Name: Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj izolację adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej metodą FACS lub separacją immunomagnetyczną. Ta technika umożliwia badanie unikalnych typów komórkowych w tkance tłuszczowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Lisie Hansen i Kirsten Vestergaard za doskonałą pomoc techniczną, a P. Schererowi, N. Joffinowi i C. Crewe za krytyczną lekturę rękopisu. Autorzy dziękują UTSW Flow Cytometry Core za doskonałe wskazówki i pomoc w opracowaniu opisanych tutaj protokołów. R.K.G. jest obsługiwany przez NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 i NIDDK R01 DK119163. J.P. jest sponsorowany przez Innovation Fund Denmark.

Wszystkie protokoły i procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Instytucjonalnego Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Teksańskiego Southwestern Medical Center.
1. Izolacja zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z gonadalnej białej tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Wypreparuj gonadalną białą tkankę tłuszczową od 6-8 tygodniowych myszy i umieść poduszeczki tłuszczowe w 1x roztworze PBS.</li>
	<li>Połącz do 4 magazynów tłuszczu (zalecane 2-4 magazyny od 1-2 myszy) i zmiel tkankę w zlewce o pojemności 10 ml zawierającej 200 μl buforu wytrawiającego (1x HBSS, 1,5% BSA i 1 mg/ml kolagenazy D).</li>
	<li>Przenieść zmieloną tkankę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml buforu do wytrawiania.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 1 godzinę, wstrząsając.</li>
	<li>Przefiltruj strawioną tkankę przez sitko o wielkości 100 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę.</li>
	<li>Rozcieńczyć przefiltrowaną próbkę do objętości 30 ml PBS zawierającym 2% FBS i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, który zawiera dojrzałe adipocyty.</li>
	<li>Natychmiast przejdź do preferowanej metody izolacji komórek.</li>
</ol>
2. Izolacja APC i FIPs za pomocą FACS
<ol>
	<li>Rozpuść osad w 1 ml 1x buforu do lizy RBC, delikatnie potrząsając probówką.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty.</li>
	<li>Dodać 10 ml 2% FBS/PBS i przepuścić przez sitko o wielkości 40 μm do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 400-800 μl 2% bloku FBS/PBS zawierającego Fc (1:200).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieś 400 μl-800 μl zawiesin komórkowych zawierających ≤106 komórek na ml do probówek o pojemności 1,5 ml i dodaj przeciwciała. Stężenia przeciwciał są wymienione w sekcji Tabela materiałów.
	<ol>
		<li>Przygotuj oddzielne probówki kontrolne dla 1) niebarwionych komórek, 2) kontroli pojedynczego koloru i 3) kontroli FMO (fluorescencja minus jeden).</li>
		<li>Wybarwić próbki przeciwciałami PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zassać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 400 μl 2% FBS/PBS.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 400-800 μl 2% FBS/PBS. Następnie przepuścić przez nasadki filtrujące 40 μm do probówek okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml do FACS.</li>
	<li>Wykonaj następujące kroki, aby uzyskać bramkowanie.
	<ol>
		<li>Użyj niebarwionych i jednokolorowych elementów sterujących do kompensacji.</li>
		<li>Użyj kontrolek FMO, aby ustawić bramki eksperymentalne.</li>
		<li>Użyj strategii bramkowania pokazanej w Rysunek 1, aby uzyskać APC i FIPs. Bramka APC jako komórki CD45-CD31-PDGFRβ+, LY6C-CD9- i FIPs jako komórki CD45-CD31-PDGFRβ+ LY6C+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz posortowane komórki do probówek zawierających 500 μl 100% surowicy i utrzymuj komórki na lodzie.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 2% FBS/PBS w celu przepłukania komórek przez ponowne odwirowanie przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i użyć granulowanych komórek.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w odpowiedniej objętości pożywki hodowlanej APC (do hodowli komórkowej) lub w odpowiednim buforze do późniejszej analizy.</li>
</ol>
3. Immunomagnetyczna separacja frakcji adipogennych i nieadipogennych
<ol>
	<li>Wyizolować SVF z białej tkanki tłuszczowej gonad zgodnie z krokami 1.1-1.7.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad SVF w 10 ml 1x dostępnego w handlu buforu MS.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 μm.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 100 μl 1x MS Buffer.</li>
	<li>Wykonaj zubożenie komórek CD31 + i CD45 +, jak omówiono poniżej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, Krok 1). Odbywa się to w celu usunięcia komórek rodowych śródbłonka i hematopoetycznych.
	<ol>
		<li>Policz komórki za pomocą licznika komórek i dostosuj stężenie do ≤ 1 x 108 komórek/ml.</li>
		<li>Dodać przeciwciała CD31 i CD45 sprzężone z biotyną do zawiesiny komórkowej, każde w stężeniu ≤ 0,25 μg na 10-6 komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Umyj komórki, dodając 4 ml 1x buforu MS.</li>
		<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 100 μl 1x buforu MS.</li>
		<li>Dodać 10 μl nanogranulek streptawidyny i inkubować komórki na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Umyj komórki, dodając 4 ml 1x buforu MS.</li>
		<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odessać supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki w 2,5 ml 1x buforu MS i przenieś do probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Umieść rurkę w stojaku na magnesy na 5 minut.</li>
		<li>Zebrać nieoznakowane komórki, przelewając zawiesinę komórek do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Unikaj potrząsania lub ocierania wiszących kropel, ponieważ prowadzi to do zanieczyszczenia niepożądaną frakcją komórek.</li>
		<li>Wyjmij rurkę z magnesu i powtórz kroki od 3.6.9. do 3.6.11. jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozdzielanie frakcji adipogennych i nieadipogennych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, Krok 2)
	<ol>
		<li>Kontynuuj pracę z frakcją nieoznakowaną (tj. frakcją CD45- CD31-).</li>
		<li>Odwirować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą nieznakowane komórki o sile 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl 1x bufor MS.</li>
		<li>Dodać odpowiednio przeciwciała LY6C i CD9 sprzężone z biotyną w stężeniu ≤ 0,25 μg na10-6 komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Wykonaj kroki od 3.6.3 do 3.6.12, aby zakończyć drugą separację.</li>
		<li>Zbieraj niezwiązane frakcje. Nieznakowane komórki (LY6C-CD9-) reprezentują frakcję adipogenną zawierającą APC (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, Krok 3).</li>
		<li>Wyjmij probówkę z magnesu, ponownie zawieś i eluuj związane komórki w 1x buforze MS. Eluaty lub frakcja znakowana (LY6C+ CD9+), reprezentuje frakcję nieadipogenną zawierającą FIPy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A, Krok 3).</li>
		<li>Odwirować znakowane i nieznakowane frakcje w ilości 600 x g przez 5 minut w celu osadzania komórek w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast przejść do hodowli komórkowej (etap 6) lub użyć niezróżnicowanych prekursorów do preferowanych analiz (etap 4 i/lub etap 5).</li>
</ol>
4. Oceń czystość frakcji adipogennych i nieadipogennych za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zawiesić frakcje komórkowe izolowane kulkami w 200-400 μl 2% bloku FBS/PBS zawierającego Fc (1:200).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 1,5 ml i dodaj przeciwciała. Stężenia przeciwciał są wymienione w Tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Przygotuj oddzielne probówki kontrolne dla 1) niebarwionych komórek, 2) kontroli pojedynczego koloru i 3) kontroli FMO.</li>
		<li>Do próbek dodać przeciwciała CD45, CD31, CD9 i LY6C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 400 μl 2% FBS/PBS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 400-800 μl 2% FBS/PBS. Przefiltrować przez nasadki filtrujące 40 μm do probówek okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml w celu analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej w celu oceny czystości
	<ol>
		<li>Użyj niebarwionych i jednokolorowych elementów sterujących do kompensacji.</li>
		<li>Użyj kontrolek FMO, aby ustawić bramki eksperymentalne.</li>
		<li>Użyj strategii bramkowania dla żywych i pojedynczych komórek, jak pokazano w Rysunek 2B.</li>
		<li>Wykonaj bramkowanie, jak pokazano na Rysunek 2B dla CD45, CD31, LY6C i CD9.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do cytometrii przepływowej, aby ocenić częstości komórek CD45-CD31-LY6C-CD9 (APC) i komórek CD45-CD31-LY6C+ (FIP) w izolowanych frakcjach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR do oceny czystości FIP i APC
<ol>
	<li>Ekstrahuj mRNA z komórek izolowanych magnetycznie lub FACS za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Użyj 1 μg RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu odwrotnej transkryptazy cDNA (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Określ względne poziomy mRNA genów selektywnych APC i FIPs (Tabela 1) za pomocą ilościowego PCR przy użyciu zielonej mieszanki głównej SYBR PCR.
	<ol>
		<li>Ustaw reakcję próbki do PCR w następujący sposób: 5 μL 2x zielonego barwnika SYBR, 1 μL cDNA (~50 ng / μL), 0,5 μL każdego startera do przodu i do tyłu (10 μM) i 3 μL wody.</li>
		<li>Do ilościowego przebiegu PCR należy zastosować następujące standardowe warunki PCR: etap wstrzymania: 50 °C przez 2 min, 95 °C przez 10 min; Etap PCR (40 cykli): 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizuj wartości do poziomów genów utrzymania domu (Rps18), obliczając ΔΔ-Ct.</li>
	<li>Aby ocenić istotność statystyczną, wykonaj niesparowany test t-Studenta.</li>
</ol>
6. Hodowla komórkowa i różnicowanie
<ol>
	<li>Odwirować komórki izolowane magnetycznie lub FACS przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 500 μl gonad APC i umieścić 40 tys. komórek/basenik z każdej frakcji na 48-dołkowej płytce hodowlanej.</li>
	<li>Wymieniaj nośniki co 1-2 dni. APC zaczną różnicować się w adipocyty, gdy zbliżą się do konfluencji. FIPy utrzymywane w tym samym podłożu są oporne na uleganie adipogenezie.</li>
</ol>

<ol><li>Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+in+inflammation+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adipokines in inflammation and metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).</li>
<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Eto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+structure+and+cellular+components+of+aspirated+and+excised+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).</li>
<li>Hirsch, J., Batchelor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+cellularity+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue cellularity in human obesity.</a> Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).</li>
<li>Ghaben, A. L., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and metabolic health.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).</li>
<li>Hepler, C., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+problem+of+adipose+depot+remodeling+and+postnatal+adipocyte+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment.</a> Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+and%2For+Hyperplasia%3A+Dynamics+of+Adipose+Tissue+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth.</a> PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324(2009).</li>
<li>Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+remodeling+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue remodeling and obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).</li>
<li>Kloting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Tissue+Remodeling%3A+Its+Role+in+Energy+Metabolism+and+Metabolic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30(2016).</li>
<li>Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+adipocyte+precursors+and+their+role+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease.</a> Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> Elife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364 (6438), 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).</li>
<li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Dissection+of+Diverse+Mouse+Adipose+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+white+adipose+hyperplastic+potential+is+associated+with+enhanced+susceptibility+to+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).</li>
<li>Vishvanath, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfrbeta%2B+Mural+Preadipocytes+Contribute+to+Adipocyte+Hyperplasia+Induced+by+High-Fat-Diet+Feeding+and+Prolonged+Cold+Exposure+in+Adult+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).</li>
<li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development%2C+expansion+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li>
<li>Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRalpha%2FPDGFRbeta+signaling+balance+modulates+progenitor+cell+differentiation+into+white+and+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes.</a> Development. 145 (1), 155861(2018).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Buffolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Paracrine+Signaling+Mechanism+Linking+CD34%28high%29+Progenitors+to+the+Regulation+of+Visceral+Fat+Expansion+and+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling.</a> Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+adipocyte+differentiation+from+Pdgfrbeta%28%2B%29+preadipocytes+protects+against+pathologic+visceral+adipose+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity.</a> Nature Communications. 9 (1), 890(2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6+family+proteins+in+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Ly6 family proteins in neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).</li>
<li>Vijay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+human+adipose+tissue+identifies+depot+and+disease+specific+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types.</a> Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).</li>
</ol>

T.A.P. jest pracownikiem i udziałowcem Novo Nordisk A/S

Szczep myszy C57BL/6 jest najczęściej używanym szczepem myszy w badaniach nad otyłością wywołaną dietą. Myszy C57BL/6 szybko przybierają na wadze, gdy są umieszczane na diecie wysokotłuszczowej (HFD) i rozwijają niektóre z ważnych cech zespołu metabolicznego związanego z otyłością (np. insulinooporność i hiperlipidemia). Warto zauważyć, że ekspansja WAT występująca w związku z karmieniem dietą wysokotłuszczową (HFD) zachodzi w sposób specyficzny dla magazynu 19,20,21,22,23.<sup class="x...

Biała tkanka tłuszczowa (WAT) stanowi główne miejsce magazynowania energii u ssaków. W tej tkance adipocyty, czyli "komórki tłuszczowe", przechowują nadmiar kalorii w postaci trójglicerydów, upakowanych w duże jednopunktowe kropelki lipidów. Co więcej, adipocyty wydzielają wiele czynników, które regulują różne aspekty homeostazy energetycznej1,2,3. Adipocyty stanowią większość objętości WAT; jednak adipocyty stanowią tylko mniej niż 50% wszystkich komórek znalezionych w WAT4,5. Przedział nieadipocytowy WAT, czyli frakcji zrębu-naczyniowej (SVF), jest dość niejednorodny i zawiera komórki śródbłonka naczyniowego, komórki odpornościowe rezydujące w tkankach, fibroblasty i populacje komórek prekursorowych adipocytów (APC).
WAT jest wyjątkowy w swojej niezwykłej zdolności do zwiększania rozmiaru wraz ze wzrostem zapotrzebowania na magazynowanie energii. Utrzymanie tej plastyczności tkanek jest niezbędne, ponieważ odpowiednie magazynowanie lipidów w WAT chroni przed szkodliwym ektopowym odkładaniem się lipidów do tkanek nietłuszczowych6. Sposób, w jaki poszczególne magazyny WAT przechodzą tę ekspansję w odpowiedzi na nadmiar kalorii, jest krytycznym wyznacznikiem wrażliwości na insulinę w warunkach otyłości7. Patologiczna ekspansja WAT, obserwowana u osób otyłych z zespołem metabolicznym, charakteryzuje się preferencyjną ekspansją trzewnych magazynów WAT kosztem korzystnej metabolicznie podskórnej tkanki tłuszczowej. Co więcej, insulinooporność w otyłości wiąże się z patologicznym przebudową WAT. Charakteryzuje się to przerostowym wzrostem istniejących adipocytów (wzrost rozmiaru), nieodpowiednią angiogenezą, przewlekłym zapaleniem metabolicznym, akumulacją składników macierzy zewnątrzkomórkowej (zwłóknienie) i niedotlenieniem tkanek8,9. Te fenotypy otyłości WAT są związane ze stłuszczeniem wątroby i insulinoopornością, podobnie jak w przypadku lipodystrofii (brak funkcjonalnego WAT). W przeciwieństwie do tego, zdrowa ekspansja WAT jest obserwowana w metabolicznie zdrowej populacji otyłych i charakteryzuje się preferencyjnym rozszerzeniem ochronnego podskórnego WAT i ekspansją depot poprzez hiperplazję adipocytów10. W rekrutacji nowych adipocytów pośredniczy różnicowanie adipocytów de novo z komórek prekursorowych adipocytów (APC) (określane jako "adipogeneza"). Przerost adipocytów zbiega się ze stosunkowo niższymi stopniami zwłóknienia WAT i metabolicznego stanu zapalnego6,11. Mnogość typów komórek w mikrośrodowisku WAT bezpośrednio wpływa na zdrowie i zdolność do rozszerzania się WAT w otyłości12. W związku z tym zdefiniowanie funkcji różnych typów komórek obecnych w WAT pozostaje wysokim priorytetem dla tej dziedziny.
W ciągu ostatniej dekady zastosowano kilka strategii do definiowania i izolowania natywnych APC od ludzkich i mysich WAT SVF13. Takie strategie izolują APC w oparciu o ekspresję na powierzchni komórki powszechnych mezenchymalnych markerów komórek macierzystych/progenitorowych przy użyciu technik separacji komórek opartych na przeciwciałach. Podejścia te obejmują sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), przy użyciu przeciwciał znakowanych fluoroforem lub immunomagnetyczną separację kulek (tj. Przeciwciała modyfikowane chemicznie). Białka powierzchniowe komórek przeznaczone do izolacji APC obejmują PDGFRα, PDGFRβ, CD34 i SCA-1. Podejścia te przyczyniły się do wzbogacenia oferty transporterów opancerzonych. Jednak populacje komórek wyizolowane na podstawie tych markerów są dość niejednorodne. Niedawne badania sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) podkreśliły molekularną i funkcjonalną heterogeniczność komórek zrębu w izolowanej frakcji zrębu naczyniowej (SVF) mysiego WAT14,15,16,17. Na podstawie naszych własnych analiz sekwencyjnych scRNA i funkcjonalnych zidentyfikowaliśmy i scharakteryzowaliśmy funkcjonalnie odrębne subpopulacje komórek okołonaczyniowych PDGFRβ + modulujące immunologicznie i adipogenne w przedziale zrębowym wewnątrzbrzusznego WAT u dorosłych myszy15. Prekursory włóknisto-zapalne lub FIP reprezentują znaczącą subpopulację komórek PDGFRβ + i mogą być izolowane na podstawie ekspresji LY6C (komórki LY6C + PDGFRβ +) 15. FIPy nie mają zdolności adipogennych, wywierają silną odpowiedź prozapalną na różne bodźce, produkują kolagen i wydzielają czynniki antyadipogenne15. Prozapalna i fibrogenna aktywność tych komórek wzrasta w związku z otyłością u myszy, co sugeruje, że komórki te są regulatorami przebudowy WAT. Subpopulacja LY6C-CD9-PDGFRβ+ reprezentuje komórki prekursorowe adipocytów (APC). Te APC są wzbogacone w ekspresję Pparg i innych genów pro-adipogennych i łatwo różnicują się w dojrzałe adipocyty in vitro i in vivo15. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji tych odrębnych populacji komórek z wewnątrzbrzusznych magazynów WAT dorosłych myszy przy użyciu FACS oraz separacji kulek immunomagnetycznych za pomocą przeciwciał biotynylowanych. Protokół ten może być wykorzystany do wyizolowania funkcjonalnie odrębnych subpopulacji progenitorów tkanki tłuszczowej z wielu wewnątrzbrzusznych magazynów WAT dorosłych samców i samic myszy15. Badanie tych funkcjonalnie odrębnych populacji komórek w izolacji może znacznie przyczynić się do naszego obecnego zrozumienia mechanizmów molekularnych, które regulują adipogenezę i przebudowę tkanki tłuszczowej w jamie brzusznej w zdrowiu i chorobie.
Poniższy protokół szczegółowo opisuje izolację komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z mysiego najądrza WAT; jednak ta sama procedura może być użyta do wyizolowania odpowiednich komórek z krezkowych i zaotrzewnowych magazynów WAT zarówno samców, jak i samic myszy15. Szczegółowy protokół identyfikacji i izolowania tych magazynów u myszy można znaleźć w Bagchi et al.18. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem myszy w wieku 6-8 tygodni. Częstość występowania i zdolność różnicowania APC może ulec zmniejszeniu wraz ze starzeniem się.

<table><tbody><tr><td>Mechaniczne przygotowanie tkanek i izolacja SVF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 i 100 &micro; m sitka komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>5ml probówki polipropylenowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do wytrawiania (na 10mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg Kolagenaza D (1 mg/ml końcowej cmc.)</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0,15 g BSA (1,5 % końcowej masy tłuszczowej)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunomagnetyczna separacja APC i nie-APC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X MojoSort Buffer (MS buffer)</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml MojoSort Magnet (magnes MS)</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L MojoSort Nanokulki Streptawidyny</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purity Check i FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Blok Fc (mysz CD16/CD32)</td><td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotyna CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>Stężenie: &le; 0,25 &mikro; g na 10^6 komórek Gatunek: Mysz Klon: 30-F11</td></tr><tr><td>Biotyna CD31</td><td>BioLegend</td><td>102503</td><td>Stężenie: &le; 0,25 &mikro; g na 10^6 komórek Gatunek: Mysz Klon: MEC13.3</td></tr><tr><td>Biotyna CD9</td><td>BioLegend</td><td>124803</td><td>Stężenie: &le; 0,25 &mikro; g na 10^6 komórek Gatunek: Mysz Klon: MZ3</td></tr><tr><td>Biotyna LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128003</td><td>Stężenie: &le; 0,25 &mikro; g na 10^6 komórek Gatunek: Mysz Klon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>102419</td><td>Stężenie: Rozcieńczenie 1:400 Gatunek: Mysz Klon: 390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>Stężenie: Rozcieńczenie 1:400 Gatunek: Mysz Klon: 30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>Stężenie: Rozcieńczenie 1:50 Gatunek: Mysz Klon: APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>Stężenie: Rozcieńczenie 1:400 Gatunki: Mysz Klon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend</td><td>124808</td><td>Stężenie: Rozcieńczenie 1:400 Gatunki: Mysz Klon: MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Hodowla i Różnicowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gonad APC Pożywka hodowlana (na 500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL DMEM z 1 g/l glukozy</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Płodowa surowica bydlęca (FBS)** lot#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 100% premiks ITS</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 10 mM Kwas L-askorbinowy-2-2fosforan</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 &mikro; L 100 g/ml FGF-basic</td><td>R& Systemy D</td><td>3139-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 &micro; L Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>**UWAGA: Zdolność adipogenna pierwotnych APC może się różnić w zależności od partii komercyjnego FBS. Należy przetestować wiele partii/źródeł FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Frakcja zrębowo-naczyniowa (SVF) białej tkanki tłuszczowej (WAT) jest niezwykle niejednorodna i składa się z wielu typów komórek, które funkcjonalnie przyczyniają się do ekspansji i przebudowy WAT w wieku dorosłym. Ogromną przeszkodą w badaniu implikacji tej heterogeniczności komórkowej jest niemożność łatwego wyizolowania funkcjonalnie odrębnych subpopulacji komórek z WAT SVF do analiz in vitro i in vivo. Technologia sekwencjonowania pojedynczych komórek zidentyfikowała niedawno funkcjonalnie odrębne włóknisto-zapalne i adipogenne subpopulacje komórek okołonaczyniowych PDGFRβ+ w wewnątrzbrzusznych magazynach WAT dorosłych myszy. Drobnoustrojowe komórki progenitorowe (określane jako "FIP") to nieadipogenne komórki produkujące kolagen, które mogą wywierać fenotyp prozapalny. Komórki prekursorowe adipocytów PDGFRβ+ (APC) są wysoce adipogenne zarówno in vitro, jak i in vivo po przeszczepieniu komórek. W tym miejscu opisujemy wiele metod izolacji tych subpopulacji komórek zrębu z mysich magazynów WAT w jamie brzusznej. FIP i APC można izolować za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) lub wykorzystując technologię immunomagnetycznych kulek opartych na biotynylowanych przeciwciałach. Wyizolowane komórki można wykorzystać do analizy molekularnej i funkcjonalnej. Badanie właściwości funkcjonalnych subpopulacji komórek zrębu w izolacji poszerzy naszą obecną wiedzę na temat przebudowy tkanki tłuszczowej w warunkach fizjologicznych lub patologicznych na poziomie komórkowym.

Niniejszy protokół opisuje dwie strategie umożliwiające izolację odrębnych populacji komórek zrębowych z wewnątrzbrzusznych depotów WAT u dorosłych myszy. APC oraz FIP można izolować za pomocą FACS (Rycina 1) lub separację za pomocą kulek immunomagnetycznych z przeciwciałami biotynylowanymi (Rycina 2). Obie metody wykorzystują odczynniki i przeciwciała dostępne w sprzedaży. Separacja za pomocą kulek immunomagnetycznych prowadzi do oddzielenia komórek adipogennyc...

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Protokół pozwala badaczom wyizolować funkcjonalnie i molekularnie odrębne subpopulacje komórek zrębu białej tkanki tłuszczowej perigonad z interesujących nas modeli mysich. Zaletą tej techniki jest to, że wszystkie narzędzia i odczynniki są powszechnie dostępne. Procedurę zademonstruje Lavanya Vishvanath, starszy analityk laboratoryjny z laboratorium dr Rana Gupta.Po izolacji komórek naczyniowych zrębu z gonadalnej białej tkanki tłuszczowej lub WAT, ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek na jedną do dwóch minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Przerwij lizę za pomocą 10 mililitrów 2% FBS i PBS i przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 400 do 800 mikrolitrach FBS i PBS, uzupełnionych blokiem FC.Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przenieść od 400 do 800 mikrolitrów komórek do odpowiedniej liczby probówek do barwienia przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją i znakować komórki badanymi przeciwciałami kontrolnymi i doświadczalnymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, chroniąc je przed światłem. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie i myć komórki w 400 mikrolitrach świeżych FBS i PBS na probówkę. Po umyciu ponownie zawieś granulki w 400 do 800 mikrolitrach świeżych FBS i PBS na probówkę i przefiltruj komórki przez 40-mikronowe nasadki filtracyjne do pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem z polistyrenu do FACS.Ustaw kompensację i bramki eksperymentalne, aby uzyskać komórki prezentujące antygen i włóknisto-zapalne komórki progenitorowe. Po posortowaniu komórek zbierz i umyj komórki przez odwirowanie, a następnie ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach pożywki do hodowli komórek prezentujących antygen gonadalny na frakcję. W celu oddzielenia kulek immunomagnetycznych adipogennych i nieadipogennych frakcji komórek, ponownie zawieś osad naczyniowy zrębu w 10 mililitrach buforu MS i przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów.Po zliczeniu zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w stężeniu nie większym niż jeden razy 10 do ósmych komórek na mililitr stężenia buforu MS. Następnie dodaj nie więcej niż 0,25 grama przeciwciała sprzężonego z biotyną anty-CD31 i anty-CD45 na jeden raz dziesięć razy dziesięć do sześciu komórek na 15-minutową inkubację na lodzie. Pod koniec inkubacji umyć komórki w czterech mililitrach buforu MS przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach świeżego buforu MS.Dodaj 10 mikrolitrów nanogranulek streptawidyny do komórek na 15-minutową inkubację na lodzie, a następnie ponownie przemyj czterema mililitrami buforu MS. Ponownie zawiesić osad w 2,5 mililitra świeżego buforu MS i przenieść komórki do pięciomililitrowej probówki polipropylenowej. Umieść probówkę na magnesie na pięć minut, a następnie zdekantuj nieoznakowane komórki do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Powtórz płukanie jeszcze dwa razy, jak pokazano, wyciągając nieoznakowane komórki po każdym przemyciu i zbierz komórki zubożone w śródbłonek i krwiotwórcze komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu MS i oznaczyć komórki nie więcej niż 0,25 mikrograma przeciwciał Ly6C i CD-9 na 10 razy 10 szóstych komórek przez 15 minut na lodzie. Pod koniec inkubacji zebrać niezwiązane komórki adipogenne Ly6C ujemne CD-9, jak właśnie wykazano, przed zebraniem komórek nieadipogennych Ly6C dodatnich.Następnie zbierz obie populacje komórek przez odwirowanie i ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach pożywki do hodowli komórek prezentujących antygen gonadalny na frakcję. Aby przygotować hodowle komórkowe do różnicowania, należy rozszczepić każdą frakcję w stężeniu cztery razy 10 czwartych komórek na studzienkę w indywidualnych studzienkach 48-dołkowej płytki hodowlanej i umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na siedem do 10 dni. Komórki prekursorowe adipocytów zaczną różnicować się w adipocyty w miarę zbliżania się do konfluencji, podczas gdy komórki progenitorowe fibroiny będą odporne na adipogenezę.Korzystając z tego protokołu, odrębne populacje komórek zrębu można wyizolować z wewnątrzbrzusznych magazynów WAT dorosłych myszy za pomocą FACS lub separacji kulek immunomagnetycznych, jak pokazano. Dzięki immunomagnetycznej separacji kulek można wyizolować komórki adipogenne i nieadipogenne z frakcji zrębu naczyniowego gonad WAT. Jak zaobserwowano za pomocą cytometrii przepływowej, 75% komórek we frakcji adipogennej to komórki prekursorowe adipocytów Ly6C ujemne CD-9, podczas gdy ponad 75% frakcji nieadipogennej to włókniste komórki progenitorowe Ly6C dodatnie.Komórki prekursorowe adipocytów wyizolowane dowolną metodą różnicują się w adipocyty zawierające lipidy do wysokiej czystości w ciągu siedmiu do 10 dni od posiewu. Natomiast prekursory nieadipogenne pozostają podobne do fibroblastów i nie stają się adipocytami w tych samych warunkach hodowli. Protokół działa w celu izolacji subpopulacji komórek zrębu adipogennego i włóknistego zapalenia z okołogonadalnej białej tkanki tłuszczowej.Podobne populacje komórek można znaleźć w innych magazynach tłuszczu myszy. Jednak ich selekcja będzie zależała od użycia różnych przeciwciał. Populacje komórek wyizolowane za pomocą FACS i separacji magnetycznej mogą być wykorzystane do testów różnicowania komórek in vitro lub dalej scharakteryzowane za pomocą analizy ekspresji genów.

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentujemy techniki wymagane do wyizolowania zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysich pachwinowych (podskórnych) i okołogonadalnych (trzewnych) magazynów tkanki tłuszczowej w celu oceny ich ekspresji genów i aktywności kolagenolitycznej. Metoda ta obejmuje wzbogacanie komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.

Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy izolację, hodowlę i indukcję adipogenną preadipocytów pochodzących z frakcji naczyniowej zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej okołoaortalnej, co pozwala na badanie funkcji okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej i jej związku z komórkami naczyniowymi.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna preadipocytów pochodzących z frakcji zrębu naczyniowego z mysiej tkanki tłuszczowej okołooortalnej

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj izolację adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej metodą FACS lub separacją immunomagnetyczną. Ta technika umożliwia badanie unikalnych typów komórkowych w tkance tłuszczowej.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Przeglądaj więcej filmów