Name: Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj protokół obrazowania posocznicy noworodkowej z wykorzystaniem bioluminescencyjnego E. coli. Metoda umożliwia śledzenie rozprzestrzeniania się bakterii w czasie rzeczywistym oraz korelację obciążenia patogenem z markerami zapalnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze instytucjonalne dla C.M.R.

<ol><li>Qazi, S. A., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+a+major+global+public+health+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: a major global public health challenge.</a> Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).</li>
<li>Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-onset+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Early-onset neonatal sepsis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).</li>
<li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+compromise+protective+immunity+in+a+mouse+model+of+Gram-negative+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis.</a> Infections and Immunity. , (2019).</li>
<li>Schrag, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Early-Onset+Neonatal+Sepsis%2C+2005+to+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014.</a> Pediatrics. 138 (6), 20162013(2016).</li>
<li>Stoll, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+onset+neonatal+sepsis%3A+the+burden+of+group+B+Streptococcal+and+E.+coli+disease+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues.</a> Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).</li>
<li>Weston, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+invasive+early-onset+neonatal+sepsis+in+the+United+States%2C+2005-2008%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+and+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008.</a> Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).</li>
<li>Hornik, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+late+onset+sepsis+in+very-low-birth-weight+infants+from+a+large+group+of+neonatal+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Human+Development%22%5BJournal%5D)">Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units.</a> Early Human Development. , Suppl 2 69(2012).</li>
<li>Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+an+international+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%3A+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: an international perspective.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).</li>
<li>Kraft, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+macrophages+express+elevated+levels+of+interleukin-27+that+oppose+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses.</a> Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).</li>
<li>Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune responses in neonates.</a> Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).</li>
<li>Gleave Parson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+myeloid-derived+suppressor+cells+are+a+source+of+elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+and+compromise+control+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection.</a> Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).</li>
<li>Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+adaptive+immunity+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neonatal adaptive immunity comes of age.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).</li>
<li>Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+L-selectin+and+CD11b+on+neutrophils+of+adults+and+neonates+during+the+first+month+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life.</a> Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).</li>
<li>Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+antigen-presenting+cell+function+in+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective antigen-presenting cell function in human neonates.</a> Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).</li>
<li>Le Garff-Tavernier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NK+cells+display+major+phenotypic+and+functional+changes+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span.</a> Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).</li>
<li>Weinberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+reduced+responsiveness+of+neonatal+neutrophils+to+distinct+chemoattractants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants.</a> Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewss+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%2C+8th+ed%22">Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).</li>
<li>Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+of+Tumor+Cell+Motility+in+the+Tumor+Microenvironment+Context%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context.</a> Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).</li>
<li>Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+new+insights+into+metastasis+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).</li>
<li>Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Imaging+Reveals+Novel+Patterns+of+Colonization+and+Invasion+in+Systemic+Escherichia+coli+K1+Experimental+Infection+in+the+Neonatal+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat.</a> Infection and Immunity. 83 (12), 4528(2015).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-alpha+inhibitor+protein+administration+improves+survival+from+neonatal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice.</a> Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).</li>
<li>Pluschke, G., Pelkonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+factors+in+the+resistance+of+newborn+mice+to+K1+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Patho%22%5BJournal%5D)">Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection.</a> Microb. Patho. , 93-102 (1988).</li>
<li>Mancuso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interleukin+12+in+experimental+neonatal+sepsis+caused+by+group+B+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci.</a> Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).</li>
<li>Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A-neutralizing+monoclonal+antibody+protects+neonatal+mice+against+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus.</a> Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).</li>
<li>Andrade, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2-induced+IL-10+production+impairs+neutrophil+recruitment+to+infected+tissues+during+neonatal+bacterial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis.</a> Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Nasz model infekcji podłopatkowej do indukowania sepsy bakteryjnej u nowonarodzonych myszy jest nowatorską metodą badania podłużnego rozprzestrzeniania się patogenów bakteryjnych w czasie rzeczywistym. Obrazowanie przyżyciowe daje możliwość zbadania rozprzestrzeniania się bakterii w czasie rzeczywistym u noworodków. Ma to kluczowe znaczenie dla zrozumienia kinetyki rozprzestrzeniania się bakterii i dalszego badania odpowiedzi i uszkodzeń gospodarza w odpowiedniej fazie choroby. Młodem mysim podaje się podskórne, podłopat...

Sepsa bakteryjna jest poważnym problemem dla noworodków, które wykazują unikalny profil immunologiczny w pierwszych dniach życia, który nie zapewnia odpowiedniej ochrony przed infekcją1. Sepsa noworodków nadal stanowi poważny problem opieki zdrowotnej w USA, odpowiadając za ponad 75 000 przypadków rocznie w samych Stanach Zjednoczonych2. Aby dogłębnie zbadać te infekcje, potrzebne są nowe modele zwierzęce, które podsumowują aspekty chorób u ludzi. Ustaliliśmy model zakażenia noworodków myszy przy użyciu E. scherichia coli, O1:K1:H73. E. coli jest drugą najczęstszą przyczyną sepsy noworodków w USA, ale odpowiada za większość zgonów związanych z sepsą4,5. Jest to jednak główna przyczyna, gdy dzieci urodzone przedwcześnie i z bardzo niską masą urodzeniową (VLBW) są rozpatrywane niezależnie5. Serotyp K1 jest najczęściej związany z inwazyjnymi infekcjami krwi i zapaleniem opon mózgowych u noworodków6,7. Obecnie nie ma innych opcji leczenia poza antybiotykami i leczeniem wspomagającym. Tymczasem wskaźniki oporności na antybiotyki nadal rosną w przypadku wielu bakterii chorobotwórczych, przy czym niektóre szczepy E. coli są odporne na wiele antybiotyków powszechnie stosowanych w leczeniu8. Dlatego konieczne jest, abyśmy nadal opracowywali metody badania mechanizmów sepsy i odpowiedzi gospodarza u noworodków. Wyniki te mogą pomóc w poprawie obecnych metod leczenia i wyników infekcji.
Stan immunologiczny noworodków charakteryzuje się zarówno fenotypowymi, jak i funkcjonalnymi różnicami w porównaniu z dorosłymi. Na przykład wykazano, że podwyższone poziomy cytokin przeciwzapalnych i regulatorowych, takich jak interleukina (IL)-10 i IL-27, są wytwarzane przez makrofagi pochodzące z krwi pępowinowej i są obecne w większych ilościach w surowicy mysich noworodków9,10,11. Jest to zgodne z niższymi poziomami IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 i TNF-α, które są często zgłaszane z komórek noworodków w porównaniu z dorosłymi odpowiednikami10. Ponadto układ odpornościowy noworodka jest przekrzywiony w kierunku odpowiedzi Th2 i regulatorowych limfocytów T w porównaniu z dorosłymi12. Podwyższona liczba neutrofili, limfocytów T, limfocytów B, komórek NK i monocytów jest również obecna u noworodków, ale ze znacznymi zaburzeniami funkcjonalnymi. Obejmuje to defekty w ekspresji markerów powierzchniowych komórek i prezentacji antygenu, które sugerują niedojrzałość13,14,15. Ponadto neutrofile noworodkowe mają znaczny niedobór zdolności do migracji do czynników chemotaktycznych16. Komórki supresorowe pochodzenia szpikowego (MDSC) są również znajdowane w podwyższonych poziomach u noworodków, a ostatnio wykazano, że są źródłem IL-2711. MDSC są wysoce supresyjne w stosunku do limfocytów T17. Łącznie dane te wskazują na ograniczenia w odporności noworodków, które zwiększają podatność na infekcje.
Aby zbadać postęp obciążenia bakteryjnego i przeanalizować ochronne reakcje immunologiczne gospodarza podczas sepsy noworodków, opracowaliśmy nowy model infekcji. Nowonarodzone myszy w 3-4 dniu życia są trudne do wstrzyknięcia w przestrzeń dootrzewnową lub żyłę ogonową. W naszym modelu szczeniętom w dniu 3 lub 4 podaje się inokulum bakteryjne lub PBS podskórnie w okolicę łopatki. Rozwija się infekcja ogólnoustrojowa i za pomocą luminescencyjnej E. coli O1:K1:H7 możemy obrazować podłużnie poszczególne nowonarodzone myszy, aby śledzić rozsiane obciążenie bakteryjne w tkankach obwodowych. Jest to pierwszy zgłoszony model wykorzystujący obrazowanie przyżyciowe w celu zrozumienia kinetyki rozprzestrzeniania się bakterii podczas sepsy u mysich noworodków3.
Tutaj opisujemy protokół wywoływania septycznych infekcji E. coli u noworodków myszy3. Opisujemy, jak przygotować inokulum bakteryjne do wstrzyknięcia i jak pobrać tkankę do oceny patologii, pomiaru markerów stanu zapalnego za pomocą analizy ekspresji genów i wyliczenia obciążenia bakteryjnego. Ponadto opisano również zastosowanie luminescencyjnej E. coli do obrazowania przyżyciowego zakażonych noworodków i ilościowego oznaczania zabijania bakterii przez noworodkowe komórki odpornościowe. Protokoły te mogą być również dostosowane do badania innych ważnych infekcji bakteryjnych u noworodków. Przedstawione tutaj dane reprezentują nowatorskie podejście do zrozumienia dynamiki zakażeń w translacyjnym modelu sepsy noworodków.

<table><tbody><tr><td>1 ml strzykawki insulinowej</td><td>Coviden</td><td>1188128012</td><td>inokulum lub wstrzyknięcie PBS</td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td>Histopatologia</td></tr><tr><td>ACK Bufor do lizy</td><td>Gibco</td><td>LSA1049201</td><td>Test klirensu bakteryjnego</td></tr><tr><td>Pasta do tatuażu zwierzęcego</td><td>Ketchum</td><td>KI1482039</td><td>Identyfikacja zwierząt</td></tr><tr><td>Tusz do tatuażu dla zwierząt Zielona pasta</td><td>Ketchum</td><td>KI1471039</td><td>Identyfikacja zwierząt</td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-Ly-6B.2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-781</td><td>Izolacja komórek</td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7-lux (wyraża lucyferazę)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zbudowany we własnym zakresie w WVU</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Zestaw do całkowitej ekstrakcji RNA HP</td><td>Omega Bio-tek</td><td>R6812</td><td>Ekstracja RNA</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Difco Tryptic Soy Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>236950</td><td>Wzrost bakterii</td></tr><tr><td>IL-1 beta Primer/sonda (Mm00434228)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Ekspresja cytokin qPCR</td></tr><tr><td>IL-6 Starter/sonda (Mm00446190)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Ekspresja cytokin qPCR</td></tr><tr><td>iQ Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708860</td><td>Ilościowy zestaw</td></tr> do syntezy cDNA PCR iScript w czasie rzeczywistym <tr><td>Bufor izolacyjny</td> do syntezy cDNA Bio-Rad 1708891 <td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Test klirensu bakteryjnego</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT i Living Image 4.5 Oprogramowanie</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>Obrazowanie przyżyciowe</td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td>Sitko do wzrostu bakterii</td></tr><tr><td>EASY (kosz nylonowy)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542 040</td><td>Sitko do komórek</td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Czytnik płytek</td></tr><tr><td>Silnik do peletów</td><td>Grainger</td><td>6HAZ6</td><td>Homogenizacja tkanek Granulat</td></tr><tr><td>polipropylenowy Tłuczki</td><td>Grainger</td><td>6HAY5</td><td>Homogenizacja tkanek</td></tr><tr><td>Prime Thermal Cycler</td><td>Techne</td><td>3PRIMEBASE/02</td><td>Synteza cDNA</td></tr><tr><td>Starter/sonda TNF-alfa (Mm00443258)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Ekspresja cytokin Triodczynnik qPCR</td></tr><tr><td>(GTCP)</td><td>Centrum Badań Molekularnych</td><td>Ekstracja RNA</td> <td>TR 118</td></tr></tbody></table>

noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej gram-ujemnej

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Noworodki są narażone na zwiększone ryzyko sepsy bakteryjnej ze względu na unikalny profil immunologiczny, który wykazują w pierwszych miesiącach życia. Opracowaliśmy protokół badania patogenezy E. coli O1:K1:H7, serotypu odpowiedzialnego za wysoką śmiertelność noworodków. Nasza metoda wykorzystuje obrazowanie przyżyciowe noworodków w różnych punktach czasowych podczas progresji infekcji. To obrazowanie, połączone z pomiarem bakterii we krwi, profilowaniem zapalnym i histopatologią tkanek, oznacza rygorystyczne podejście do zrozumienia dynamiki infekcji podczas sepsy. W bieżącym raporcie modelujemy dwa inokula zakaźne w celu porównania obciążenia bakteryjnego i ciężkości choroby. Stwierdzamy, że zakażenie podłopatkowe prowadzi do zakażenia rozsianego po 10 godzinach od zakażenia. Po 24 godzinach zakażenie luminescencyjnymi bakteriami E. coli było obfite we krwi, płucach i innych tkankach obwodowych. Ekspresja cytokin zapalnych w płucach jest znacząca po 24 godzinach, po czym następuje infiltracja komórkowa i dowody na uszkodzenie tkanek, które nasilają się wraz z dawką zakaźną. Obrazowanie przyżyciowe ma pewne ograniczenia. Obejmuje to próg sygnału luminescencyjnego i pewne komplikacje, które mogą wystąpić u noworodków podczas znieczulenia. Pomimo pewnych ograniczeń stwierdzamy, że nasz model infekcji oferuje wgląd w długotrwałą dynamikę infekcji podczas mysiej sepsy u noworodków, która do tej pory nie została dokładnie zbadana. Spodziewamy się, że model ten można również zaadaptować do badania innych krytycznych infekcji bakteryjnych we wczesnym okresie życia.

Niniejszy protokół indukuje sepsę bakteryjną u noworodków myszy; w celu zbadania przebiegu choroby zastosowano podłużne obrazowanie intravitalne, wyliczanie liczby bakterii we krwi, oceny histologiczne zmian patologicznych oraz profile ekspresji cytokin zapalnych. Objawy zachorowania obserwowano w czasie u noworodków zakażonych zarówno niską (~2 x 106 CFUs), jak i wysoką (~7 x 106 CFUs) dawką inokulum E.coli. Noworodki, które otrzymały większą dawkę inokulum, wykazywały wyraźniejsze objawy ...

Zakażenie noworodków myszy bioluminescencyjnym E. coli O1:K1:H7 powoduje infekcję septyczną ze znacznym zapaleniem płuc i patologią płuc. W tym miejscu opisano procedury modelowania i dalszego badania sepsy noworodków za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego równolegle z wyliczaniem ogólnoustrojowych obciążeń bakteryjnych, profilowaniem stanu zapalnego i histopatologią płuc.

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Nasz protokół umożliwia rozprzestrzenianie się bakterii i śledzenie obciążenia w eksperymentalnym modelu sepsy noworodków w czasie rzeczywistym, a także możliwość skorelowania innych markerów choroby z obciążeniem patogenem. Protokół ten pozwala nam na podłużną analizę sepsy u poszczególnych nowonarodzonych myszy, dając możliwość obserwacji i porównania dynamiki infekcji i rozprzestrzeniania się bakterii w czasie rzeczywistym. Za pomocą tej metody można przeprowadzić badania przedkliniczne interwencji w sepsę noworodków, co pozwala na monitorowanie efektów kontroli bakterii przez gospodarza.Zacznij od umieszczenia szczeniąt w tym samym wieku w grupach miotu o wysokiej lub niskiej dawce w gablocie na drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. W trzeciej lub czwartej dobie po urodzeniu zapisz wagę wszystkich młodych przed szczepieniem. Załadować strzykawki insulinowe z PBS lub inokulum E.coli lux o wysokiej lub niskiej dawce do komory bezpieczeństwa biologicznego i umieścić załadowane strzykawki na lodzie.Umieścić noworodka do wstrzyknięcia na czystej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego i podnieść skórę na karku, tak jakby chciał podrapać młode. Wbić igłę pod skórą w przestrzeń utworzoną między skórą a mięśniem. Gdy igła będzie wyczuwalna pod skórą, wstrzyknij 50 mikrolitrów inokulantu, jednocześnie zwalniając ściśniętą część skóry, aby zapobiec cofaniu się, a następnie wyjmij igłę powoli i ostrożnie.Gdy wszystkie młode zostaną wstrzyknięte w ten sam sposób, należy zwrócić młode do ich matek. Natychmiast po wstrzyknięciu, a następnie w odpowiednich punktach eksperymentalnych, należy umieścić klatkę z nowonarodzonymi myszami zakażonymi E. coli lux i zaporą w kapturze z przepływem laminarnym drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego i otworzyć oprogramowanie w mikrokomputerze CT. Po zainicjowaniu systemu i odczekaniu, aż temperatura stage zatrzyma się na poziomie 37 stopni Celsjusza, a temperatura CCD zablokuje się na minus 90 stopniach Celsjusza, umieść do czterech znieczulonych szczeniąt na pudełku do obrazowania w komorze obrazowania w pozycji leżącej.Zamknij drzwiczki komory obrazowania i wybierz opcję obrazowania luminescencyjnego. Wybierz otwarty filtr, a następnie ustaw filtr wzbudzenia na zablokowany, a filtr emisji na otwarty. Wybierz 500, 520, 560, 580, 600 i 620 nanometrów.Następnie zobrazuj młode przed powrotem do klatki z matką z monitorowaniem do czasu powrotu do znieczulenia. W odpowiednim punkcie końcowym doświadczalnym, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, należy oblać uśpionego noworodka 70% etanolem, aby zapobiec skażeniu i położyć zwierzę na prawym boku. Użyj kleszczy, aby chwycić skórę między brzuchem a tylną lewą nogą i użyj nożyczek chirurgicznych z cienką końcówką, aby wykonać nacięcie skóry.Następnie kontynuuj nacinanie w kierunku grzbietu zwierzęcia, aż cała śledziona zostanie odsłonięta. Za pomocą kleszczy i nożyczek usuń śledzionę z jamy brzusznej i umieść ją w roztworze odpowiednim do jej dalszego zastosowania. Aby uzyskać płuca, całkowicie oderwij skórę klatki piersiowej i wchodząc u podstawy mostka nożyczkami trzymanymi pionowo, przeciąć w górę, aż klatka piersiowa zostanie rozcięta.Użyj kleszczy, aby chwycić indywidualnie prawe i lewe płuco i usunąć płuca z klatki piersiowej. Usuń serce z tkanki płucnej nożyczkami. Następnie umieść płuco w roztworze odpowiednim do jego dalszego zastosowania.Aby przeprowadzić test zabijania bakterii in vitro, umieść niezakażoną śledzionę w nylonowym sitku o średnicy 40 mikrometrów na sterylnej 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów PBS uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i użyj sterylnego tłoka strzykawki o pojemności trzech mililitrów, aby zdezagregować tkankę na zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i zbierz je przez odwirowanie. Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek na trzy do czterech śledzion.Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umyj śledziony w PBS i ponownie zawieś osad w 250 mikrolitrach PBS uzupełnionym albuminą surowicy bydlęcej i dwoma milimolowymi EDTA do liczenia. Następnie wyizoluj komórki Ly6 B2 dodatnie za pomocą odpowiednich kulek immunomagnetycznych zgodnie z protokołem producenta i wysiewaj wzbogacone komórki Ly6 B2 dodatnie w ilości od 10 do pięciu komórek na 100 mikrolitrów pełnej pożywki o gęstości studzienki na czarnej lub białej płytce 96-dołkowej. Przygotować inokulum bakteryjne przy pożądanej wielokrotności infekcji w końcowej objętości 100 mikrolitrów na studzienkę i dodać 100 mikrolitrów samego inokulum bakteryjnego lub pożywki do każdej studzienki na jednogodzinną inkubację w inkubatorze hodowli komórkowych.Pod koniec inkubacji zastąpić pożywkę 200 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki uzupełnionej 100 mikrogramami na mililitr gentamycyny w celu usunięcia wszelkich pozostałych bakterii zewnątrzkomórkowych i zwrócenia komórek do inkubatora hodowli komórkowej na dodatkowe dwie godziny. Na końcu inkubacji i w każdym kolejnym eksperymentalnym punkcie czasowym należy użyć czytnika płytek do pomiaru luminescencji w każdym dołku płytki hodowlanej z pokrywką przed powrotem płytki do inkubatora do hodowli komórkowych do następnego odczytu. Podczas gdy większość zwierząt wykazuje wysoki poziom bakterii we krwi po 24 godzinach od zakażenia, niektóre szczenięta mają niski lub niewykrywalny poziom bakterii we krwi, co sugeruje usunięcie infekcji do tego momentu.Ponadto noworodkowe komórki śledziony Ly6 B2-dodatnie zakażone bioluminescencyjnym E. coli przez godzinę przed usunięciem bakterii zewnątrzkomórkowych i późniejszym leczeniem gentamycyną wykazywały wysoki poziom luminescencji po trzech godzinach, który zmniejsza się z czasem, co wskazuje na klirens bakteryjny. Obrazowanie na żywych zwierzętach bakterii luminescencyjnych dodatkowo potwierdza wzrost rozprzestrzeniania się i wzrostu bakterii u nowonarodzonych szczeniąt w czasie po 10 i 24 godzinach od zakażenia. Obrazowanie przyżyciowe w połączeniu z mikrotomografią komputerową ułatwia identyfikację ognisk infekcji w mózgu, płucach i innych tkankach obwodowych.Płuca niektórych silnie zakażonych myszy wykazują nieprzezroczyste regiony zgodne z konsolidacją zapalną, które lokalizują się w luminescencyjnych sygnałach bakteryjnych. Te obszary przypuszczalnego wysięku zapalnego nie są obserwowane w niezakażonych płucach kontrolnych. Znaczny wzrost ekspresji cytokin zapalnych w stosunku do grupy kontrolnej obserwuje się również zarówno w niskich, jak i wysokich grupach inokulum, co koreluje z wyraźnym pogrubieniem ściany pęcherzyków płucnych, zwiększonym krwotokiem pęcherzykowym i naciekiem zapalnym u tych zwierząt.Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to przestrzeganie właściwej techniki podczas wykonywania iniekcji oraz zwracanie szczególnej uwagi na noworodki podczas podawania znieczulenia. Korzystając z tej techniki, możemy wizualizować sepsę noworodków w czasie rzeczywistym, aby badać interwencje i terapie ukierunkowane na gospodarza mające na celu poprawę odpowiedzi immunologicznej.

a-neonatal-imaging-model-of-gram-negative-bacterial-sepsis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Seman, B. G., et.al. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje izolację neutrofilów i zapalnych monocytów z noworodkowych śledzion myszy oraz ich zastosowanie w luminescencyjnym teście zabijającym bakterie. Obejmuje mechaniczną dysocjację, lizę czerwonych krwinek, wzbogacanie komórek oparte na kulkach magnetycznych, inkubację bakterii oraz ochronę antybiotykową. Pomiary luminescencji czasowej wskazują na początkową internalizację...

Ocena in vitro zabijania bakterii przez fagocyty śledziony noworodków myszy

Źródło: Seman, B. G. i in. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Film prezentuje model noworodkowej myszy do badania infekcji ogólnoustrojowej z użyciem zamkniętych bakterii bioluminescencyjnych. Noworodki są wstrzykiwane wysokodawkowymi lub niskodawkowymi zawiesinami bakteryjnymi i zwracane matce na opiekę poporodową. Otoczone bakterie unikają wczesnego wykrywania odpornościowego, rozprzestrzeniają się systemowo i są wizualizowane w czasie za pomocą...

Modelowanie infekcji u noworodkowych myszy z użyciem kapsulowanych bioluminescencyjnych bakterii

Tutaj opisana jest procedura przeprowadzania infekcji ogólnoustrojowej u noworodka szczura za pomocą kultur Escherichia coli K1. Ten nieinwazyjny zabieg pozwala na kolonizację przewodu pokarmowego, translokację patogenu do krążenia ogólnoustrojowego oraz inwazję ośrodkowego układu nerwowego w splocie naczyniówkowym.

Nieinwazyjny model neuropatogennego zakażenia Escherichia coli u nowonarodzonego szczura

encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna po uduszeniu okołoporodowym może być badana na modelach zwierzęcych. Przedstawiono procedury niezbędne do ustalenia modelu encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków u prosiąt.

Model prosięcia encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków

Encefalopatia wcześniaków obejmuje nieprawidłowości ośrodkowego układu nerwowego związane z uszkodzeniem spowodowanym przedwczesnym porodem. W niniejszym raporcie opisano klinicznie istotny szczurzy model przejściowego ogólnoustrojowego niedotlenienia i niedokrwienia w macicy oraz podawania lipopolisacharydów owodniowych (LPS), który naśladuje zapalenie błon płodowych i związanego z tym wpływu bodźców zakaźnych i niedostatecznej perfuzji łożyska na rozwój OUN.

Modelowanie encefalopatii wcześniaków za pomocą prenatalnej hipoksji-niedokrwienia lipopolisacharydem wewnątrzowodniowym u szczurów

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.

Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych

Poznaj protokół obrazowania posocznicy noworodkowej z wykorzystaniem bioluminescencyjnego E. coli. Metoda umożliwia śledzenie rozprzestrzeniania się bakterii w czasie rzeczywistym oraz korelację obciążenia patogenem z markerami zapalnymi.

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

Przeglądaj więcej filmów