FLIM-FRET for Cancer Applications.</a> Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 8, 393-399 (2011).</li>
<li>Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+sequence+of+the+pvdA+gene+encoding+the+pyoverdin+biosynthetic+enzyme+L-ornithine+N5-oxygenase+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).</li>
<li>Imperi, F., Visca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+pyoverdine+biogenesis+machinery+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+A+membrane-associated+%27siderosome%27%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'.</a> FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).</li>
<li>Gasser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+FRET-FLIM+and+single+molecule+tracking+reveal+the+supra-molecular+organization+of+the+pyoverdine+bio-synthetic+enzymes+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).</li>
<li>Rietsch, A., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+type+III+secretion+gene+expression+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).</li>
<li>Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).</li>
<li>Godet, J., Mély, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+protein-protein+interactions+with+large+differences+in+protein+expression+levels+using+FLIM-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007(2019).</li>
<li>El Meshri, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nucleocapsid+domain+in+HIV-1+gag+oligomerization+and+trafficking+to+the+plasma+membrane%3A+A+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bh+TCSPC+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">The bh TCSPC Handbook.</a> Scanning. , 1(2010).</li>
<li>Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+HIV-1+protein+oligomerization+by+FLIM+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Series+in+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy.</a> Springer Series in Chemical Physics. , 111(2015).</li>
<li>Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasor+based+analysis+of+FRET+images+recorded+using+spectrally+resolved+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).</li>
<li>Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescence+lifetime+estimation+with+modified+phasor+approach+and+Laguerre+deconvolution%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003(2017).</li>
<li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+protein-protein+interactions+using+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+High-Throughput+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy+to+Detect+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions.</a> Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).</li>
<li>Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+biomarker+screening+by+FLIM-FRET+for+combination+therapy+in+ER%2B+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer.</a> Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fluorescence+lifetime+imaging+techniques%3A+A+review+on+challenge+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+fitting+based+FRET-FLIM+analysis+approaches+applied+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Stringari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+microscopy+distinguishes+different+metabolic+states+of+germ+cells+in+a+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).</li>
<li>Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis.</a> Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).</li>
<li>Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+nuclear+wide+chromatin+compaction+by+phasor+analysis+of+histone+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+in+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29+data%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data.</a> Data in Brief. 30, 105401(2020).</li>
<li>Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrimm%2C+JB+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22">Progress in Molecular Biology and Translational Science</a>. 113, Elsevier Inc. (2013).</li>
<li>Li, L., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+of+Small-Molecule+Fluorogenic+Probes+for+Bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging.</a> Biochemistry. 59, 216-217 (2020).</li>
<li>Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Net-FLICS%3A+fast+quantitative+wide-field+fluorescence+lifetime+imaging+with+compressed+sensing+-+deep+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach.</a> Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).</li>
<li>Smith, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fit-free+analysis+of+fluorescence+lifetime+imaging+via+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).</li>
<li>Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+compressive+macroscopic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+-+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging.</a> Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

FLIM-FRET oferuje kilka kluczowych zalet w porównaniu z obrazowaniem FRET opartym na intensywności. Czas życia fluorescencji jest nieodłącznym parametrem fluoroforu. W konsekwencji nie jest ono zależne ani od lokalnych stężeń fluoroforów, ani od intensywności wzbudzenia świetlnego. Na żywotność fluorescencji dodatkowo słabo wpływa fotowybielanie. Szczególnie interesujące jest udowodnienie IPP w komórkach, w których lokalne stężenia białek mogą być wysoce niejednorodne w przedziałach lub regionach subkomórkowych. FLIM-FRE...

Oddziaływania białko-białko (PPIs) kontrolują różne kluczowe procesy w komórkach1. Role PPIs różnią się w zależności od składu białek, powinowactwa, funkcji i lokalizacji w komórkach2. PPIs można badać za pomocą różnych technik3. Na przykład koimmunoprecypitacja jest stosunkowo prostą, niezawodną i niedrogą techniką, powszechnie wykorzystywanym narzędziem do identyfikacji lub potwierdzania PPIs. Jednak badanie PPIs może być trudne, gdy oddziałujące białka wykazują niski poziom ekspresji lub gdy oddziaływania są przejściowe bądź występują tylko w specyficznych środowiskach. Badanie PPIs zachodzących między różnymi enzymami szlaku piowerdyny u P. aeruginosa wymaga zniesienia represji przez ogólny repressor zależny od żelaza Fur, aby umożliwić ekspresję wszystkich białek szlaku piowerdyny w komórce4,5,6. Ta wspólna regulacja dla wszystkich białek szlaku skutkuje terminową ekspresją w komórce, co ma sprzyjać ich oddziaływaniom. Różnorodność pod względem wielkości, natury, poziomów ekspresji i liczby białek tego szlaku metabolicznego utrudnia jego badanie w systemach zrekonstytuowanych6. Badanie PPIs w ich środowisku komórkowym jest zatem kluczowe dla lepszego zrozumienia funkcji biologicznych białek w ich natywnym kontekście.
Jedynie nieliczne metody, w tym fluorescencja, pozwalają na badanie PPI w żywych komórkach7. Wśród różnych mierzalnych parametrów fluorescencji czas życia fluorescencji (tj. średni czas, przez który fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym przed emisją fotonu) jest prawdopodobnie jednym z najciekawszych parametrów do badania w żywych komórkach. Czas życia fluorescencji fluoroforu jest bardzo wrażliwy na jego otoczenie, w związku z czym FLIM może dostarczać informacji chemicznych lub fizycznych dotyczących środowiska fluoroforu8. Obejmuje to obecność Försterowskiego rezonansowego transferu energii (FRET), który może wystąpić w obecności „akceptora” fluorescencji znajdującego się w niewielkiej odległości od „donora” fluorescencji. Transfer energii skutkuje znacznym skróceniem czasu życia fluorescencji donora (Rysunek 1A), co czyni mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) potężnym podejściem do badania oddziaływań białko-białko bezpośrednio w żywych komórkach. FLIM może ponadto dostarczyć informacji przestrzennych o tym, gdzie w komórkach dochodzi do tych oddziaływań7,8. Podejście to jest niezwykle skuteczne w badaniu PPI w sytuacjach, gdy możliwe jest znakowanie fluoroforami obu oddziałujących partnerów.
Aby doszło do FRET, wymagane są krytyczne warunki dotyczące odległości między dwoma fluoroforami8,9. Dwa fluorofory nie mogą być oddalone od siebie o więcej niż 10 nm. Dlatego podczas projektowania eksperymentów FLIM-FRET należy zachować ostrożność, aby zapewnić, że donor i akceptor fluorescencji mają możliwość znajdowania się blisko siebie w kompleksie oddziałującym. Choć może się to wydawać ograniczające, w rzeczywistości jest to istotna zaleta, ponieważ zależność FRET odległości gwarantuje, że dwa znakowane białka podlegające FRET muszą fizycznie ze sobą oddziaływać (Rysunek 1A). Trudności w uzyskaniu jednoznacznych odpowiedzi na temat PPI w eksperymentach z kolokalizacją (dwa kolokalizowane białka niekoniecznie muszą oddziaływać) nie stanowią zatem problemu w przypadku zastosowania FLIM-FRET.
<img alt="Schemat transferu energii między fluorescencyjnymi donoremami i akceptorem; proces FRET z wykresem nakładania się intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Zasada analizy FLIM-FRETKażdy piksel wielowymiarowego obrazu FLIM-FRET zawiera informacje o zaniku fluorescencji zarejestrowanym w tym konkretnym miejscu (#counts = liczba fotonów wykrytych w kanale t).AKlasyczna reprezentacja obrazu FLIM to zazwyczaj dwuwymiarowy obraz w fałszywych kolorach z zakodowanym czasem życia (po lewej). W obecności FRET można zaobserwować skrócenie średniego czasu życia fluorescencji donora – widoczne jako zmiana w skali kolorystycznej – co dostarcza informacji o występowaniu PPI w tym obszarze przestrzennym.BNakładanie się widma emisji donora i widma absorpcji akceptora jest niezbędne do zajścia procesu FRET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Drugim wymaganiem dla FRET jest to, aby widmo emisji donora i widma absorpcji akceptora nakładały się na siebie8 (Rysunek 1B). Wzbudzanie fluorescencji donora powinno odbywać się przy długościach fal, które w niewielkim stopniu przyczyniają się do bezpośredniego wzbudzania fluorescencji akceptora. Nie wszystkie kombinacje fluoroforów są możliwe i dodatkowo zalecamy preferencyjne stosowanie donorów o monoeksponencjalnym zaniku fluorescencji, aby ułatwić interpretację wyników FLIM-FRET10. Kilka par białek fluorescencyjnych spełnia te wymagania, w tym popularna para eGFP-mCherry1 (przegląd palety dostępnych par białek fluorescencyjnych do FRET znajduje się w12,13).
Metoda FLIM-FRET umożliwia pomiar zaniku czasu życia fluorescencji donora FRET w każdym pikselu obrazu FLIM (Ryc. 1A). Istnieją dwie główne techniki wyznaczania czasu życia fluorescencji, które różnią się sposobem akwizycji i analizy: dziedzinowa częstotliwości (FD)14 oraz dziedzinowa czasu (TD). TD FLIM jest bardziej rozpowszechniona i realizowana przy użyciu oświetlenia impulsowego w połączeniu z różnymi konfiguracjami detekcji, w tym metodami bramkowania15, kamerą smugową16 lub technikami czasowo skorelowanego zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC)8. W obu technikach, FD i TD, czas życia fluorescencji nie jest mierzony bezpośrednio, lecz wymaga analizy zebranych danych w celu oszacowania czasu (lub czasów) życia lub stwierdzenia obecności oddziaływań. W przypadku technik TCSPC najpowszechniejsza analiza opiera się na dopasowywaniu krzywych zaniku do funkcji jedno- lub wielo-wykładniczych przy użyciu iteracyjnych rekonwolucji metodą najmniejszych kwadratów, co pozwala zminimalizować ważoną sumę rezyduów.
Wreszcie, technikę FLIM-FRET można przeprowadzić zarówno z wykorzystaniem wzbudzenia jednofotonowego, jak i wielofotonowego. To drugie oferuje kilka zalet, takich jak redukcja autofluorescencji i fotouszkodzeń poza płaszczyzną ogniskowania. Wzbudzenia wielofotonowe umożliwiają również uzyskanie większej głębokości wzbudzenia podczas pracy z grubymi próbkami 3D8. Z kolei wzbudzenie jednofotonowe jest zazwyczaj bardziej wydajne, ponieważ przekroje czynne absorpcji dwufotonowej białek fluorescencyjnych są ograniczone17.
W niniejszej pracy proponujemy protokół pomiarów FLIM-FRET w celu badania PPI w żywych komórkach P. aeruginosa w konkretnym przypadku dwóch oddziałujących białek (PvdA i PvdL) wykazujących znaczną różnicę w liczbie kopii, aby zademonstrować jakość i niezawodność tej techniki w ujawnianiu kluczowych cech PPI. Białka PvdA i PvdL biorą udział w biosyntezie piowerdyny. PvdA jest L-ornitynową N5-oksygenazą i syntetyzuje L-N5-formylo-N5-hydroksyornitynę z L-ornityny poprzez hydroksylację (PvdA) i formylację (PvdF)18. PvdL jest enzymem syntezy peptydów nierybosomalnych (NRPS) składającym się z czterech modułów. Pierwszy moduł katalizuje acylację kwasu mirystynowego. Drugi moduł katalizuje aktywację L-Glu i jego kondensację z mirystylo-CoA. Następnie trzeci moduł kondensuje aminokwas L-Tyr, który jest następnie izomeryzowany do D-Tyr. W końcu czwarty moduł wiąże aminokwas L-Dab (kwas diaminobutyrowy), tworząc acylowany tripeptyd L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL jest zatem odpowiedzialny za syntezę trzech pierwszych aminokwasów prekursora piowerdyny. Oddziaływanie białka PvdA z PvdL jest zaskakujące, ponieważ PvdL, w przeciwieństwie do PvdI i PvdJ, nie posiada modułu specyficznego dla L-N5-formylo-N5-hydroksyornityny. Oddziaływanie to sugeruje, że wszystkie enzymy odpowiedzialne za biosyntezę prekursora piowerdyny są zorganizowane w duże, przejściowe i dynamiczne kompleksy wieloenzymatyczne19,20.
W niniejszym raporcie szczegółowo wyjaśniamy, jak konstruować szczepy bakteryjne natywnie wykazujące ekspresję dwóch oddziałujących ze sobą białek znakowanych eGFP i mCherry. Opisujemy również przygotowanie próbek oraz warunki umożliwiające wydajne obrazowanie komórek metodą FLIM-FRET. Na koniec proponujemy instrukcję analizy obrazu krok po kroku, obejmującą niedawno opracowane narzędzie zapewniające zaawansowane możliwości wizualizacji, co pozwala na prostą interpretację złożonych danych FLIM-FRET. Poprzez ten raport chcielibyśmy przekonać nie tylko odważnych, ale większość biologów, że FRET-FLIM jest przystępną i potężną techniką, która pozwala bezpośrednio badać PPI w natywnym środowisku komórkowym.

<table><tbody><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy 525/50 nm</td><td>F37-516, AHF, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr krótkoprzepustowy 680 nm</td><td>F75-680, AHF, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu (NH4)2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Polimeraza DNA 5U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda lawinowa sprzężona z włóknem</td><td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (grubość nr 1,5, 20 razy; 20mm</td><td>Knitel glass</td><td>MS0011</td><td></td></tr><tr><td>High-Fidelity DNA polimeraza Phusion 2U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Rosół lizogeniczny (LB)</td><td>Milipor</td><td>1.10285</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4 . 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe (25 razy; 75mm)</td><td>Knitel glass</td><td>MS0057</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Żel i czyszczenie PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Plazmid</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.10</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sód Bursztynian (disód)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160</td><td></td></tr><tr><td>SPCImage, oprogramowanie SPCM</td><td>Becker & Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna pętla inokulacyjna</td><td>Nunc</td><td>7648-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA 1U/&mu; L</td> Moduł TCSPC <td>15224017</td><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>SPC830, Becker & Hickl, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Szafirowy laser</td><td>Insight DeepSee, Rurki do fizyki</td><td></td><td></td>widm</tr><tr><td>50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary flim-fret interakcji białko-białko u żywych bakterii.

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Interakcje białko-białko (PPI) kontrolują różne kluczowe procesy w komórkach. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) w połączeniu z rezonansowym transferem energii Förstera (FRET) dostarcza dokładnych informacji o IPP w żywych komórkach. FLIM-FRET opiera się na pomiarze zaniku fluorescencji w czasie życia dawcy FRET w każdym pikselu obrazu FLIM, dostarczając ilościowych i dokładnych informacji o IPP i ich przestrzennych organizacjach komórkowych. Proponujemy tutaj szczegółowy protokół pomiarów FLIM-FRET, który zastosowaliśmy do monitorowania IPP w żywych Pseudomonas aeruginosa w szczególnym przypadku dwóch oddziałujących białek ulegających ekspresji o bardzo różnej liczbie kopii, aby zademonstrować jakość i solidność techniki ujawniania krytycznych cech IPP. Protokół ten szczegółowo opisuje wszystkie niezbędne kroki do charakterystyki PPI - począwszy od konstrukcji mutantów bakteryjnych, aż do końcowej analizy przy użyciu niedawno opracowanych narzędzi zapewniających zaawansowane możliwości wizualizacji dla prostej interpretacji złożonych danych FLIM-FRET.

Empiryczne funkcje rozkładu skumulowanego (ecdf) czasów życia fluorescencji zmierzonych dla różnych szczepów bakteryjnych przedstawiono na Rysunku 8. W przypadku wystąpienia zjawiska FRET, ecdf są przesunięte w stronę krótszych czasów życia (Rysunek 8A,8B). Należy zauważyć, że gdy oddziaływanie dwóch białek skutkuje dużą odległością między dwoma fluoroforami, FRET nie może wystąpić (Rysunek 8C). Sytuacji tej nie moż...

Opisujemy tutaj protokół charakteryzujący interakcje białko-białko pomiędzy dwoma białkami o bardzo różnej ekspresji u żywych Pseudomonas aeruginosa za pomocą pomiarów FLIM-FRET. Protokół obejmuje konstrukcje szczepów bakterii, immobilizację bakterii, procedury obrazowania i analizy danych po obrazowaniu.

Pomiary FLIM-FRET interakcji białko-białko u żywych bakterii.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET to zaawansowana technika, która umożliwia potwierdzenie podejrzewanych lub przewidywanych interakcji białko-białko. W niniejszym protokole przedstawiono sposób analizy danych w szczególnych przypadkach niezrównoważonych ilości dawców i akceptorów. FILM-FRET jest w stanie dostarczyć informacji na temat interakcji białko-białko bezpośrednio w żywych komórkach.Ważne jest zbadanie interakcji między człowiekiem a białkiem w natywnym środowisku komórkowym, w szczególności, gdy białka fluorescencyjne ulegają ekspresji na poziomie endogennym. Zacznij od wyhodowania bakterii pomocniczych P.aeruginosa, E.coli TOP10 i E.coli w pięciu mililitrach LB bez antybiotyku w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając przez noc. Następnego dnia zmierz gęstość optyczną kultur i wymieszaj równą ilość P.aeruginosa, E.coli TOP10 i pomocnika E.coli w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra.Wirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 9, 300 razy G, aby osadzać bakterie, a następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach LB. Umieść plamę mieszaniny na podgrzanym agarze LB i inkubuj przez pięć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji zeskrobać miejsce sterylną pętlą inokulacyjną i ponownie zawiesić w jednym mililitrze LB. Umieść 100 mikrolitrów tej zawiesiny bakteryjnej na agarze LB zawierającym 10 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i 30 mikrogramów na mililitr gentamycyny i inkubuj przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu wyeliminowania bakterii E. coli TOP10 i E. coli. Ponownie zawiesić jedną kolonię w jednym mililitrze LB i inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym przez cztery godziny, następnie odwirować probówkę przez trzy minuty przy 9, 300 razy G i odrzucić 950 mikrolitrów supernatantu.Zawiesić osad w 50 mikrolitrach LB i wyizolować mieszaninę na agarze LB zawierającym sacharozę i bez chlorku sodu. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Na agarze LB i agarze LB należy umieścić izolowane kolonie zawierające 15 miligramów na mililitr gentamycyny w celu sprawdzenia wrażliwości na gentamycynę.Umieść szklane szkiełko mikroskopowe na płaskiej poziomej powierzchni i ułóż wokół niego dwa szklane szkiełka pokryte dwiema warstwami taśmy klejącej. Odpipetować 70-mikrolitrową kroplę 1% stopionej agarozy na szklane szkiełko i umieścić czwarte szkiełko na górze, aby spłaszczyć kroplę agarozy. Delikatnie dociśnij przez około minutę.Zdejmij górne szkiełko i upuść około trzech mikrolitrów bakterii w trzech do czterech miejscach w różnych miejscach na podkładce agarozowej. Przykryj podkładkę agarozową szkiełkiem nakrywkowym ze szkła mikroskopowego i przymocuj ją stopioną parafiną, aby uszczelnić ją na szkiełku podstawowym, zaczynając od czterech rogów. Umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę obiektywu.Obróć wieżyczkę kostki filtra, aby wybrać kostkę eGFP i otwórz migawkę lampy fluorescencyjnej, a następnie wyślij światło fluorescencyjne w kierunku okularu mikroskopu. Ustaw ostrość obiektywu na bakteriach za pomocą pokrętła mikroskopu. Wybierz obszar zainteresowania w próbce za pomocą joysticka, który steruje zmotoryzowanym stolikiem.Wyślij ścieżkę emisji fluorescencji z powrotem w kierunku detektora, a następnie odwróć wieżyczkę kostki filtrującej, aby wybrać sześcian dichroiczny dla lasera 930 nanometrów i ustaw moc lasera na 20 miliwatów. Ustaw rozmiar obszaru zainteresowania na 30 mikrometrów, który dostosowuje napięcie sterujące lustrami galvo i określa zakres ich ruchów. Włącz detektor i rozpocznij skanowanie próbki.Wybierz pole widzenia do obrazowania, delikatnie przesuwając stolik z interfejsu komputera. Można to zrobić podczas konfiguracji, przesuwając krzyżyk na obrazie w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, które zdefiniuje nowy środek obrazu i naciskając stolik ruchu. Dobre pole widzenia do akwizycji powinno zawierać od 10 do 30 nieruchomych bakterii, z których wszystkie są w ostrości.Jeśli jesteś zainteresowany ekstrakcją pojedynczych komórek danych FILM-FRET, upewnij się, że bakterie są dobrze zindywidualizowane. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i sprawdź, czy szybkość zliczania fotonów nie jest zbyt wysoka, aby uniknąć efektu nawarstwienia, który może wpływać na pomiary żywotności. W razie potrzeby zmniejsz intensywność lasera, aby utrzymać niską szybkość zliczania fotonów.Dostosuj parametry akwizycji, w tym czas zbierania akwizycji. Naciśnij przycisk start i poczekaj na zakończenie pobierania. Aby przeanalizować dane, otwórz program RStudio i utwórz nowy projekt.Utwórz nowy folder w głównym folderze projektu i nazwij go Data, a następnie przenieś wszystkie pliki Analysis ask do tego folderu. Otwórz nowy plik skryptu lub skrypt uzupełniający flim_analysis.r. Zainstaluj dedykowany pakiet FlimDiagRam do analizy danych filmu i wywołaj pakiet w obszarze roboczym.Przedstawiono tutaj empiryczne funkcje skumulowanego rozkładu czasów życia fluorescencji mierzonych dla różnych szczepów bakterii. Jeśli wystąpi FRET, funkcje są przesunięte w kierunku krótszych czasów życia. Ważne jest, aby pamiętać, że FRET nie może wystąpić, gdy interakcja dwóch białek powoduje dużą odległość między dwoma fluroforami, której nie można odróżnić od braku interakcji.Dlatego może być konieczne znakowanie białek w różnych pozycjach, aby zmaksymalizować szanse na zbadanie interakcji. Ze względu na dużą różnicę w ekspresji białek między PvdA i PvdL, ten sam kompleks nie daje podobnych danych FILM-FRET. Niezrównoważone stechiometrie prowadzą do różnic w udziale wolnych białek w porównaniu ze związanymi białkami znakowanymi donorem w zarejestrowanym rozkładzie czasu życia fluorescencji.Wykres diagramu może być wykorzystany do dostarczenia krytycznych informacji na temat stechiometrii. W mutancie PvdA-eGFP mCherry-PvdL ilość PvdA znakowanego przez donora jest znacznie wyższa niż ilość mCherry-PvdL. Spośród wszystkich dawców obecnych w próbce, tylko kilku z nich wchodzi w interakcję z PvdL.Pojedyncza wartość tau one wyśrodkowana na około 2,3 nanosekundy sugeruje, że każdy dawca PvdA-eGFP może przenieść się tylko z jednym akceptorem mCherry-PvdL. Gdy znakowanie jest odwrócone, oczekuje się, że większość białek eGFP-PvdL będzie wchodzić w interakcje z PvdA-mCherry, co potwierdzają wyższe wartości alfa jeden. Wartości tau one stały się bardziej rozłożone, co sugeruje, że wiele białek PvdA może wiązać się z pojedynczym białkiem PvdL.Konfiguracja FLIM staje się dostępna w coraz większej liczbie zakładów obrazowania. Obrazowanie próbek w FILM-FRET nie jest bardziej skomplikowane niż obrazowanie w mikroskopii wideo.

flim-fret-measurements-protein-protein-interactions-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Film opisuje technikę obrazowania FLIM-FRET w celu określenia interakcji białko-białko w żywych bakteriach wyrażających białka cytoplazmatyczne znakowane białkami fluorescencyjnymi, donorem eGFP i akceptorem mCherry. Połączona technika pozwala również na ilościowe określenie oddziałujących białek.

Obrazowanie FLIM-FRET w celu scharakteryzowania interakcji białko-białko u żywych bakterii

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ostatnio opracowano wiele biosensorów siły opartych na FRET, które umożliwiają specyficzne dla białek rozwiązywanie siły wewnątrzkomórkowej. W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób jeden z tych czujników, zaprojektowany dla łącznika białka kompleksu nukleoszkielet-cytoszkielet (LINC) Nesprin-2G, może być wykorzystany do pomiaru sił aktomiozyny w jądrowym kompleksie LINC.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Poznaj technikę FLIM-FRET do badania interakcji białko-białko w żywych komórkach Pseudomonas aeruginosa. Metoda umożliwia analizę interakcji przy niezrównoważonych poziomach ekspresji białek dawcy i akceptora.

Pomiary FLIM-FRET interakcji białko-białko u żywych bakterii.

Przeglądaj więcej filmów