Potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji RNA
28 maja 2021
Celem tego protokołu jest zbadanie ewolucji i ekspresji genów kandydujących przy użyciu danych sekwencjonowania RNA.
Protokół ten określa bioinformatyczne kroki w celu zbadania ewolucji molekularnej i ekspresji genów kandydujących. Tutaj podajemy dokładne instrukcje, aby każdy, kto ma minimalne doświadczenie bioinformatyczne, mógł przejść przez ten protokół. Ten rurociąg może być stosowany do dowolnego organizmu i dowolnej rodziny genów.
Jednym z częstych problemów podczas wykonywania bioinformatyki jest awaria skryptów powłoki. Próbując skorzystać z tego protokołu, upewnij się, że masz najnowsze oprogramowanie, przeczytaj pliki błędów i dokładnie sprawdź instrukcję. Aby rozpocząć, zaloguj się do konta klastra komputerowego w terminalu lub oknie aplikacji PuTTY.
Na terminalu pobierz Toolkit w wersji 2.8.1 za pomocą Wget, a następnie zakończ instalację programu. Wyszukaj w NCBI numer dostępu dla żądanych próbek, a następnie uzyskaj dane sekwencji RNA w oknie terminala. Uzyskaj dwa pliki FASTQ dla typu plików sparowanych.
Znajdź genom referencyjny online, jeśli taki istnieje. Aby uzyskać zestaw odniesienia, wpisz wget w oknie terminalu i wklej adres łącza. Jeśli to możliwe, skopiuj również plik GTF i plik FASTA białka dla genomu referencyjnego.
Indeksuj genom, a następnie mapuj odczyty i obliczaj wyrażenie dla każdej próbki. Zmień nazwę pliku wyników na opisową i wygeneruj macierz wszystkich zliczeń. Otwórz okno przeglądarki internetowej i przejdź do NCBI GenBank.
W pasku wyszukiwania wpisz nazwę interesującego Cię genu oraz nazwę blisko spokrewnionych gatunków, które zostały zsekwencjonowane. Po lewej stronie paska wyszukiwania wybierz Białko, a następnie kliknij w Szukaj. Wyodrębnij sekwencje, klikając przycisk Wyślij do, a następnie wybierz pozycję Plik.
W obszarze Format wybierz opcję FASTA, a następnie kliknij przycisk Utwórz plik. Przenieś plik FASTA z homologami do klastra komputerowego za pomocą lokalnego okna terminala lub FileZilla. Następnie wyszukaj geny kandydujące za pomocą BLAST+Na klastrze komputerowym utwórz bazę danych BLAST z genomu lub białka transtranskryptomu, FASTA.
Wyślij homologiczne sekwencje genów z NCBI do bazy danych interesujących gatunków, a następnie wyświetl plik wyjściowy za pomocą polecenia more. Skopiuj unikalne identyfikatory genów z interesujących gatunków do nowego pliku tekstowego. Wyodrębnij sekwencje genów kandydujących.
Aby potwierdzić adnotację genu za pomocą Reciprocal BLAST, przejdź do narzędzia BLAST Local Alignment Search Tool, wybierz BLASTP, a następnie wklej kandydujące sekwencje, wybierz bazę danych nienadmiarowych sekwencji białek i kliknij BLAST. Otwórz MEGA, kliknij Wyrównaj, a następnie Edytuj wyrównanie kompilacji, wybierz Utwórz nową linię trasowania i kliknij OK. Wybierz opcję Białko. Gdy otworzy się okno Wyrównanie, kliknij Edytuj.
Kliknij opcję Insert Sequences From File (Wstaw sekwencje z pliku) i wybierz FASTA z sekwencjami białek genów kandydujących i prawdopodobnych homologów. Wybierz opcję Wszystkie sekwencje. Znajdź symbol ramienia i najedź na niego kursorem.
Powinien mówić wyrównaj sekwencje za pomocą algorytmu mięśniowego. Kliknij symbol ramienia, a następnie kliknij przycisk Wyrównaj białko, aby wyrównać sekwencje Edytuj parametry lub kliknij przycisk OK, aby użyć parametrów domyślnych. Protokół ten został zastosowany do tkanek Hydra vulgaris, która jest słodkowodnym bezkręgowcem należącym do gromady Cnidaria.
Zbadano geny opsyny, aby uzyskać wgląd w ewolucję oczu i wykrywanie światła u zwierząt. Sekwencje genów związanych z opsyną H.vulgaris i innych gatunków zostały wyekstrahowane do pliku FASTA z NCBI GenBank. Geny opsyny zostały dopasowane w MEGA, co umożliwiło zidentyfikowanie opsyn Hydra, w których brakowało konserwatywnego aminokwasu lizyny niezbędnego do wiązania cząsteczki wrażliwej na światło.
Drzewo maksymalnego prawdopodobieństwa zostało wygenerowane przy użyciu sekwencji opsyny z Hydra vulgaris i innych gatunków. Filogeneza sugeruje, że geny opsyny ewoluują przez duplikacje specyficzne dla linii u parzydełkowców i potencjalnie przez duplikację tandemową u H. vulgaris. Następnie przeprowadzono analizę różnicową ekspresji w edgeR w celu zbadania bezwzględnej ekspresji genów opsyny.
Aby określić, czy jedna lub więcej opsyn jest regulowanych w górę w hypostomie lub głowie, przeprowadzono porównania parami hypostomu z kolumną ciała, strefą pączkowania, stopą i mackami. Stwierdzono, że 1 774 transkrypty były różnie wyrażane między hypostomem a kolumną ciała. Określono geny, które były regulowane w górę w wielu porównaniach, a następnie przeprowadzono funkcjonalne wzbogacenie w Blast2GO.
Na koniec zbadano bezwzględną ekspresję genów opsyny w różnych tkankach na różnych etapach pączkowania i w różnych punktach czasowych regeneracji. Oględziny ułożenia i drzewa potwierdzą, czy geny kandydujące należą do rodziny będącej przedmiotem zainteresowania. Geny, które są zbyt różne w sekwencji lub należą do grupy poza wszystkim innym, są prawdopodobnie częścią innej rodziny genów.
Wyniki tego protokołu można uznać za generujące hipotezy. To badanie może wyłonić geny kandydujące do funkcjonalnego zbadania w przyszłych badaniach. Po zbadaniu ekspresji opsyny Hydra, używamy teraz podobnych technik do badania powiązanych genów między gatunkami w celu zidentyfikowania podobieństw i różnic w funkcji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół bada ewolucję molekularną i ekspresję genów kandydackich z wykorzystaniem danych z sekwencjonowania RNA, koncentrując się w szczególności na genach opsyn u Hydra vulgaris. Badanie przedstawia potok bioinformatyczny, który może zostać zastosowany w odniesieniu do różnych organizmów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Analiza ekspresji genów
- Ewolucja molekularna
- Bioinformatyka
Wstęp
- Badanie genów kandydackich związanych z detekcją światła i ewolucją oka
- Wykorzystanie słodkowodnego bezkręgowca Hydra vulgaris
- Zastosowanie zasobów NCBI do pozyskiwania danych sekwencyjnych
Zastosowane metody
- Potok bioinformatyczny do sekwencjonowania RNA
- Hydra vulgaris jako system biologiczny
- Narzędzia takie jak BLAST, MEGA i edgeR do analizy
Główne wyniki
- Zidentyfikowano geny opsyn ewoluujące poprzez specyficzne dla linii duplikacje u Cnidaria
- Stwierdzono różnicową ekspresję 1 774 transkryptów w różnych częściach ciała
- Wygenerowano drzewo filogenetyczne sekwencji opsyn metodą maksymalnej wiarygodności
Wnioski
- Protokół podkreśla potencjał genów kandydackich w przyszłych badaniach funkcjonalnych
- Poszerza naszą wiedzę na temat ewolucji i ekspresji genów w odniesieniu do biologii sensorycznej
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ten potok bioinformatyczny umożliwia systematyczne badanie ewolucji i ekspresji rodzin genów, wspierając walidację celów poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka we wczesnej fazie odkryć. Dzięki integracji analizy filogenetycznej z kwantyfikacją RNA-seq zapewnia on pewność prognostyczną przy priorytetyzacji genów kandydatów o funkcjach konserwatywnych lub dywergentnych pomiędzy gatunkami. Podejście to wspomaga selekcję portfela poprzez identyfikację hipotez opartych na mechanizmach przed przeznaczeniem zasobów na badania funkcjonalne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez wyjaśnienie ortologii genów i zależności ewolucyjnych w obrębie rodzin docelowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celów poprzez porównawcze profilowanie ekspresji w różnych tkankach i etapach rozwoju.
- Wartość predykcyjna: Wsparcie identyfikacji substancji wiodących poprzez wskazanie genów z ekspansjami specyficznymi dla danej linii oraz wzorcami ekspresji wzbogaconej w konkretnych tkankach.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane zestawy genów do dalszego przesiewu poprzez potwierdzenie przynależności do rodziny za pomocą dopasowania sekwencji i topologii drzewa.
- Wartość operacyjna: Generuje standaryzowane macierze zliczeń z danych RNA-seq, umożliwiając powtarzalne wyniki ilościowe w celu przygotowania do analizy.
- Skalowalność: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych organizmów poprzez zastosowanie spójnych schematów pracy BLAST, dopasowania i filogenetyki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane o ekspresji z fazy odkryć z modelami przedklinicznymi poprzez identyfikację konserwatywnych wzorców ekspresji w odpowiednich tkankach.
- Dopasowanie biomarkerów: Wspiera odkrywanie biomarkerów translacyjnych poprzez analizę różnicowej ekspresji w różnych warunkach, takich jak hipostom w porównaniu z kolumną ciała u Hydra.
- Postępy z uwzględnieniem ryzyka: Informuje decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ujawnianie dynamiki ekspresji podczas etapów regeneracji i pączkowania, co wskazuje na istotność funkcjonalną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków, od identyfikacji celu po optymalizację wiodących związków, umożliwiając postęp oparty na hipotezach, od analizy sekwencji po priorytetyzację funkcjonalną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez generowanie filogenii, które ujawniają zdarzenia duplikacji i presję selekcyjną w analizowanych rodzinach genów.
- Przesiewanie: Dostarcza systemy biologiczne gotowe do analizy dzięki znormalizowanym macierzom ekspresji, które umożliwiają porównywanie aktywności genów między próbkami.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych za pomocą analizy ekspresji różnicowej opartej na edgeR, co umożliwia statystyczne porównywanie warunków.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez identyfikację genów o konserwowanych rolach w systemach sensorycznych u zwierząt wielokomórkowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną zdolność bioinformatyczną do badania dowolnej rodziny genów, co ogranicza redundantne opracowywanie potoków analizy w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki analizie kontekstu ewolucyjnego i ekspresyjnego.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki udokumentowanym, etapowym procedurom bioinformatycznym, które można stosować w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka związanego z celami przed inwestycją w walidację laboratoryjną (wet-lab).
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wskazanie genów o silnej konserwacji ewolucyjnej i indukcji specyficznej dla tkanek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu bioinformatyki, w tym obsługi narzędzi wiersza poleceń, baz danych sekwencji oraz oprogramowania do analiz filogenetycznych.
- Zależność od dostępu do infrastruktury obliczeniowej umożliwiającej przetwarzanie dużych zbiorów danych RNA-seq oraz przeprowadzanie analiz w programach BLAST, MEGA i edgeR.
- Konieczność ujednolicenia standardów w obrębie zespołów w zakresie nazewnictwa plików, wersji genomów referencyjnych oraz ustawień parametrów dla dopasowania sekwencji i budowania drzew.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu potoku analizy w odniesieniu do organizmów niemodelowych z niepełnymi genomami lub adnotacjami.
- Ograniczenia wynikające z jakości i kompletności danych wejściowych, w tym głębokości sekwencjonowania RNA-seq oraz dokładności adnotacji genomu referencyjnego.
