Name: Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Naucz się mikroinjekcji zarodków komarów Culex pipiens przy użyciu CRISPR/Cas9 do edycji genomu. Ta metoda umożliwia tworzenie linii z mutacjami zerowymi z wysoką przeżywalnością larw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Davidowi O'Brochcie i wszystkim członkom Sieci Koordynacyjnej Badań nad Technologiami Genetycznymi Owadów za pomoc i szkolenia, które zapewniają nam i innym w zakresie wdrażania technologii genetycznych. Szczególnie dziękujemy Channie Aluvihare za optymalizację protokołu mikromanipulacji, aby umożliwić wstrzykiwanie i wykluwanie się zarodków Culex. Dziękujemy również Devante Simmonsowi i Josephowi Urso, studentom pracującym w laboratorium Meuti, za ich pomoc w opiece i badaniach przesiewowych transgenicznych komarów, a także Zorze Elmkami z ITF za pomoc w hodowli i przygotowaniu komarów do wstrzyknięcia. Prace te zostały wsparte grantem Interdisciplinary Seeds z Instytutu Chorób Zakaźnych OSU przyznanym MEM.

<ol><li>Hamer, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+a+bridge+vector+of+West+Nile+virus+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).</li>
<li>Bailey, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+St.+Louis+encephalitis+virus+from+overwintering+Culex+pipiens+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes.</a> Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).</li>
<li>Sabry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+realistic+index+of+experimental+transmission+efficiency+for+Bancroftian+filariasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis.</a> The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).</li>
<li>Cancrini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+albopictus+and+Culex+pipiens+implicated+as+natural+vectors+of+Dirofilaria+repens+in+central+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy.</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).</li>
<li>Wilton, D. P., Smith, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+diapause+in+three+geographic+strains+of+Culex+pipiens+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).</li>
<li>Mattingly, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Culex+pipiens+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Entomological+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">The Culex pipiens complex.</a> Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).</li>
<li>Eldridge, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+photoperiod+on+blood-feeding+and+ovarian+development+in+mosquitoes+of+the+Culex+pipiens+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).</li>
<li>Spielman, A., Wong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+ovarian+diapause+in+Culex+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens.</a> Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).</li>
<li>Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+host+preferences+of+above-and+below-ground+Culex+pipiens+mosquitoes+and+their+hybrid+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Veterinary+Entomology%22%5BJournal%5D)">Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring.</a> Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).</li>
<li>Meola, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+and+humidity+on+embryonic+longevity+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti.</a> Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).</li>
<li>Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+efficient+genomic+editing+system+with+CRISPR%2FCas9+in+the+vector+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus.</a> Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).</li>
<li>Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+causality+between+CYP9M10+and+pyrethroid+resistance+using+the+TALEN+and+CRISPR%2FCas9+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies.</a> Scientific Reports. 6, 24652(2016).</li>
<li>Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).</li>
<li>Anderson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+the+West+Nile+Virus+vector%2C+Culex+quinquefasciatus+Say%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say.</a> PloS one. 14 (11), (2019).</li>
<li>Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).</li>
<li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li>
<li>Monnerat, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+albitarsis+embryogenesis%3A+morphological+identification+of+major+events%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).</li>
<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilia+sericata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae).</a> Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).</li>
<li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2FCas9+plasmids+for+rapid+and+versatile+genome+editing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+genome+editing+using+RNA-guided+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
</ol>

RH pracuje dla Zakładu Transformacji Owadów, który świadczy usługi w zakresie modyfikacji genetycznej owadów.

Protokół ten przedstawia metody wprowadzania określonych mutacji do genomu komarów Culex i może być również stosowany do edycji genomu innych komarów. Protokół jest istotny, ponieważ zawiera szczegółowe informacje nie tylko na temat przygotowania materiałów do wstrzykiwań, ale także szczegółowy przegląd wideo na temat tego, jak nakłonić komary do złożenia jaj, a także jak przygotować i wstrzyknąć te jaja. Podsumowujemy również, jak wykorzystać biologię samic Cx. pipiens do składania jaj w pojedynczych t...

Komary Culex są rozmieszczone w umiarkowanych i tropikalnych regionach świata i przenoszą kilka śmiertelnych wirusów, w tym wirusa Zachodniego Nilu1, St. Louis encephalitis class2 a także nicienie filarialne, które powodują dirofilariozę psów3 i słoniowacizna4. Członkowie kompleksu Culex pipiens, który obejmuje Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens i Cx. pipiens molestus, wykazują uderzające różnice w wielu aspektach swojej biologii. Na przykład, podczas gdy Cx. quinquefasciatus i Cx. pipiens molestus nie są w stanie wejść w stan spoczynku zimowego5,6, Cx. pipiens pipiens wykazują silne odpowiedzi sezonowe i wchodzą w diapauzę w odpowiedzi na krótkie dni7,8. Dodatkowo, Cx. pipiens molestus wydają się być bardziej antropofilne, podczas gdy Cx. pipiens i Cx. quinquefasciatus są bardziej zoofilne6. Jednak w Stanach Zjednoczonych i w wielu innych miejscach na świecie gatunki te krzyżują się, co ma silne implikacje dla przenoszenia chorób jako hybrydy Cx. pipiens pipiens i Cx. pipiens molestus są oportunistycznymi żywicielami i gryzą zarówno ptaki, jak i ludzi9, służąc w ten sposób jako wektory pomostowe dla wirusa Zachodniego Nilu. Studiowanie tych i innych fascynujących aspektów biologii komarów Culex było utrudnione, częściowo dlatego, że komary Culex są nieco trudniejsze do wyhodowania w laboratorium niż komary Aedes, które produkują jaja w stanie spoczynku i odporne na wysuszenie10 oraz dlatego, że funkcjonalne narzędzia molekularne nie są tak dobrze rozwinięte dla gatunków Culex.
Edycja genomu CRISPR/Cas9 to potężna technologia, która została wykorzystana do oceny biologii kilku ważnych gatunków komarów11,12,13, w tym południowego komara domowego, Culex quinquefasciatus14,15,16. Ta technologia, opracowana przez Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier, wykorzystuje naturalną obronę bakteryjną przed wirusami przez endonukleazy pochodzenia bakteryjnego i związanego z CRISPR (białka Cas; patrz recenzja Van der Oost i wsp.17). Po wstrzyknięciu do zarodków zwierzęcych białka Cas9 w połączeniu z odpowiednim przewodnikiem RNA mogą powodować dwuniciowe pęknięcia w genomie. Najczęściej odbywa się to za pomocą białka Cas9, które jest skompleksowane z przewodnikowymi RNA, które kieruje aktywność endonukleazy do określonego regionu genomu. Po tym, jak białko Cas9 wytworzy specyficzne dla miejsca dwuniciowe pęknięcie, maszyneria komórkowa próbuje naprawić pęknięcie za pomocą jednego z dwóch mechanizmów. Pierwsza polega na podwiązaniu dwóch końców razem poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), które jest podatne na błędy i często powoduje insercje i delecje poza ramką w genomie, co może skutkować niefunkcjonalnymi białkami, generując w ten sposób mutację nokautującą. Alternatywnie, maszyneria komórkowa może wykorzystywać naprawę kierowaną homologią (HDR), znajdując podobne sekwencje w celu prawidłowej naprawy przerwy. Podobną sekwencję może zapewnić drugi chromosom w organizmie (patrz review18). Jeśli jednak naprawiona sekwencja dokładnie pasuje do oryginalnej sekwencji, białko Cas9 będzie w stanie ponownie przeciąć DNA. Alternatywnie, naukowcy mogą również dołączyć plazmid dawcy, który zawiera sekwencje homologiczne po obu stronach miejsca cięcia sekwencji docelowej z alternatywną sekwencją naprawczą - często białkiem markera fluorescencyjnego, zmodyfikowaną wersją oryginalnego genu lub inną modyfikacją - którą można skopiować i wprowadzić do genomu lub "wbić".
Czas jest krytyczny podczas wstrzykiwania embrionów, a szczególnie podczas korzystania z edycji genomu CRISPR/Cas9 do tworzenia mutacji u owadów. Dzieje się tak, ponieważ białko Cas9 i gRNA mają największą zdolność do generowania mutacji tylko wtedy, gdy zarodek jest w stanie syncytialnym, przed utworzeniem błon komórkowych i gdy w zarodku dostępnych jest wiele jąder. W przypadku komarów jądra docierają do obrzeży ~2-4 godziny po złożeniu jaj, w zależności od temperatury19, a zatem udana mikroiniekcja musi nastąpić przed tym czasem. Dodatkowo, białko Cas9 przetnie wszelkie jądrowe DNA, do którego ma dostęp, tak że osoba powstała w wyniku wstrzyknięcia będzie zawierała mozaikę komórek, z których niektóre będą miały pożądaną mutację, a inne nie. Aby te mutacje mogły być pomyślnie dziedziczone, białko Cas9 musi przeciąć DNA, które znajduje się w linii zarodkowej, która da początek przyszłym jajom i plemnikom. Aby upewnić się, że mutacje powstają w linii zarodkowej, najlepiej jest wstrzyknąć wszystkie materiały w pobliżu lokalizacji komórek biegunowych w zarodku, które są przodkami linii zarodkowej owadów. Komórki biegunowe znajdują się w pobliżu tylnego końca zarodków Culex20. Oprócz wstrzykiwania zarodków konieczne jest opracowanie starannego planu krzyżowania i badań przesiewowych potomstwa w celu wykrycia pożądanej mutacji.
Ten protokół opisuje, jak generować gRNA i łączyć je z białkiem Cas9 w celu przygotowania mieszanek iniekcyjnych, a także jak nakłonić samice komarów Culex pipiens do złożenia jaj oraz jak przygotować i wstrzyknąć te jaja do edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Dodatkowo opisujemy, w jaki sposób hodować, krzyżować i badać przesiewowo wstrzyknięte zarodki i ich potomstwo, aby potwierdzić, że pożądana mutacja została uzyskana. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy mutacje zerowe dla interesującego nas genu, cyklu, w szczepie Buckeye Culex pipiens. Szczep ten został pierwotnie założony w 2013 roku z komarów zebranych w terenie w Columbus w stanie Ohio i jest utrzymywany przez laboratorium Meuti. Protokół ten może być wykorzystany do dodatkowych badań, które wymagają edycji genomu CRISPR/Cas9 u komarów Culex, a także innych gatunków komarów, a bardziej ogólnie, jest istotny dla zastosowania edycji genomu CRISPR/Cas9 do dowolnego gatunku owadów.

<table><tbody><tr><td>Podajnik sztucznej membrany</td><td>Hemotek</td><td>SP5W1-3</td><td>Lokalizacja firmy: Blackburn, Wielka Brytania</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330019</td><td>Lokalizacja firmy: Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>Rurki mirocapillaralne ze szkła borokrzemianowego, średnica zewnętrzna 1 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-6</td><td>Lokalizacja firmy: Sarasota, FL, USA</td></tr><tr><td>BV10 Igła do ukosowania</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10-B</td><td>Lokalizacja firmy: Nobato, CA, USA</td></tr><tr><td>Whatman Okrągła bibuła filtracyjna (12,5 cm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001125</td><td>Lokalizacja firmy: St. Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa (50 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Fisherbrand o szybkim natężeniu przepływu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-800</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (24 x 40 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-311-20</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Dam dentystyczna</td><td>Henry Schein Inc</td><td>1010171</td><td>Lokalizacja firmy: Melville, NY USA</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna szkocka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0879005</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td>Lokalizacja firmy: Hamburg, Niemcy</td></tr><tr><td>Szklana fiolka (2 dram)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>033401C</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Olej halowęglowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>Lokalizacja firmy: St. Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>P-2000 Laserowy ściągacz igieł</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td>Lokalizacja firmy: Nobato, CA, USA</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-998-944</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>PC-100 Ściągacz igieł z obciążeniem</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>Jest to zgodne z wcześniejszym modelem PC-10, który został wycofany z produkcji. Lokalizacja firmy: Amityville, NY, USA</td></tr><tr><td>Zestaw do bezpośredniego PCR Phire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F140WH</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Kodak Photo-Flo (1%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-268-05</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Rurki mirokapilarne ze szkła kwarcowego, średnica zewnętrzna 1 mm</td><td>Rurka kapilarna Supplies Limited</td><td>QGCT 1.0</td><td>Lokalizacja firmy: Kornwalia, Wielka Brytania</td></tr><tr><td>Przewodnik i handel; Zestaw do badań przesiewowych sgRNA Takara</td><td>, Bio USA</td><td>632639</td><td>Ten zestaw pozwala określić, czy gRNA przecinają sekwencje DNA in vitro. Lokalizacja firmy: Mountain View, CA, USA</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>Lokalizacja firmy: St. Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>Małe szalki Petriego (35X10 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-190-0273</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu krew</td><td>kurczaka Lampire biologiczne</td><td>7201406</td><td>Lokalizacja firmy: Everett, PA, USA</td></tr><tr><td>Fisherbrand Kwadratowa szalka Petriego (10 cm x 10 cm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td>Company Lokalizacja: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>Henry Schein Inc.</td><td>7771180</td><td>Lokalizacja firmy: Melville, NY USA</td></tr><tr><td>Pokarm dla ryb tropikalnych</td><td>Tetramin</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-927-826</td><td>Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman, 4,25 cm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1001-042</td><td>Lokalizacja firmy: St. Louis, MO, USA</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu crispr/cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Komary Culex są głównymi wektorami wielu chorób, które negatywnie wpływają na zdrowie ludzi i zwierząt, w tym wirusa Zachodniego Nilu i chorób wywoływanych przez nicienie filarialne, takie jak nicienie sercowe i słoniowacica. Ostatnio edycja genomu CRISPR/Cas9 została wykorzystana do wywołania mutacji ukierunkowanych na miejsce poprzez wstrzyknięcie białka Cas9, które zostało skompleksowane z przewodnikiem RNA (gRNA) do świeżo złożonych zarodków kilku gatunków owadów, w tym komarów należących do rodzajów Anopheles i Aedes. Manipulowanie i wstrzykiwanie komarów Culex jest nieco trudniejsze, ponieważ komary te składają jaja pionowo na tratwach, a nie pojedynczo, jak inne gatunki komarów. Tutaj opisujemy, jak projektować gRNA, kompleksować je białkiem Cas9, nakłaniać samice komarów Culex pipiens do składania jaj oraz jak przygotować i wstrzyknąć nowo złożone zarodki do mikroiniekcji Cas9/gRNA. Opisujemy również, jak hodować i przesiewać komary, którym wstrzyknięto implant, pod kątem pożądanej mutacji. Reprezentatywne wyniki pokazują, że technika ta może być stosowana do indukowania mutacji ukierunkowanych na miejsce w genomie komarów Culex i, z niewielkimi modyfikacjami, może być stosowana do generowania mutantów zerowych również u innych gatunków komarów.

Stosując opisany protokół, udało nam się pomyślnie wstrzyknąć embriony Cx. pipiens, a wśród wstrzykniętych embrionów zaobserwowaliśmy wysoki wskaźnik przeżywalności (~55%, Rysunek 1). Wcześniejsze próby wykazały niższy odsetek przeżywalności, prawdopodobnie dlatego, że przednia część pęcherzyka jajowego przylegała do paska opatrunku medycznego, co uniemożliwiało larwom komarów wydostanie się z chorionu i pomyślne wpłynięcie do wody. Zapewnienie, że przedni koniec wystaje poza pasek ...

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania i wstrzykiwania zarodków komarów do edycji genomu CRISPR-Cas9. Głównymi zaletami tej techniki mikroiniekcji jest to, że ma ona wysoki wskaźnik przeżywalności komarów i pozwala naukowcom określić funkcję genu. Protokół ten został specjalnie dostosowany do wstrzykiwania komarów należących do rodzaju Culex.Komary te przenoszą kilka patogenów, w tym wirusy wywołujące gorączkę Zachodniego Nilu i zapalenie mózgu St. Louis, a także nicienie filarialne, które powodują dirofilariozę psów i słoniowaciznę. Dlatego posiadanie narzędzi takich jak edycja genomu CRISPR-Cas9 pozwoli nam lepiej zrozumieć i kontrolować te ważne czynniki chorobowe. Wstrzykiwanie świeżo złożonych zarodków owadów i uzyskanie wyższego wskaźnika przeżycia wymaga dużo czasu, praktyki i cierpliwości.Dlatego zalecamy wstrzyknięcie kilku zarodków kolorowego roztworu soli fizjologicznej przed wstrzyknięciem drogich materiałów w celu wywołania mutacji. Rozpocząć od ponownego wypełnienia igieł iniekcyjnych mieszanką do wstrzykiwań. Wybierz igłę do wypełniania lub końcówkę do napełniania żelem, która z łatwością zmieści się w tylnej części wybranej igły iniekcyjnej.Należy upewnić się, że między końcem wypełniacza igły a igłą do wstrzykiwań jest trochę wolnego miejsca. Ostrożnie nasycić, pojedynczą małą kroplę wstrzykiwacza wmieszać do igły iniekcyjnej w pobliżu miejsca, w którym zaczyna się ona zwężać. Następnie przymocuj igłę do iniekcji do mikrowtryskiwacza.Umieścić szkiełko zawierające zarodki na stoliku mikroskopu. Aby otworzyć igłę, należy użyć początkowego ciśnienia wtrysku wynoszącego około 30 psi i w razie potrzeby dostosować je do dostarczenia odpowiedniej objętości mieszanki do wstrzykiwań. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść igłę nad zarodkiem komara i ostrożnie użyj mikromanipulatora, aby opuścić igłę na zarodek.Gdy igła ledwo dotyka zarodka, szybko przesuń zarodek prostopadle do długiej osi igły. Aby ustalić, czy igła została pomyślnie otwarta, należy nacisnąć spust wstrzykiwania i sprawdzić, czy z igły nie wydostają się pęcherzyki powietrza lub mieszanka do wstrzykiwań. Jeśli nie, należy powtarzać przesuwanie zarodka komara przy igle, aż zostanie ona otwarta, a mieszanina do wstrzykiwań wydostanie się na zewnątrz po naciśnięciu spustu.Umieść pierwszy zarodek komara na środku view, upewnij się, że jest ostry i umieść igłę nad pierwszym jajem. Stopniowo zwiększaj powiększenie mikroskopu, ostrożnie obniżając igłę, aby utrzymać ją tuż nad pierwszym zarodkiem. Kontynuuj, aż mikroskop osiągnie największe powiększenie i zarówno zarodek, jak i igła będą ostre.Przesunąć zarodek lekko w lewo i opuścić igłę tak, aby znajdował się w tej samej płaszczyźnie view co zarodek. Użyj stolika mikroskopowego, aby delikatnie dotknąć zarodka do końcówki igły. Wąski tylny koniec zarodka komara powinien się lekko odchylić.Za pomocą stolika mikroskopowego przesuń tylny koniec zarodka na igłę i obserwuj, jak igła przenika przez kosmówkę jaja komara. Igła powinna po prostu wbić się w błonę i przybliżoną lokalizację komórek biegunowych w zarodku. Umieszczenie mieszanki iniekcyjnej w tym regionie zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji i odziedziczenia ich w linii zarodkowej.Pociągnąć za spust wstrzykiwań od jednego do trzech razy, aby wstrzyknąć mieszankę do wstrzykiwań do zarodka. Dostarczyć niewielką ilość mieszanki do wstrzykiwań, tylko tyle, aby można było wykryć niewielkie prześwity w osoczu zarodka. Użyj stolika, aby przesunąć zarodek w prawo, na zewnątrz i poza końcówkę igły.Jeśli wstrzyknięcie poszło dobrze, z zarodka powinno wyciekać niewiele płynu lub nie powinno go wcale wyciekać. Przesunąć stolik w dół, tak aby następny zarodek znalazł się przed igłą. I powtórzyć wstrzyknięcie.Jeśli wydaje się, że mieszanka do wstrzykiwań nie wypływa na zewnątrz lub jeśli po wyjęciu igły z zarodka wydostaje się duża ilość płynu, należy wymienić igłę do wstrzykiwań i rozpocząć od nowa. Zniszcz wszystkie niewstrzyknięte lub uszkodzone jaja. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków na szkiełku zmyj olej halowęglowy, nakładając wodę z odwróconej osmozy za pomocą butelki ze spryskiwaczem.Skieruj strumień wody na wierzch szklanego szkiełka nakrywkowego nad wstrzykniętymi zarodkami i pozwól, aby woda spłynęła po szkiełku nakrywkowym, uważając, aby nie skierować strumienia na zarodki. Przykryj szkiełko 150 mikrolitrami wody i umieść je na mokrej bibule filtracyjnej wewnątrz kwadratowej szalki Petriego. Inkubuj szalkę Petriego w komorze środowiskowej ustawionej na 25 do 27 stopni Celsjusza i 70 do 80% wilgotności względnej z długodziennym fotoperiodem.Protokół ten został wykorzystany do skutecznego wstrzykiwania zarodków północnego komara domowego, Culex pipiens, zapewniając, że przedni koniec zarodka komara wykracza poza pasek opatrunku medycznego, znacznie zwiększając przeżywalność larw i skutkując wysokiej jakości potomstwem, które jest zdolne do rozwoju do dorosłości i rozmnażania. Sekwencjonowanie ujawniło, że około 10% przebadanych komarów wykazało niewielką insercję lub delecję w pobliżu miejsca cięcia Cas9 pierwszego przewodnika RNA, co sugeruje, że komórki biegunowe były skutecznie celowane podczas mikroiniekcji. Osobniki F1 z powodzeniem kojarzyły się i wydały zdolne do życia potomstwo, z których niektóre również zawierały mutację.Podczas mikroiniekcji zarodków owadów większość ludzi ma trudności z początkowym otwarciem igły i przeniesieniem zarodka na igłę. Pamiętaj, że rozwijanie tych umiejętności wymaga czasu i praktyki. Protokół ten może być modyfikowany lub dostosowywany do wstrzykiwania zarodków innych komarów, a nawet innych gatunków owadów.Poza wykorzystaniem tego protokołu do nokautowania genów za pomocą ukierunkowanej edycji genomu CRISPR-Cas9, te same techniki mogą być używane do wstrzykiwania plazmidów lub transpozonów w celu wyeliminowania genów lub wygenerowania losowych mutacji. Moje laboratorium wykorzystuje obecnie tę technikę, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób komary mierzą codziennie i regulują swoje sezonowe reakcje. Jednak w jaki sposób my, naukowcy, wykorzystujemy edycję genomu CRISPR-Cas9, aby lepiej zrozumieć biologię kilku organizmów.

preparing-injecting-embryos-culex-mosquitoes-to-generate-null

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Naucz się mikroinjekcji zarodków komarów Culex pipiens przy użyciu CRISPR/Cas9 do edycji genomu. Ta metoda umożliwia tworzenie linii z mutacjami zerowymi z wysoką przeżywalnością larw.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów