Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9
10 września 2020
CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.
Protokół ten jest istotny, ponieważ zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania i wstrzykiwania zarodków komarów do edycji genomu CRISPR-Cas9. Głównymi zaletami tej techniki mikroiniekcji jest to, że ma ona wysoki wskaźnik przeżywalności komarów i pozwala naukowcom określić funkcję genu. Protokół ten został specjalnie dostosowany do wstrzykiwania komarów należących do rodzaju Culex.
Komary te przenoszą kilka patogenów, w tym wirusy wywołujące gorączkę Zachodniego Nilu i zapalenie mózgu St. Louis, a także nicienie filarialne, które powodują dirofilariozę psów i słoniowaciznę. Dlatego posiadanie narzędzi takich jak edycja genomu CRISPR-Cas9 pozwoli nam lepiej zrozumieć i kontrolować te ważne czynniki chorobowe. Wstrzykiwanie świeżo złożonych zarodków owadów i uzyskanie wyższego wskaźnika przeżycia wymaga dużo czasu, praktyki i cierpliwości.
Dlatego zalecamy wstrzyknięcie kilku zarodków kolorowego roztworu soli fizjologicznej przed wstrzyknięciem drogich materiałów w celu wywołania mutacji. Rozpocząć od ponownego wypełnienia igieł iniekcyjnych mieszanką do wstrzykiwań. Wybierz igłę do wypełniania lub końcówkę do napełniania żelem, która z łatwością zmieści się w tylnej części wybranej igły iniekcyjnej.
Należy upewnić się, że między końcem wypełniacza igły a igłą do wstrzykiwań jest trochę wolnego miejsca. Ostrożnie nasycić, pojedynczą małą kroplę wstrzykiwacza wmieszać do igły iniekcyjnej w pobliżu miejsca, w którym zaczyna się ona zwężać. Następnie przymocuj igłę do iniekcji do mikrowtryskiwacza.
Umieścić szkiełko zawierające zarodki na stoliku mikroskopu. Aby otworzyć igłę, należy użyć początkowego ciśnienia wtrysku wynoszącego około 30 psi i w razie potrzeby dostosować je do dostarczenia odpowiedniej objętości mieszanki do wstrzykiwań. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść igłę nad zarodkiem komara i ostrożnie użyj mikromanipulatora, aby opuścić igłę na zarodek.
Gdy igła ledwo dotyka zarodka, szybko przesuń zarodek prostopadle do długiej osi igły. Aby ustalić, czy igła została pomyślnie otwarta, należy nacisnąć spust wstrzykiwania i sprawdzić, czy z igły nie wydostają się pęcherzyki powietrza lub mieszanka do wstrzykiwań. Jeśli nie, należy powtarzać przesuwanie zarodka komara przy igle, aż zostanie ona otwarta, a mieszanina do wstrzykiwań wydostanie się na zewnątrz po naciśnięciu spustu.
Umieść pierwszy zarodek komara na środku view, upewnij się, że jest ostry i umieść igłę nad pierwszym jajem. Stopniowo zwiększaj powiększenie mikroskopu, ostrożnie obniżając igłę, aby utrzymać ją tuż nad pierwszym zarodkiem. Kontynuuj, aż mikroskop osiągnie największe powiększenie i zarówno zarodek, jak i igła będą ostre.
Przesunąć zarodek lekko w lewo i opuścić igłę tak, aby znajdował się w tej samej płaszczyźnie view co zarodek. Użyj stolika mikroskopowego, aby delikatnie dotknąć zarodka do końcówki igły. Wąski tylny koniec zarodka komara powinien się lekko odchylić.
Za pomocą stolika mikroskopowego przesuń tylny koniec zarodka na igłę i obserwuj, jak igła przenika przez kosmówkę jaja komara. Igła powinna po prostu wbić się w błonę i przybliżoną lokalizację komórek biegunowych w zarodku. Umieszczenie mieszanki iniekcyjnej w tym regionie zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji i odziedziczenia ich w linii zarodkowej.
Pociągnąć za spust wstrzykiwań od jednego do trzech razy, aby wstrzyknąć mieszankę do wstrzykiwań do zarodka. Dostarczyć niewielką ilość mieszanki do wstrzykiwań, tylko tyle, aby można było wykryć niewielkie prześwity w osoczu zarodka. Użyj stolika, aby przesunąć zarodek w prawo, na zewnątrz i poza końcówkę igły.
Jeśli wstrzyknięcie poszło dobrze, z zarodka powinno wyciekać niewiele płynu lub nie powinno go wcale wyciekać. Przesunąć stolik w dół, tak aby następny zarodek znalazł się przed igłą. I powtórzyć wstrzyknięcie.
Jeśli wydaje się, że mieszanka do wstrzykiwań nie wypływa na zewnątrz lub jeśli po wyjęciu igły z zarodka wydostaje się duża ilość płynu, należy wymienić igłę do wstrzykiwań i rozpocząć od nowa. Zniszcz wszystkie niewstrzyknięte lub uszkodzone jaja. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków na szkiełku zmyj olej halowęglowy, nakładając wodę z odwróconej osmozy za pomocą butelki ze spryskiwaczem.
Skieruj strumień wody na wierzch szklanego szkiełka nakrywkowego nad wstrzykniętymi zarodkami i pozwól, aby woda spłynęła po szkiełku nakrywkowym, uważając, aby nie skierować strumienia na zarodki. Przykryj szkiełko 150 mikrolitrami wody i umieść je na mokrej bibule filtracyjnej wewnątrz kwadratowej szalki Petriego. Inkubuj szalkę Petriego w komorze środowiskowej ustawionej na 25 do 27 stopni Celsjusza i 70 do 80% wilgotności względnej z długodziennym fotoperiodem.
Protokół ten został wykorzystany do skutecznego wstrzykiwania zarodków północnego komara domowego, Culex pipiens, zapewniając, że przedni koniec zarodka komara wykracza poza pasek opatrunku medycznego, znacznie zwiększając przeżywalność larw i skutkując wysokiej jakości potomstwem, które jest zdolne do rozwoju do dorosłości i rozmnażania. Sekwencjonowanie ujawniło, że około 10% przebadanych komarów wykazało niewielką insercję lub delecję w pobliżu miejsca cięcia Cas9 pierwszego przewodnika RNA, co sugeruje, że komórki biegunowe były skutecznie celowane podczas mikroiniekcji. Osobniki F1 z powodzeniem kojarzyły się i wydały zdolne do życia potomstwo, z których niektóre również zawierały mutację.
Podczas mikroiniekcji zarodków owadów większość ludzi ma trudności z początkowym otwarciem igły i przeniesieniem zarodka na igłę. Pamiętaj, że rozwijanie tych umiejętności wymaga czasu i praktyki. Protokół ten może być modyfikowany lub dostosowywany do wstrzykiwania zarodków innych komarów, a nawet innych gatunków owadów.
Poza wykorzystaniem tego protokołu do nokautowania genów za pomocą ukierunkowanej edycji genomu CRISPR-Cas9, te same techniki mogą być używane do wstrzykiwania plazmidów lub transpozonów w celu wyeliminowania genów lub wygenerowania losowych mutacji. Moje laboratorium wykorzystuje obecnie tę technikę, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób komary mierzą codziennie i regulują swoje sezonowe reakcje. Jednak w jaki sposób my, naukowcy, wykorzystujemy edycję genomu CRISPR-Cas9, aby lepiej zrozumieć biologię kilku organizmów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wykorzystania edycji genomu CRISPR/Cas9 do tworzenia linii z nokautem genu u Culex pipiens, gatunku komara przenoszącego szereg patogenów. Szczegółowo przedstawiono przygotowanie i mikroiniekcję embrionów komarów, co zapewnia wysoką przeżywalność i ułatwia analizę funkcji genów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Edycja genomu CRISPR/Cas9
- Kontrola wektorów i zapobieganie chorobom
- Embriologia owadów
Wstęp
- Culex pipiens jest ważnym wektorem wielu chorób.
- Identyfikacja funkcji genów jest kluczowa dla zrozumienia transmisji patogenów.
- Techniki mikroiniekcji zwiększają wydajność modyfikacji genetycznych.
Zastosowane metody
- Mikroiniekcja embrionów komarów
- Culex pipiens jako model biologiczny
- System CRISPR/Cas9 do celowanej edycji genomu
Główne wyniki
- Pomyślna iniekcja doprowadziła do tego, że około 10% przebadanych komarów wykazywało docelowe mutacje.
- Osiągnięto wysoką przeżywalność larw, co pozwoliło na uzyskanie żywotnego potomstwa.
- Mutacje zostały przekazane poprzez linię zarodkową osobnikom w pokoleniu F1.
Wnioski
- Badanie to wykazuje możliwość zastosowania systemu CRISPR/Cas9 w badaniach nad funkcjami genów u Culex pipiens.
- Opisany protokół ma istotne znaczenie dla strategii kontroli wektorów w ramach zwalczania chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Edycja genów za pomocą systemu CRISPR/Cas9 u komarów będących wektorami chorób umożliwia walidację celów oraz badania z zakresu genomiki funkcjonalnej w kontekście transmisji patogenów. Niniejszy protokół wspiera analizę mechanistyczną poprzez ustanowienie transmisji mutacji w linii zarodkowej u Culex pipiens, kluczowego wektora wirusa zachodniego Nilu oraz nicieni filaryowych. Podejście to zapewnia skalowalną platformę do screeningu fenotypowego i identyfikacji wiodących celów w badaniach nad kontrolą wektorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji genów u komarów pełniących rolę wektorów w celu walidacji celów zaangażowanych w transmisję patogenów.
- Wartość operacyjna: Pozwala na uzyskanie ok. 10% poziomu mutacji w badanych embrionach, co wspiera efektywne procesy walidacji celów.
- Wartość prognostyczna: Transmisja mutacji w linii zarodkowej u potomstwa F1 potwierdza aktywność celowaną oraz dziedziczność niezbędną do oceny fenotypowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Mikroiniekcja kompleksów Cas9/gRNA do embrionów generuje mutacje ukierunkowane w konkretne miejsce w celu przeprowadzenia badań przesiewowych funkcji genów.
- Wartość operacyjna: Wysoki wskaźnik przeżywalności embrionów po iniekcji umożliwia skalowalne badania przesiewowe wstrzykniętych kohort.
- Gotowość do analizy: Protokół obejmuje przygotowanie igieł, ustawienie embrionów oraz parametry iniekcji, aby zapewnić powtarzalność pomiędzy seriami pomiarowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wygenerowane linie mutantów pozwalają na badanie roli genów w kompetencji wektorowej w odniesieniu do patogenów, takich jak wirus Nilu Zachodniego i nicienie filariozy.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Mutacje dziedziczone w linii zarodkowej umożliwiają podłużną analizę fenotypową na przestrzeni wielu pokoleń.
- System istotny dla chorób: Model Culex pipiens umożliwia ocenę celów genetycznych istotnych dla strategii kontroli wektorów.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając walidację celu, przesiew fenotypowy oraz badania mechanistyczne w przypadku owadów będących wektorami chorób.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez nokaut genów w celu wyjaśnienia ich roli w szlakach przenoszenia patogenów.
- Przesiewanie: Generuje ilościowe odczyty mutacji (np. częstość występowania indeli) w celu porównania skuteczności gRNA i wydajności edycji.
- Analityka: Sekwencjonowanie osobników F0 i F1 dostarcza mierzalnych wyników służących do oceny precyzji edycji oraz transmisji w linii zarodkowej.
- Badania translacyjne: Linie mutantów ułatwiają przedkliniczną ocenę funkcji genów w kompetencji wektora i interakcji z patogenem.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Standaryzowany schemat mikroiniekcji może być adaptowany dla różnych gatunków komarów i modeli owadziego, co umożliwia ponowne wykorzystanie platformy.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez mutacje dziedziczne w linii zarodkowej oraz przesiew fenotypowy.
- Wartość operacyjna: Wysokie wskaźniki przeżywalności i powtarzalne parametry iniekcji zwiększają przepustowość i ograniczają marnotrawstwo zasobów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji typu go/no-go w zakresie priorytetyzacji celów poprzez powiązanie funkcji genu z kompetencją wektora.
- Wpływ na portfolio: Dostosowany do ryzyka postęp w rozwoju kandydatów do kontroli wektorów w oparciu o zwalidowane mechanistyczne spostrzeżenia.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu embriologii komarów, technik mikrowstrzykiwania oraz przygotowania odczynników CRISPR/Cas9.
- Metoda jest uzależniona od aparatury do mikrowstrzykiwania, zestawu mikroskopowego oraz kontroli środowiskowej inkubacji embrionów.
- Konieczna jest standaryzacja w obrębie zespołów w zakresie obchodzenia się z embrionami, ciśnienia wstrzykiwania i przygotowania igieł w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych gatunków komarów może wymagać optymalizacji czasu zbierania embrionów oraz parametrów wstrzykiwania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od umiejętności technicznych w zakresie udrażniania igieł i ustawiania embrionów, co wpływa na wskaźnik sukcesu wstrzykiwania.
