Name: Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania komórek neuronalnych z krwi obwodowej bez modyfikacji genetycznych. Technika ta wykorzystuje sygnalizację błonowo-jądrową do generowania komórek pluripotencjalnych zastosowaniu w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Poświęcone pamięci doktora Rainera Saffricha.
Autorzy są szczególnie wdzięczni José Manuelowi Garcíi-Verdugo i Vicente Herranz-Pérezowi za przeprowadzenie eksperymentów i analiz EM w Laboratorium Neurobiologii Porównawczej, Instytucie Bioróżnorodności i Biologii Ewolucyjnej Cavanilles, University of Valencia, CIBERNED, Walencja, Hiszpania, które było wspierane przez finansowanie badań z Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Reszta tych prac była wspierana przez ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Niemcy.

Uzyskano zgody etyczne podczas przeprowadzania eksperymentów.
1. Izolacja ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC)
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszyscy dawcy podpisali świadomą zgodę przed pobraniem krwi zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Pobrać 30 ml krwi od zdrowych dawców przez przeszkolony personel medyczny zgodnie ze standardowym protokołem.</li>
	<li>Wyizolować PBMNC za pomocą ośrodków o gradiencie gęstości. Użyć 10 ml pożywki z 25 ml krwi w stosunku 1:1 rozcieńczonej solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i odwirować przy 300 x g przez 30 minut.</li>
	<li>Wyizolować warstwę interfazową między plazmą a ośrodkiem o gradiencie gęstości za pomocą pipetowania. Umyć wyizolowane komórki 5 ml sterylnego PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut. Powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Policz liczbę komórek standardowymi metodami przy użyciu komory zliczającej.</li>
</ol>
2. Aktywacja ludzkiej glikoproteiny zakotwiczonej w GPI poprzez sieciowanie przeciwciał na powierzchni PBMNC
<ol>
	<li>Umieścić 6 x 106 komórek jednojądrzastych (MNC) w probówkach o pojemności 15 ml i przeprowadzić sieciowanie przeciwciał poprzez inkubację komórek z ludzkim przeciwciałem specyficznym dla białka błonowego połączonego z GPI (30 μg/ml) przez 30 minut w PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zastąp pożywkę inkubacyjną zmodyfikowaną pożywką Dulbecco firmy Iscove uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Hoduj komórki w probówkach polistyrenowych o pojemności 15 ml, umieść probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 8-10 dni (bez wstrząsania). Na D5 dodaj dodatkowe 1-2 ml pożywki Iscove uzupełnionej 10% FBS do każdej 15 ml probówki.</li>
</ol>
3. Sortowanie nowo wygenerowanych komórek odróżnicowanych
<ol>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (18 μl zawiesiny komórek + 2 μl barwnika fluorescencyjnego) lub w komorze zliczającej.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek hodowlanych (5-7 x 106) przy 300 x g przez 10 minut i odessać otrzymany supernatant sterylną pipetą Pasteura.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 μl wstępnie schłodzonego PBS o pH 7,2, 0,5% BSA i 2 mM EDTA.</li>
	<li>Dodać dodatnie nanokulki magnetyczne CD45 (80 μl) do zawiesiny komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu PBS.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 500 μl wstępnie schłodzonego buforu PBS i umieścić go w polu magnetycznym.</li>
	<li>Umieścić zawiesinę komórek na kolumnie i przemyć ją 500 μl buforu PBS (dwa razy) i przepływem wirówki zawierającym komórki CD45 ujemne. Zbierz je w pożywce Iscove uzupełnionej 1% BSA.</li>
	<li>Policz komórki w komorze liczącej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie naczyń z hodowli komórkowych do różnicowania neuronów nowo powstałych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Pokryj naczynia hodowlane poli-L-ornityną i lamininą w celu wyhodowania komórek neuronalnych.</li>
	<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe na płytkach 4-dołkowych i pokryć je rozcieńczoną w stosunku 1:5 poli-L-ornityną (0,1 mg/ml wddH2O) wddH2O. Umieścić szkiełka nakrywkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Następnie umyć z ddH2O.</li>
	<li>Powoli rozmrażaj lamininę (0,5-2,0 mg/ml) i dodaj do wierzchu szkiełek nakrywkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do indukcji neuronalnej N2 składającą się z 49 ml D-MEM/F12, 500 μl suplementu N2, 400 μl aminokwasów endogennych (NEAA), zasadowego roztworu FGF o stężeniu końcowym 20 ng/ml (przygotowanego ze 100 μg/ml roztworu podstawowego) i heparyny o stężeniu końcowym 2 ng/ml.</li>
	<li>Usunąć nadmiar lamininy przez pipetowanie i dodać pożywkę neuronalną N2 do szalek hodowlanych.</li>
</ol>
5. Hodowla neuronalnych odróżnicowanych komórek krwi
<ol>
	<li>Hodowla komórek CD45 ujemnych pochodzących z BD na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą/ornityną przez 2 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce N2 w celu zainicjowania różnicowania neuronalnego nowo wytworzonych komórek BD.</li>
	<li>Hodowla komórek dalej w pożywce różnicowania neuronów składającej się z 48 ml pożywki neurobazalnej, 500 μl L-glutaminy, 1 ml suplementu B27, 500 μl NEAA, 50 μl rekombinowanego ludzkiego czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF) w stężeniu 5 μg/250 μl w PBS/0,1% BSA i 50 μl rekombinowanego czynnika neurotroficznego pochodzącego z ludzkiego mózgu (BDNF) w ssu 5 μg/200 μl w PBS/0,1% BSA i 50 μl roztworu kwasu askorbinowego 2,9 g/50 ml w PBS. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Analiza mikroskopii immunofluorescencyjnej komórek nerwowych pochodzących z krwi
<ol>
	<li>Hodować komórki zgodnie z powyższym opisem przez 16 dni i usunąć pożywkę.
	<ol>
		<li>Inkubować z podgrzanym utrwalaczem składającym się z 75 ml sterylnej wody, 4 g paraformaldehydu. W razie potrzeby dodać 10 N NaOH i mieszać, aż roztwór się klaruje. Następnie dodaj 10 ml 10 x PBS, 0,5 ml MgCl2, 2 ml 0,5 M EGTA i 4 g sacharozy. Miareczkować do pH 7,4 za pomocą 6 N HCl i doprowadzać do 100 ml sterylnej wody przez 15 minut, zgodnie z Marchenko et al.7.</li>
		<li>Wyrzuć utrwalacz i umyj komórki 3 razy przez 5 minut za każdym razem. Natychmiast dodaj świeżo przygotowany 0,3% roztwór Triton X i przepuszczaj komórki przez 5 minut. Umyj 3 razy PBS i dodaj roztwór blokujący wykonany z PBS i 5% BSA.</li>
		<li>Zablokuj komórki w temperaturze pokojowej na płycie kołyskowej na 1 godzinę.</li>
		<li>Przygotować odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał w 1% BSA/PBS i inkubować komórki z rozcieńczonymi przeciwciałami na płytce kołyskowej przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki 3 razy PBS przez 5 minut każda, inkubować komórki za pomocą DAPI i zamontować szkiełka nakrywkowe z mediami montażowymi do wizualizacji pod mikroskopem. 
		UWAGA: Bezpośrednio znakowane przeciwciała użyte w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza nowo wygenerowanych komórek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki do TEM w 8-dołkowych szkiełkach komorowych.</li>
	<li>Utrwalić komórki w 3,5% aldehydzie glutarowym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, po utrwaleniu w 2% OsO4 przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej i zabarwić w 2% octanie uranylu w ciemności w temperaturze 4 °C przez 2 godziny 30 min.</li>
	<li>Na koniec opłucz komórki w wodzie destylowanej, odwodnij je w etanolu i zanurz na noc w żywicy epoksydowej. Następnego dnia przenieść próbki do pieca o temperaturze 70 °C na 72 godziny w celu utwardzenia żywicy.</li>
	<li>Odłącz osadzone kultury komórkowe od szkiełka komorowego i przyklej do bloków aralditowych.</li>
	<li>Wytnij seryjnie półcienkie odcinki (1,5 μm) za pomocą maszyny, zamontuj na szkiełkach i lekko zabarwij 1% błękitem toluidynowym.</li>
	<li>Przyklej wybrane półcienkie odcinki do bloków aralditowych i oderwij je od szkiełka poprzez wielokrotne zamrażanie (w ciekłym azocie) i rozmrażanie.</li>
	<li>Przygotować ultracienkie skrawki (0,06-0,08 μm) za pomocą maszyny i dalej skontrastować z cytrynianem ołowiu.</li>
	<li>Uzyskaj mikrofotografie za pomocą elektronowego mikroskopu skaningowego z kamerą cyfrową.</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glial%22%5BJournal%5D)">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

Autorka korespondencyjna oświadcza, że jest posiadaczką patentu związanego z Novel Human GPI-linked Protein, a także współzałożycielką i pracuje dla ACA CELL Biotech. Pozostali autorzy deklarują, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Niemodyfikowana genetycznie metoda przeprogramowania komórek ludzkich opisana w tej pracy opiera się na aktywacji przez błonę do jądra maszynerii sygnalizacyjnej za ludzką glikoproteiną błonową połączoną z GPI, która inicjuje proces dedyferencjacji prowadzący do generowania ex vivo i ekspansji samoodnawiających się PSC uzyskanych z niemanipulowanej ludzkiej krwi obwodowej. Komórki te, gdy są hodowane w odpowiednich pożywkach, są zdolne do ponownego różnicowania się w komórki należące do różnych listków rozrodczy...

Rozwój podstawowych i przedklinicznych metod badań nad komórkami macierzystymi zachęca do klinicznego zastosowania terapii opartych na komórkach macierzystych w chorobach neurologicznych. Taka potencjalna terapia zależy w decydującym stopniu od metody generowania ludzkich komórek nerwowych prowadzących do funkcjonalnego odzyskiwania1.
Neuronalne komórki macierzyste (NSC) samoodnawiają się i różnicują w nowe neurony przez całe życie w procesie zwanym neurogenezą dorosłych. Tylko bardzo ograniczone obszary mózgu są siedliskiem NSC zdolnych do generowania neuronów noworodków w wieku dorosłym. Takie NSC mogą dać początek dojrzałym neuronom, które biorą udział w uczeniu się i pamięci, zastępując w ten sposób utracone lub uszkodzone neurony. Niestety, te NSC są obecne w ograniczonych ilościach, a ta ograniczona neurogeneza gwałtownie spada podczas rozwoju młodocianego2. Dlatego w celu terapii komórkowej należy wziąć pod uwagę inne źródła komórek nerwowych.
Zwyrodnieniowe choroby neurologiczne są trudne do wyleczenia przy użyciu standardowych metod farmakologicznych. Nowe strategie terapeutyczne mające na celu objęcie wielu nieuleczalnych zaburzeń neurologicznych opierają się na terapiach wymiany komórek chorej i uszkodzonej tkanki. Przeszczep NSC może zastąpić uszkodzone komórki i przynieść korzystne efekty. Inne źródła wymiany komórek nerwowych obejmują ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ESC), które pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej blastocyst ssaków3, a także iPSCs4, które mają dużą zdolność do samoodnawiania się, podobnie jak ESC, i są zdolne do różnicowania się w różne linie komórkowe. NSC mogą być również generowane przez bezpośrednie przeprogramowanie z ludzkich fibroblastów, unikając stanu pluripotencjalnego5.
Terapia wymiany komórek jest nadal trudnym problemem. Chociaż ESC, płód lub iPS mogą być źródłem generowania komórek neuronalnych do leczenia wielu nieuleczalnych chorób neurologicznych, autologiczna wymiana uszkodzonych tkanek przez dorosłe komórki SC jest lepszą alternatywą, która pozwala obejść obawy immunologiczne, etyczne i bezpieczeństwa.
Aktywacja ludzkiego białka połączonego z GPI poprzez sieciowanie przeciwciał poprzez fosforylację PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicjuje dedyferencjację komórek progenitorowych krwi i generowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzenia krwi (BD-PSCs)6. Komórki te różnicują się in vitro w kierunku komórek neuronalnych, co potwierdzono za pomocą analizy jasnego pola, immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
W tej pracy opisujemy wolne od GMO pokolenie BD-PSC i ich udane ponowne różnicowanie się w komórki o fenotypie neuronalnym.

<table><tbody><tr><td>Albumina Frakcja V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat anty-GFAP Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3418A5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td><td>BD Pharmingen</td><td>560381</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do badania żywotności komórek AO/PI</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym wycofany z produkcji. Produkt wyprodukowany przez firmę Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy 2-fosforan sequimagnes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 Bez surowicy 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy roztwór FGF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td><td>Merck Millipore</td><td>L6115-BC</td> gradient <td>gęstości</td></tr><tr><td>BSA Frac V 7,5%</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>nano-sized kulki magnetyczne</td></tr><tr><td>Szkiełka do liczenia komórek Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym wycofane z produkcji. Produkt wyprodukowany przez firmę Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Prowadnice komorowe Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td> żywica <td>epoksydowa</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Wycofane z produkcji. Dostępne pod: TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF rekombinowany człowiek</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-glutamina</td></tr><tr><td>Aldehyd glutowy klasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Human BDNF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td><td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Laminin</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Automatyczny licznik komórek</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym wycofany z produkcji. Produkt wyprodukowany przez firmę Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Bufor MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml; ulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy Morada</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 dołki</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplement 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterylne</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue-3 Loctite</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td><td>FEI Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracut UC-6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez gmo

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Wiele ludzkich zaburzeń neurologicznych jest spowodowanych degeneracją neuronów i komórek glejowych w mózgu. Ze względu na ograniczenia w farmakologicznych i innych strategiach terapeutycznych, obecnie nie ma lekarstwa na uszkodzony lub chory mózg. Wymiana komórek wydaje się być obiecującą strategią terapeutyczną w chorobach neurodegeneracyjnych. Do dnia dzisiejszego neuronalne komórki macierzyste (NSC) są z powodzeniem generowane z tkanek płodowych, ludzkich komórek embrionalnych (ES) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Proces odróżnicowania został zainicjowany przez aktywację nowej ludzkiej glikoproteiny połączonej z GPI, która prowadzi do powstania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Te pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzenia krwi (BD-PSC) różnicują się in vitro w komórki o fenotypie neuronalnym, jak wykazano za pomocą mikroskopii jasnego pola i immunofluorescencji. Analiza ultrastrukturalna tych komórek za pomocą mikroskopii elektronowej potwierdza ich pierwotną budowę, a także morfologię neuronalną i charakterystykę subkomórkową.

Wyniki dostarczają dowodów na to, że ta nowatorska metoda wolna od GM jest w stanie przywrócić komórki progenitorowe krwi do ich najbardziej prymitywnego stanu bez bezpośredniego oddziaływania na ludzki genom.
Wcześniej wykazaliśmy, że sieciowanie przeciwciał specyficznych dla białek zakotwiczonych przez GPI inicjuje poprzez PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN nadekspresję wysoce konserwatywnych genów istotnych dla rozwoju, takich jak WNT, NOTCH i C-Kit, zapoczątkowując tym samym proces dedyferen...

Prezentujemy metodę bez modyfikacji genetycznie (GMO) do uzyskania komórek z fenotypem neuronalnym z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej. Aktywacja szlaku sygnałowego powiązanego z nowym ludzkim białkiem połączonym z GPI ujawnia skuteczną, wolną od GMO metodę pozyskiwania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Znaczenie protokołu opiera się na sygnalizacji błona-jądro i nie wpływa bezpośrednio na genom, jak ma to miejsce w przypadku indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest nieteratogenny charakter pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi, dzięki czemu nadaje się ona do bezpiecznego zastosowania klinicznego w różnych dziedzinach medycyny regeneracyjnej. Procedurę demonstrują dr Anne-Kathrin Schott, liderka projektu, oraz Oksana Greenacre, asystentka laboratoryjna w moim laboratorium.Aby wyizolować PBMNC, dodaj 25 mililitrów krwi jeden do jednego rozcieńczonej PBS do 10 mililitrów pożywki o gradientzie gęstości i odwiruj mieszaninę w temperaturze 300 razy G przez 30 minut. Wyizolować warstwę graniczną między plazmą a ośrodkiem o gradiencie gęstości za pomocą pipetowania. Umyj wyizolowane komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut.Po dwukrotnym powtórzeniu procedury policz liczbę komórek za pomocą komory zliczającej. Dodaj 6 na 10 do szóstych komórek jednojądrzastych do 15-mililitrowej probówki, a następnie wykonaj sieciowanie przeciwciał, dodając ludzkie przeciwciało specyf

gm-free-generation-of-blood-derived-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Ten film demonstruje technikę generowania komórek neuronalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi (BD-PSC). BD-PSC uzyskuje się poprzez przeprogramowanie komórek progenitorowych krwi. Niezróżnicowane BD-PSC są hodowane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych substratem do hodowli komórkowych przy użyciu pożywki do indukcji neuronalnej i pożywki do różnicowania neuronalnego, wywołując różnicowanie w komórki o fenotypie neuronalnym.

Generowanie komórek neuronalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzenia krwionośnego

Film pokazuje generowanie neuronów z dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych (aHDF). aHDF są przeprogramowywane przy użyciu wektora lentiwirusowego przenoszącego geny neuronalnych czynników transkrypcyjnych i krótkich RNA spinki do włosów (shRNA). ShRNA hamują ekspresję neuronalnego represora transkrypcyjnego, a neuronalne czynniki transkrypcyjne aktywują geny do różnicowania aHDF w neurony. Te przeprogramowane aHDF są hodowane we wczesnej i późnej pożywce konwersji neuronalnej w celu...

Generowanie neuronów poprzez przeprogramowanie ludzkich komórek fibroblastów skóry

Źródło: Becker-Kojić, Z. A.,  i inni. al., Wolne od GMO pokolenie komórek neuronalnych pochodzących z krwi. J. Vis. Exp. (2021)Film przedstawia protokół przygotowania komórek nerwowych pochodzących z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej do mikroskopii fluorescencyjnej, prezentując różne typy komórek i etapy rozwoju za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego.

Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek nerwowych zróżnicowanych z obwodowych komórek krwiopochodnych 

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Ten artykuł opisuje protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w laboratoryjnym bioreaktorze zawiesinowym 3D.

Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do tworzenia ludzkich komórek mikrogleju (iMG) pochodzących z monocytów, które umożliwiają pośrednią ocenę stanu zapalnego mózgu. Przedstawia to model komórkowy, który może być korzystny dla badań koncentrujących się na potencjalnym zapaleniu mózgu i związanych z nim zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

Poznaj metodę wytwarzania komórek neuronalnych z krwi obwodowej bez modyfikacji genetycznych. Technika ta wykorzystuje sygnalizację błonowo-jądrową do generowania komórek pluripotencjalnych zastosowaniu w medycynie regeneracyjnej.

Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Przeglądaj więcej filmów