Name: Potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj potok bioinformatyczny do analizy ewolucji molekularnej i ekspresji genów kandydackich przy użyciu danych RNA-seq. Metoda obejmuje narzędzia BLAST, MEGA i edgeR do badania genów opsynowych u Hydra vulgaris.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Adrianie Briscoe, Gilowi Smithowi, Rabiegowi Muradowi i Aline G. Rangel za rady i wskazówki dotyczące włączenia niektórych z tych kroków do naszego przepływu pracy. Jesteśmy również wdzięczni Katherine Williams, Elisabeth Rebboah i Natashy Picciani za komentarze do rękopisu. Praca ta była częściowo wspierana przez stypendium badawcze Fundacji George'a E. Hewitta na rzecz Medycyny dla A.M.M.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi UC Irvine dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Przygotowanie biblioteki sekwencyjnej RNA
<ol>
	<li>Wyizoluj RNA przy użyciu następujących metod.
	<ol>
		<li>Zbierz próbki. Jeśli RNA ma być ekstrahowane w późniejszym czasie, błyskawicznie zamroź próbkę lub umieść ją w roztworze do przechowywania RNA15 (Tabela materiałów).</li>
		<li>Poddaj organizmowi eutanazji i poddaj go sekcji, aby oddzielić interesujące go tkanki.</li>
		<li>Ekstrahować całkowity RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji i oczyszczać RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA (tabela materiałów) 
		UWAGA: Istnieją protokoły i zestawy, które mogą działać lepiej dla różnych gatunków i typów tkanek16,17. Wyodrębniliśmy RNA z różnych tkanek ciała motyla18 i galaretowatego Hydra19 (zobacz dyskusję).</li>
		<li>Zmierzyć stężenie i jakość RNA w każdej próbce (tabela materiałów). Do konstruowania bibliotek cDNA należy używać próbek o liczbie integralności RNA (RIN) wyższej niż 8, najlepiej bliższej 920.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonstruuj bibliotekę i sekwencję cDNA w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Zbuduj biblioteki cDNA zgodnie z instrukcją przygotowania biblioteki (patrz dyskusja).</li>
		<li>Określ stężenie i jakość cDNA (tabela materiałów).</li>
		<li>Multipleksuj biblioteki i sekwencjonuj je.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dostęp do klastra komputerowego
UWAGA: Analiza sekwencyjna RNA wymaga manipulacji dużymi plikami i najlepiej jest ją przeprowadzić na klastrze komputerowym (Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Zaloguj się do konta klastra komputerów za pomocą polecenia ssh username@clusterlocation w oknie terminala (Mac) lub aplikacji PuTTY (Windows).</li>
</ol>
3. Uzyskiwanie odczytów sekwencyjnych RNA
<ol>
	<li>Uzyskać odczyty sekwencji RNA z urządzenia do sekwencjonowania lub, w przypadku danych wygenerowanych w publikacji, z repozytorium danych, w którym zostały zdeponowane (ppkt 3.2 lub 3.3).</li>
	<li>Aby pobrać dane z repozytoriów, takich jak ArrayExpress, wykonaj następujące czynności:
	<ol>
		<li>Przeszukaj witrynę, korzystając z numeru dostępu.</li>
		<li>Znajdź link, aby pobrać dane, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i wybierz Kopiuj link.</li>
		<li>W oknie terminalu wpisz wget i wybierz opcję Wklej łącze, aby skopiować dane do katalogu w celu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby pobrać dane NCBI Short Read Archive (), wykonaj następujące alternatywne kroki:
	<ol>
		<li>Na terminalu pobierz Toolkit v. 2.8.1 za pomocą wget. 
		UWAGA: Pobieranie i instalowanie programów w klastrze komputerowym może wymagać dostępu administratora klastra komputerowego, jeśli instalacja nie powiedzie się, skontaktuj się z administratorem klastra komputerowego.</li>
		<li>Zakończ instalację programu, wpisując tar -xvf $TARGZFILE.</li>
		<li>Wyszukaj w NCBI numer dostępu dla próbek, które chcesz pobrać, powinien on mieć format SRRXXXXXX.</li>
		<li>Uzyskaj dane sekwencji RNA, wpisując [lokalizacja sratoolkit]/bin/prefetch SRRXXXXXX w oknie terminala.</li>
		<li>W przypadku plików sparowanych końców wpisz [lokalizacja sratoolkit]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX, aby uzyskać dwa pliki fastq (SRRXXXXXX_1.FASTQ i SRRXXXXXX_2.FASTQ). 
		UWAGA: Aby wykonać montaż Trinity de novo, użyj polecenia [lokalizacja sratoolkit]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Adaptery przycinania i odczyty niskiej jakości (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Zainstaluj lub załaduj Trimmomatic21 v. 0.35 do klastra obliczeniowego.</li>
	<li>W katalogu, w którym znajdują się pliki danych sekwencyjnych RNA, wpisz polecenie, które zawiera lokalizację pliku jar trimmomatic, wejściowe pliki FASTQ, wyjściowe pliki FASTQ oraz opcjonalne parametry, takie jak długość i jakość odczytu. 
	UWAGA: Polecenie będzie się różnić w zależności od surowej i pożądanej jakości oraz długości odczytów. Do odczytów Illumina 43 bp ze starterami Nextera użyliśmy: java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ paired_READ1. FASTQ unpaired_READ1. FASTQ paired_READ2. FASTQ unpaired_READ2. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 PROWADZENIE:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.</li>
</ol>
5. Pobierz zestaw referencyjny
<ol>
	<li>Wyszukaj w Google, EnsemblGenomes i NCBI Genomes and Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) genom referencyjny lub złożony transkryptom dla interesującego gatunku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Jeśli genom referencyjny lub transkryptom są niedostępne lub są niskiej jakości, przejdź do KROKU 6, aby wygenerować zestaw de novo.</li>
	<li>Jeśli istnieje genom referencyjny lub złożony transkryptom, pobierz go jako plik fasta do miejsca, w którym zostanie przeprowadzona analiza, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Znajdź link, aby pobrać genom, kliknij lewym przyciskiem myszy i skopiuj link.</li>
		<li>W oknie terminala wpisz wget i wklej adres linku. Jeśli to możliwe, skopiuj również plik GTF i plik FASTA białka dla genomu referencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wygeneruj zestaw de novo (Alternatywa dla kroku 5)
<ol>
	<li>Połącz pliki fastq RNA-seq READ1 i READ2 dla wszystkich próbek, wpisując cat *READ1. FASTQ > $all_READ1. FASTQ i kot *READ2. FASTQ > all_READ2. FASTQ w oknie terminala.</li>
	<li>Zainstaluj lub załaduj Trinity22 v.2.8.5 do klastra obliczeniowego.</li>
	<li>Generuj i składaj, wpisując w terminalu: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --right $all_READ2. SZYBKIQ.</li>
</ol>
7. Mapa odczytuje genom (7.1) lub transkryptom de novo (7.2)
<ol>
	<li>Mapa odczytuje genom referencyjny przy użyciu STAR23 v. 2.6.0c i RSEM24 v. 1.3.0.
	<ol>
		<li>Zainstaluj lub załaduj programy STAR v. 2.6.0c. i RSEM v. 1.3.0 do klastra obliczeniowego.</li>
		<li>Indeksuj genom, wpisując rsem-prepare-reference --gtf $GENOME. GTF --star -p 16 $GENOME. FASTA $OUTPUT.</li>
		<li>Mapuj odczyty i obliczaj wyrażenie dla każdej próbki, wpisując rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ $INDEX $OUTPUT.</li>
		<li>Zmień nazwę pliku wyników na opisową przy użyciu mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.</li>
		<li>Wygeneruj macierz wszystkich zliczeń, wpisując rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mapuj sekwencję RNA do montażu Trinity de novo za pomocą RSEM i muszki.
	<ol>
		<li>Zainstaluj lub załaduj Trinity22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 i RSEM v. 1.3.0.</li>
		<li>Mapuj odczyty i obliczaj wyrażenie dla każdej próbki, wpisując [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY. FASTA --seqType fq --left $READ 1. FASTQ - prawy $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --aln_method muszka --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.</li>
		<li>Zmień nazwę pliku wyników na opisową przy użyciu mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.</li>
		<li>Wygeneruj macierz wszystkich zliczeń, wpisując [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[geny/izoformy].wyniki</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Zidentyfikuj interesujące geny
UWAGA: Następujące kroki można wykonać za pomocą plików FASTA z nukleotydami lub białkami, ale działają najlepiej i są prostsze w przypadku sekwencji białek. Wyszukiwanie BLAST przy użyciu białka do białka z większym prawdopodobieństwem da wyniki podczas wyszukiwania między różnymi gatunkami.
<ol>
	<li>Aby uzyskać genom referencyjny, użyj pliku FASTA białka z kroku 5.2.2 lub zobacz Materiały uzupełniające, aby wygenerować niestandardową cechę genu GTF.</li>
	<li>Aby uzyskać transkryptom de novo, wygeneruj białko FASTA za pomocą TransDecoder.
	<ol>
		<li>Zainstaluj lub załaduj TransDecoder v. 5.5.0 na komputerze cluser.</li>
		<li>Znajdź najdłuższą otwartą ramkę odczytu i przewidywaną sekwencję peptydów, wpisując [Transdecoder location]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY. Fasta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszukaj NCBI Genbank w poszukiwaniu homologów u blisko spokrewnionych gatunków.
	<ol>
		<li>Otwórz okno przeglądarki internetowej i przejdź do https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.</li>
		<li>Na pasku wyszukiwania wpisz nazwę interesującego nas genu oraz nazwę blisko spokrewnionych gatunków, które zostały zsekwencjonowane lub rodzaju lub gromady. Po lewej stronie paska wyszukiwania wybierz białko, a następnie kliknij szukaj.</li>
		<li>Wyodrębnij sekwencje, klikając przycisk Wyślij do, a następnie wybierz opcję Plik. W obszarze Format wybierz opcję FASTA, a następnie kliknij przycisk Create File (Utwórz plik).</li>
		<li>Przenieś plik FASTA z homologami do klastra komputerowego, wpisując scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR w oknie terminala lokalnego lub użyj FileZilla do przesyłania plików do i z komputera i klastra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyszukaj geny kandydujące za pomocą BLAST+26.
	<ol>
		<li>Zainstaluj lub załaduj BLAST+ v. 2.8.1 do klastra komputerowego.</li>
		<li>W klastrze komputerowym utwórz bazę danych BLAST z białka FASTA poddanego transkryptomowi transkryptomu, wpisując [lokalizacja BLAST+]/makeblastdb -in $PEP. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT</li>
		<li>WYSADZAJ homologiczne sekwencje genów z NCBI do bazy danych gatunków będących przedmiotem zainteresowania, wpisując [BLAST+ lokalizacja]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT.</li>
		<li>Wyświetl plik wyjściowy za pomocą polecenia more. Skopiuj unikalne identyfikatory genów z interesujących gatunków do nowego pliku tekstowego.</li>
		<li>Wyodrębnij sekwencje genów kandydujących, wpisując perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP. FASTA > $OUTPUT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź adnotację genu za pomocą odwrotnego BLAST.
	<ol>
		<li>W przeglądarce internetowej przejdź do https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.</li>
		<li>Wybierz tblastn, a następnie wklej proponowane sekwencje, wybierz bazę danych Nienadmiarowe sekwencje białek i kliknij BLAST.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj dodatkowe geny, adnotując wszystkie geny w genomie lub transkryptomie za pomocą terminów ontologii genów (GO) (patrz dyskusja).
	<ol>
		<li>Przenieś białko FASTA do komputera lokalnego.</li>
		<li>Pobierz i zainstaluj Blast2GO27,28,29 v. 5.2 na komputerze lokalnym.</li>
		<li>Otwórz Blast2GO, kliknij Plik, przejdź do Załaduj, przejdź do Ładuj sekwencje, kliknij Załaduj plik Fasta (fasta). Wybierz plik FASTA i kliknij przycisk Załaduj.</li>
		<li>Kliknij Blast, wybierz NCBI Blast i kliknij Dalej. Edytuj parametry lub kliknij przycisk Dalej, edytuj parametry i kliknij przycisk Uruchom, aby znaleźć najbardziej podobny opis genu.</li>
		<li>Kliknij pozycję Mapowanie, a następnie kliknij pozycję Uruchom, aby wyszukać podobne białka w adnotacjach Gene Ontology.</li>
		<li>Następnie kliknij interpro, wybierz EMBL-EBI InterPro i kliknij Dalej. Edytuj parametry lub kliknij przycisk Dalej, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby wyszukać sygnatury znanych rodzin genów i domen.</li>
		<li>Wyeksportuj adnotacje, klikając pozycję Plik, wybierz opcję Eksportuj, a następnie kliknij pozycję Eksportuj tabelę. Kliknij przycisk Przeglądaj, nazwij plik, kliknij przycisk Zapisz, kliknij przycisk Eksportuj.</li>
		<li>Przeszukaj tabelę adnotacji pod kątem interesujących Cię terminów GO, aby zidentyfikować dodatkowe geny kandydujące. Wyodrębnij sekwencje z pliku FASTA (KROK 8.4.5)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Drzewa filogenetyczne
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj MEGA30 v. 7.0.26 na swoim komputerze lokalnym.</li>
	<li>Otwórz MEGA, kliknij Wyrównaj, kliknij Edytuj/Zbuduj wyrównanie, wybierz Utwórz nowe wyrównanie, kliknij OK, wybierz Białko.</li>
	<li>Gdy otworzy się okno wyrównania, kliknij Edytuj, kliknij Wstaw sekwencje z pliku i wybierz FASTA z sekwencjami białek genów kandydujących i prawdopodobnymi homologami.</li>
	<li>Zaznacz wszystkie sekwencje. Znajdź symbol ramienia i najedź na niego kursorem. Powinno być napisane Align sequences using MUSCLE31 algorithm. Kliknij symbol ramienia, a następnie kliknij przycisk Wyrównaj białko, aby wyrównać sekwencje. Edytuj parametry lub kliknij przycisk OK, aby wyrównać przy użyciu parametrów domyślnych.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo i wprowadź wszelkie zmiany ręczne, a następnie Zapisz i zamknij okno wyrównania.</li>
	<li>W oknie głównym MEGA kliknij na Modele, kliknij Znajdź najlepsze modele DNA/białka (ML), wybierz plik wyrównania i wybierz odpowiednie parametry, takie jak: Analiza: Wybór modelu (ML), Drzewo do użycia: Automatyczne (drzewo łączące sąsiadów), Metoda statystyczna: Maksymalne prawdopodobieństwo, Typ podstawienia: Aminokwas, Leczenie luk/brakujących danych: Użyj wszystkich lokalizacji, Filtr lokalizacji oddziału: Brak.</li>
	<li>Po ustaleniu najlepszego modelu dla danych przejdź do głównego okna MEGA. Kliknij Filogeneza i kliknij Drzewo maksymalnego prawdopodobieństwa konstrukcji/testu, a następnie wybierz wyrównanie, jeśli to konieczne. Wybierz odpowiednie parametry dla drzewa: Metoda statystyczna: Maksymalne prawdopodobieństwo, Test filogenezy: metoda Bootstrap z 100 powtórzeniami, typ podstawienia: aminokwas, model: LG z częstotliwościami. (+F), współczynniki między lokalizacjami: rozkład gamma (G) z 5 dyskretnymi kategoriami gamma, leczenie luk/brakujących danych: użyj wszystkich miejsc, metoda heurystyczna ML: Nearest-Neighbor-Interchange (NNI).</li>
</ol>
10. Wizualizacja ekspresji genów za pomocą TPM
<ol>
	<li>W przypadku Trinity w klastrze komputerowym przejdź do katalogu, w którym abundance_estimates_to_matrix.pl został uruchomiony, a jednym z danych wyjściowych powinna być matrix. TPM.not_cross_norm. Przenieś ten plik na komputer lokalny. 
	UWAGA: Patrz Materiały uzupełniające dotyczące normalizacji próbek krzyżowych.</li>
	<li>W przypadku modułów TPM z analizy genomu wykonaj poniższe czynności.
	<ol>
		<li>W klastrze komputerów przejdź do lokalizacji instalacji programu RSEM. Skopiuj rsem-generate-data-matrix, wpisując scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix. Użyj nano, aby edytować nowy plik i zmień "mój $offsite = 4" z 4 na 5 dla TPM, powinno teraz być "mój $offsite = 5".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do katalogu, w którym znajdują się pliki wyjściowe programu RSEM .genes.results, a teraz użyj > $OUTPUT rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] w celu wygenerowania macierzy modułu TPM. Przenieś wyniki na komputer lokalny.</li>
	<li>Wizualizuj wyniki w ggplot2.
	<ol>
		<li>Pobierz program R w wersji 4.0.0 i RStudio w wersji 1.2.1335 na komputer lokalny.</li>
		<li>Otwórz program RStudio po prawej stronie ekranu, przejdź do karty Pakiety i kliknij przycisk Zainstaluj. Wpisz ggplot2 i kliknij zainstaluj.</li>
		<li>W oknie skryptu języka R odczytaj tabelę modułu TPM, wpisując data<-read.table("$tpm.txt",header = T)</li>
		<li>W przypadku wykresów słupkowych podobnych do Rysunek 4 wpisz coś podobnego do: p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tkanka), data=data, stat="tożsamość") 
		fill<-c("#d7191c","#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6") 
		p<-p+scale_fill_manual(wartości=wypełnienie) 
		p + motyw(oś.tekst.x = element_text(kąt = 90))</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem tego protokołu jest przedstawienie zarysu kroków charakteryzowania rodziny genów przy użyciu danych sekwencyjnych RNA. Udowodniono, że metody te działają w przypadku różnych gatunków i zestawów danych 4,34,35. Utworzony tutaj rurociąg został uproszczony i powinien być na tyle łatwy, że może go śledzić nowicjusz w bioinformatyce. Znaczenie protokołu polega na tym, że przedstawia on wszystkie kroki i programy niezbędne do uk...

Postępy w technologiach sekwencjonowania ułatwiły sekwencjonowanie genomów i transkryptomów organizmów niemodelowych. Oprócz zwiększonej wykonalności sekwencjonowania DNA i RNA z wielu organizmów, publicznie dostępnych jest wiele danych do badania interesujących genów. Celem tego protokołu jest zapewnienie bioinformatycznych kroków w celu zbadania ewolucji molekularnej i ekspresji genów, które mogą odgrywać ważną rolę w organizmie będącym przedmiotem zainteresowania.
Badanie ewolucji genu lub rodziny genów może dostarczyć wglądu w ewolucję systemów biologicznych. Członkowie rodziny genów są zazwyczaj określani poprzez identyfikację konserwatywnych motywów lub homologicznych sekwencji genów. Ewolucja rodziny genów była wcześniej badana przy użyciu genomów z odległych spokrewnionych organizmów modelowych1. Ograniczeniem tego podejścia jest to, że nie jest jasne, w jaki sposób te rodziny genów ewoluują u blisko spokrewnionych gatunków i jaka jest rola różnych środowiskowych presji selekcyjnych. W tym protokole uwzględniamy poszukiwanie homologów u blisko spokrewnionych gatunków. Generując filogenezę na poziomie gromady, możemy zauważyć trendy w ewolucji rodziny genów, takie jak konserwatywne geny lub duplikacje specyficzne dla linii. Na tym poziomie możemy również zbadać, czy geny są ortologiami czy paralogami. Chociaż wiele homologów prawdopodobnie działa podobnie do siebie, niekoniecznie tak jest2. Włączenie drzew filogenetycznych do tych badań jest ważne dla ustalenia, czy te homologiczne geny są ortologiami, czy nie. U eukariontów wiele ortologów zachowuje podobne funkcje w komórce, o czym świadczy zdolność białek ssaków do przywracania funkcji ortologów drożdży3. Istnieją jednak przypadki, w których gen nieortologiczny pełni funkcję scharakteryzowaną4.
Drzewa filogenetyczne zaczynają wyznaczać relacje między genami i gatunkami, ale funkcja nie może być przypisana wyłącznie na podstawie powiązań genetycznych. Badania ekspresji genów w połączeniu z adnotacjami funkcjonalnymi i analizą wzbogacenia zapewniają silne wsparcie dla funkcji genów. Przypadki, w których ekspresję genów można określić ilościowo i porównać między osobami lub typami tkanek, mogą bardziej świadczyć o potencjalnej funkcji. Poniższy protokół jest zgodny z metodami stosowanymi w badaniu genów opsyny w Hydra vulgaris7, ale można je zastosować do dowolnego gatunku i dowolnej rodziny genów. Wyniki takich badań stanowią podstawę do dalszych badań nad funkcją genów i sieciami genów w organizmach niemodelowych. Na przykład, badanie filogenezy opsyn, które są białkami inicjującymi kaskadę fototransdukcji, daje kontekst ewolucji oczu i detekcji światła8,9,10,11. W tym przypadku organizmy niemodelowe, zwłaszcza podstawowe gatunki zwierząt, takie jak parzydełka lub ctenofory, mogą wyjaśnić ochronę lub zmiany w kaskadzie fototransdukcji i widzeniu w kladach12,13,14. Podobnie, określenie filogenezy, ekspresji i sieci innych rodzin genów poinformuje nas o mechanizmach molekularnych leżących u podstaw adaptacji.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Bioanalyzer-DNA</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>mokre materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>Zestaw bioanalizatora RNA</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>mokre materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>BLAST+ v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Na klastrze komputerowym* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td></tr> <tr><td>Blast2GO (na Twoim komputerze)</td><td></td><td></td><td>Na komputerze lokalnym https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td></tr><tr><td>boost v. 1.57.0</td><td></td><td></td><td>On computer cluster</td></tr><tr><td>Bowtie v. 1.0.0</td><td></td><td></td><td>On computer cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td></tr> <tr><td>Computing cluster (wysoce zalecane)</td><td></td><td></td><td>UWAGA: Analizy danych genomowych najlepiej wykonywać w klastrze obliczeniowym o wysokiej wydajności, ponieważ pliki są bardzo duże.</td></tr><tr><td>Spinki do mankietów v. 2.2.1</td><td></td><td></td><td>Na klastrze komputerowym</td></tr><tr><td>edgeR v. 3.26.8 (w R)</td><td></td><td></td><td>W Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td></tr><tr><td>gcc v. 6.4.0</td><td></td><td></td><td>Na klastrze komputerowym</td></tr><tr><td>Java v. 11.0.2</td><td></td><td></td><td>Na klastrze komputerowym</td></tr><tr><td>MEGA7 (na twoim komputerze)</td><td></td><td></td><td>Na komputerze lokalnym https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MEGAX v. 0.1</td><td></td><td></td><td>Na komputerze lokalnym https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>Zestaw NucleoSpin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td>Mokre materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>Perl 5.30.3</td><td></td><td></td><td>Na klastrze komputerowym</td></tr><tr><td>python</td><td></td><td></td><td>Na klastrze komputerowym</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometr</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td>mokre materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>R v.4.0.0</td><td></td><td></td><td>Na klastrze komputerowym https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td></tr> <tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7021</td><td>mokre materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>RNeasy kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>mokre materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>RSEM v. 1.3.0</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie komputerowe https://deweylab.github.io/RSEM/</td></tr><tr><td>RStudio v. 1.2.1335</td><td></td><td></td><td>On local computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td></tr><tr><td>Samtools v. 1.3</td><td></td><td></td><td>Computer software</td></tr><tr><td>Toolkit v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>On computer cluster https://github.com/ncbi/-tools/wiki/01.-Downloading--Toolkit</td></tr><tr><td>STAR v. 2.6.0c</td><td></td><td></td><td>On computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR</td></tr><tr><td>StringTie v. 1.3.4d</td><td></td><td></td><td>On computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td></tr> <tr><td>Transdecoder v. 5.5.0</td><td></td><td></td><td>On computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td></tr><tr><td>Trimmomatic v. 0.35</td><td></td><td></td><td>On computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Trinity v.2.8.5</td><td></td><td></td><td>Na klastrze komputerowym https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>mokrych materiałach laboratoryjnych</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki RNA TruSeq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>mokre materiały laboratoryjne</td>Zestaw</tr><tr><td>TURBO bez DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>mokre materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Pobieranie i instalacja w klastrze komputerowym może wymagać dostępu do konta root. Skontaktuj się z administratorem sieci.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji rna

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Destylacja i raportowanie dużych zbiorów danych, takich jak dane dotyczące całego genomu lub transkryptomu, jest często trudnym zadaniem. Jednym ze sposobów na rozbicie wyników jest skupienie się na jednej lub więcej rodzinach genów, które są istotne dla organizmu i badania. W tym protokole przedstawiamy bioinformatyczne kroki w celu wygenerowania filogenezy i ilościowego określenia ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania. Drzewa filogenetyczne mogą dać wgląd w to, jak geny ewoluują w obrębie gatunków i między gatunkami, a także ujawnić ortologię. Wyniki te można poprawić, wykorzystując dane sekwencyjne RNA w celu porównania ekspresji tych genów u różnych osób lub tkanek. Badania nad ewolucją i ekspresją molekularną mogą ujawnić tryby ewolucji i zachowania funkcji genów między gatunkami. Charakterystyka rodziny genów może służyć jako punkt wyjścia do przyszłych badań i może podkreślić ważną rodzinę genów w nowym genomie lub artykule transkryptomowym.

Powyższe metody zostały podsumowane na Rysunku 1 i zastosowano je do zestawu danych z tkanek Hydra vulgaris. H. vulgaris to słodkowodny bezkręgowiec należący do typu Cnidaria, do którego należą również koralowce, meduzy i ukwiały. H. vulgaris może rozmnażać się bezpłciowo poprzez pączkowanie i potrafi zregenerować głowę oraz stopę po przecięciu na pół. W niniejszym badaniu naszym celem była analiza ewolucji i ekspresji genów opsyn u Hydra<sup clas...

Celem tego protokołu jest zbadanie ewolucji i ekspresji genów kandydujących przy użyciu danych sekwencjonowania RNA.

Potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji RNA

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Protokół ten określa bioinformatyczne kroki w celu zbadania ewolucji molekularnej i ekspresji genów kandydujących. Tutaj podajemy dokładne instrukcje, aby każdy, kto ma minimalne doświadczenie bioinformatyczne, mógł przejść przez ten protokół. Ten rurociąg może być stosowany do dowolnego organizmu i dowolnej rodziny genów.Jednym z częstych problemów podczas wykonywania bioinformatyki jest awaria skryptów powłoki. Próbując skorzystać z tego protokołu, upewnij się, że masz najnowsze oprogramowanie, przeczytaj pliki błędów i dokładnie sprawdź instrukcję. Aby rozpocząć, zaloguj się do konta klastra komputerowego w terminalu lub oknie aplikacji PuTTY.Na terminalu pobierz Toolkit w wersji 2.8.1 za pomocą Wget, a następnie zakończ instalację programu. Wyszukaj w NCBI numer dostępu dla żądanych próbek, a następnie uzyskaj dane sekwencji RNA w oknie terminala. Uzyskaj dwa pliki FASTQ dla typu plików sparowanych.Znajdź genom referencyjny online, jeśli taki istnieje. Aby uzyskać zestaw odniesienia, wpisz wget w oknie terminalu i wklej adres łącza. Jeśli to możliwe, skopiuj również plik GTF i plik FASTA białka dla genomu referencyjnego.Indeksuj genom, a następnie mapuj odczyty i obliczaj wyrażenie dla każdej próbki. Zmień nazwę pliku wyników na opisową i wygeneruj macierz wszystkich zliczeń. Otwórz okno przeglądarki internetowej i przejdź do NCBI GenBank.W pasku wyszukiwania wpisz nazwę interesującego Cię genu oraz nazwę blisko spokrewnionych gatunków, które zostały zsekwencjonowane. Po lewej stronie paska wyszukiwania wybierz Białko, a następnie kliknij w Szukaj. Wyodrębnij sekwencje, klikając przycisk Wyślij do, a następnie wybierz pozycję Plik.W obszarze Format wybierz opcję FASTA, a następnie kliknij przycisk Utwórz plik. Przenieś plik FASTA z homologami do klastra komputerowego za pomocą lokalnego okna terminala lub FileZilla. Następnie wyszukaj geny kandydujące za pomocą BLAST+Na klastrze komputerowym utwórz bazę danych BLAST z genomu lub białka transtranskryptomu, FASTA.Wyślij homologiczne sekwencje genów z NCBI do bazy danych interesujących gatunków, a następnie wyświetl plik wyjściowy za pomocą polecenia more. Skopiuj unikalne identyfikatory genów z interesujących gatunków do nowego pliku tekstowego. Wyodrębnij sekwencje genów kandydujących.Aby potwierdzić adnotację genu za pomocą Reciprocal BLAST, przejdź do narzędzia BLAST Local Alignment Search Tool, wybierz BLASTP, a następnie wklej kandydujące sekwencje, wybierz bazę danych nienadmiarowych sekwencji białek i kliknij BLAST. Otwórz MEGA, kliknij Wyrównaj, a następnie Edytuj wyrównanie kompilacji, wybierz Utwórz nową linię trasowania i kliknij OK. Wybierz opcję Białko. Gdy otworzy się okno Wyrównanie, kliknij Edytuj.Kliknij opcję Insert Sequences From File (Wstaw sekwencje z pliku) i wybierz FASTA z sekwencjami białek genów kandydujących i prawdopodobnych homologów. Wybierz opcję Wszystkie sekwencje. Znajdź symbol ramienia i najedź na niego kursorem.Powinien mówić wyrównaj sekwencje za pomocą algorytmu mięśniowego. Kliknij symbol ramienia, a następnie kliknij przycisk Wyrównaj białko, aby wyrównać sekwencje Edytuj parametry lub kliknij przycisk OK, aby użyć parametrów domyślnych. Protokół ten został zastosowany do tkanek Hydra vulgaris, która jest słodkowodnym bezkręgowcem należącym do gromady Cnidaria.Zbadano geny opsyny, aby uzyskać wgląd w ewolucję oczu i wykrywanie światła u zwierząt. Sekwencje genów związanych z opsyną H.vulgaris i innych gatunków zostały wyekstrahowane do pliku FASTA z NCBI GenBank. Geny opsyny zostały dopasowane w MEGA, co umożliwiło zidentyfikowanie opsyn Hydra, w których brakowało konserwatywnego aminokwasu lizyny niezbędnego do wiązania cząsteczki wrażliwej na światło.Drzewo maksymalnego prawdopodobieństwa zostało wygenerowane przy użyciu sekwencji opsyny z Hydra vulgaris i innych gatunków. Filogeneza sugeruje, że geny opsyny ewoluują przez duplikacje specyficzne dla linii u parzydełkowców i potencjalnie przez duplikację tandemową u H. vulgaris. Następnie przeprowadzono analizę różnicową ekspresji w edgeR w celu zbadania bezwzględnej ekspresji genów opsyny.Aby określić, czy jedna lub więcej opsyn jest regulowanych w górę w hypostomie lub głowie, przeprowadzono porównania parami hypostomu z kolumną ciała, strefą pączkowania, stopą i mackami. Stwierdzono, że 1 774 transkrypty były różnie wyrażane między hypostomem a kolumną ciała. Określono geny, które były regulowane w górę w wielu porównaniach, a następnie przeprowadzono funkcjonalne wzbogacenie w Blast2GO.Na koniec zbadano bezwzględną ekspresję genów opsyny w różnych tkankach na różnych etapach pączkowania i w różnych punktach czasowych regeneracji. Oględziny ułożenia i drzewa potwierdzą, czy geny kandydujące należą do rodziny będącej przedmiotem zainteresowania. Geny, które są zbyt różne w sekwencji lub należą do grupy poza wszystkim innym, są prawdopodobnie częścią innej rodziny genów.Wyniki tego protokołu można uznać za generujące hipotezy. To badanie może wyłonić geny kandydujące do funkcjonalnego zbadania w przyszłych badaniach. Po zbadaniu ekspresji opsyny Hydra, używamy teraz podobnych technik do badania powiązanych genów między gatunkami w celu zidentyfikowania podobieństw i różnic w funkcji.

a-bioinformatics-pipeline-for-investigating-molecular-evolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Tutaj prezentujemy podejście bioinformatyczne i analizy mające na celu zidentyfikowanie ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus.

Sekwencjonowanie RNA nowej generacji i proces bioinformatyczny w celu identyfikacji ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus

Przedstawiona tutaj jest stopniowa procedura różnicowania in vitro ludzkich pierwotnych keratynocytów poprzez hamowanie kontaktu, a następnie charakterystykę na poziomie molekularnym za pomocą analizy sekwencyjnej RNA.

Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Dostarczono szczegółowy protokół metod analizy różnicowej ekspresji dla sekwencjonowania RNA: limma, EdgeR, DESeq2.

Trzy metody analizy różnicowej ekspresji do sekwencjonowania RNA: limma, EdgeR, DESeq2

Protokół ten umożliwia początkową kontrolę jakości eksperymentów RNA-seq dla biologów laboratoryjnych z ograniczonym doświadczeniem w bioinformatyce.

Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów

W niniejszej pracy raportujemy wytworzenie rekombinazy Tre za pomocą ukierunkowanej ewolucji molekularnej. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i całkowitego usunięcia prowirusa z zainfekowanych ludzkich komórek. Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie niestandardowych enzymów, które posłużą jako narzędzia chirurgii molekularnej i...

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego

Poznaj potok bioinformatyczny do analizy ewolucji molekularnej i ekspresji genów kandydackich przy użyciu danych RNA-seq. Metoda obejmuje narzędzia BLAST, MEGA i edgeR do badania genów opsynowych u Hydra vulgaris.

Potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji RNA

Przeglądaj więcej filmów