Name: Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia in vivo w ciele migdałowatym myszy przy użyciu zminiaturyzowanego mikroskopu. Technika umożliwia ciągłe monitorowanie aktywności neuronów u swobodnie zachowujących się zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantami z Samsung Science and Technology Foundation (numer projektu SSTF-BA1801-10).

<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Burgoyne, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+sensor+proteins%3A+generating+diversity+in+neuronal+Ca2%2B+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).</li>
<li>Miyakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+activated+increases+in+Ca2%2B+concentration+in+hippocampal+CA1+pyramidal+cells+are+primarily+due+to+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels.</a> Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).</li>
<li>Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do ujawnienia

Umiejętne techniki chirurgiczne są niezbędne do osiągnięcia udanego optycznego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniaturowej mikroskopii montowanej na głowie w głębszych obszarach mózgu, takich jak ciało migdałowate, jak opisaliśmy tutaj. Dlatego, chociaż protokół ten stanowi wytyczne dla zoptymalizowanych procesów chirurgicznych mocowania płytki bazowej i implantacji soczewek GRIN, dodatkowe procesy optymalizacyjne mogą być konieczne w przypadku krytycznych kroków. Jak wspomniano w sekcji protokołu, współrzędne ciał...

Wapń jest wszechobecnym drugim przekaźnikiem, odgrywającym kluczową rolę w prawie każdej funkcji komórkowej8. W neuronach wyzwalanie potencjału czynnościowego i wejście synaptyczne powodują szybką zmianę wewnątrzkomórkowego wolnego [Ca2+]9,10. W związku z tym śledzenie stanów przejściowych wapnia daje możliwość monitorowania aktywności neuronalnej. GECI to potężne narzędzia, które pozwalają na monitorowanie [Ca2+] w zdefiniowanych populacjach komórek i przedziałach wewnątrzkomórkowych11,12. Spośród wielu różnych typów wskaźnika wapnia opartego na białku, GCaMP, sonda Ca2+ oparta na pojedynczej cząsteczce GFP13, jest najbardziej zoptymalizowanym, a tym samym szeroko stosowanym GECI. W wyniku wielu rund prac inżynieryjnych opracowano wiele wariantów GCaMP12,14,15,16. Używamy jednego z ostatnio opracowanych GCaMPs, GCaMP7b, w tym protokole16. Czujniki GCaMP w znacznym stopniu przyczyniły się do badania funkcji obwodów neuronalnych w wielu organizmach modelowych, takich jak obrazowanie stanów przejściowych Ca2+ podczas rozwoju17, obrazowanie in vivo w określonej warstwie korowej18, pomiar dynamiki obwodów w uczeniu się zadań motorycznych19 oraz obrazowanie aktywności zespołu komórkowego związanej z asocjacyjną pamięcią strachu w hipokampie i ciele migdałowatym20,21.
Optyczne obrazowanie GECI ma kilka zalet22. Kodowanie genetyczne umożliwia stabilną ekspresję GECI przez długi czas w określonym podzbiorze komórek, które są zdefiniowane przez profil genetyczny lub określone wzorce połączeń anatomicznych. Obrazowanie optyczne umożliwia przewlekłe jednoczesne monitorowanie in vivo setek do tysięcy neuronów u żywych zwierząt. Opracowano kilka systemów obrazowania optycznego do obrazowania in vivo i analizy GECI w mózgu swobodnie zachowujących się myszy za pomocą miniaturyzowanych mikroskopów fluorescencyjnych montowanych na głowie21,23,24,25. Pomimo tego, że technika obrazowania optycznego in vivo oparta na GECI, soczewce GRIN i miniaturowym mikroskopie montowanym na głowie jest potężnym narzędziem do badania związku między aktywnością a zachowaniem obwodów nerwowych, zastosowanie tej technologii do ciała migdałowatego było trudne ze względu na kilka problemów technicznych związanych z kierowaniem soczewki GRIN na komórki wyrażające GECI w ciele migdałowatym bez powodowania artefaktów ruchu, które poważnie obniżają jakość pozyskiwania obrazu i znajdowania komórek wyrażających GECI. Protokół ten ma na celu zapewnienie pomocnych wytycznych dla procedur chirurgicznych zakładania płytki bazowej i implantacji soczewek GRIN, które są kluczowymi krokami dla udanego optycznego obrazowania wapnia in vivo w ciele migdałowatym. Chociaż protokół ten jest ukierunkowany na ciało migdałowate, większość opisanych tutaj procedur jest powszechnie stosowana do innych głębszych obszarów mózgu. Chociaż protokół ten jest oparty na konkretnym systemie (np. Inscopix), ten sam cel można łatwo osiągnąć za pomocą innych alternatywnych systemów.

<table><tbody><tr><td>Igła 26G</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&alpha;-GFP</td> na <td>zamówienie</td><td></td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Cement akrylowo-dentystyczny (Ortho-jet Acrylic Pink)</td><td>Lang</td><td>1334-różowy</td><td>Chirurgia & Nasadka do płyty bazowej</td></tr><tr><td>Manipulator przepływu powietrza</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>Nasadka</td></tr> do <tr>płytki bazowej<td>Amoksycylina</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>Płytka chirurgiczna</td></tr><tr><td></td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Mocowanie płytki bazowej</td></tr><tr><td>Osłona płyty bazowej</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Nasadka do płytki bazowej</td></tr><tr><td>Aparat (komora) behawioralnyCoulbourn</td><td> Test zachowania klatki testowej instrumentu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparatura behawioralna (oprogramowanie)</td>Test <td>zachowania</td> <td>stopklatki instrumentu Coulbourn</td><td></td></tr><tr><td>Klatka węglowa</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Mocowanie płytki bazowej</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Chirurgia</td>Oprogramowanie</tr> do <tr><td>przetwarzania danych</td><td>INSCOPIX</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych INSCOPIX Oprogramowanie do przetwarzania danych</td><td>Płytka bazowa Załącznik & Test zachowania</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Wiertło chirurgiczne</td></tr><tr><td></td><td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Wiertło chirurgiczne</td></tr><tr><td></td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Szklana</td></tr><tr><td>igła</td><td>chirurgiczna WPI</td><td>PG10165-4</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Soczewka GRIN (sonda soczewkowa INSCOPIX Proview)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Hamilton Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Płyta główna</td><td>Neurotar</td><td>Model 5</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Klucz sześciokątny</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Mocowanie płyty bazowej</td></tr><tr><td>Laptop</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Surgery & Mocowanie płytki bazowej</td></tr><tr><td>Uchwyt soczewki, pręt stereotaktyczny (zestaw implantów INSCOPIX proview)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>Chwytak</td></tr><tr><td>do mikroskopu</td> chirurgicznego <td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>Mikroskop do mocowania płytki podstawowej</td></tr><tr><td>, oprogramowanie DAQ, sprzęt</td> Nasadka do płytki bazowej <td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>i Test zachowania</td></tr><tr><td>Mobilna klatka domowa</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Podstawa Mocowanie</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane ramię</td><td>Neurostar</td><td></td><td>Customized Surgery</td></tr><tr><td>Oprogramowanie dla zmodyfikowanych ramion</td><td>Neurostar</td><td></td><td>Customized Surgery</td></tr><tr><td>NI Board</td><td>Krajowy instrument</td><td></td><td>Test zachowania</td></tr><tr><td>Zdejmowane wiązanie epoksydowe</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Cement żywiczny (Super-bond)</td><td>Sun medical</td><td>Super bond C& B</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Śruba czaszki</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Stereotaktyczny uchwyt elektrody</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Manipulator stereotaktyczny</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Mocowanie płyty bazowej</td></tr></tbody></table>

udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

Monitorowanie in vivo aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszających się zwierząt jest jednym z kluczowych podejść do powiązania aktywności neuronalnej z zachowaniem. W tym celu opracowano technikę obrazowania in vivo, która wykrywa stany przejściowe wapnia w neuronach za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), zminiaturyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego i soczewki gradientowego współczynnika załamania światła (GRIN), która została z powodzeniem zastosowana do wielu struktur mózgu1,2,3,4,5,6. Ta technika obrazowania jest szczególnie skuteczna, ponieważ umożliwia przewlekłe jednoczesne obrazowanie genetycznie zdefiniowanych populacji komórek przez długi okres do kilku tygodni. Chociaż ta technika obrazowania jest przydatna, nie jest łatwo zastosować ją do struktur mózgu, które znajdują się głęboko w mózgu, takich jak ciało migdałowate, struktura mózgu niezbędna do przetwarzania emocji i asocjacyjnej pamięci strachu7. Istnieje kilka czynników, które utrudniają zastosowanie techniki obrazowania do ciała migdałowatego. Na przykład artefakty ruchowe zwykle występują częściej podczas obrazowania przeprowadzanego w głębszych obszarach mózgu, ponieważ mikroskop montowany na głowie wszczepiony głęboko w mózg jest stosunkowo niestabilny. Innym problemem jest to, że komora boczna znajduje się blisko wszczepionej soczewki GRIN, a jej ruch podczas oddychania może powodować bardzo nieregularne artefakty ruchowe, których nie można łatwo skorygować, co utrudnia uzyskanie stabilnego obrazu obrazowego. Ponadto, ponieważ komórki w ciele migdałowatym są zwykle ciche w stanie spoczynku lub znieczulenia, trudno jest znaleźć i skupić się na komórkach docelowych wykazujących ekspresję GECI w ciele migdałowatym podczas procedury powlekania w celu późniejszego obrazowania. Protokół ten stanowi pomocną wskazówkę, jak skutecznie celować w komórki wyrażające GECI w ciele migdałowatym za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w celu skutecznego obrazowania wapnia in vivo w tak głębszym obszarze mózgu. Należy zauważyć, że protokół ten jest oparty na konkretnym systemie (np. Inscopix), ale nie ogranicza się do niego.

Walidacja implantacji soczewki GRIN 
Przed trwałym przymocowaniem płytki bazowej do mózgu za pomocą cementowania należy przeprowadzić walidację implantacji soczewki GRIN. U zwierząt z udaną implantacją soczewki, zarówno komórki wykazujące ekspresję GCaMP, jak i naczynia krwionośne były wyraźnie widoczne w zakresie płaszczyzny ogniskowej wyznaczonym przez odległość między obiektywem mikroskopu a implantowaną soczewką GRIN (Rycina 2A i B). ...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia in vivo jest nieocenionym narzędziem, które umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się zwierząt. Jednak zastosowanie tej techniki do ciała migdałowatego było trudne. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do skutecznego celowania w komórki ciała migdałowatego za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu u myszy.

Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Stosowanie mikroskopii miniaturowej do obrazowania ciała migdałowatego in vivo wapnia może wiązać się z wieloma wyzwaniami. Protokół ten zawiera wskazówki dotyczące oszczędzania czasu w celu osiągnięcia udanego obrazowania wapnia in vivo. Obrazowanie wapnia in vivo umożliwia ciągłe jednoczesne obrazowanie genetycznie zdefiniowanych populacji komórek przez okres do kilku tygodni, co wcześniej nie było możliwe.W przypadku wstrzyknięcia AAV, ze znieczuloną myszą zabezpieczoną w ramce stereotaktycznej, wyrównaj wysokość bregmy i lambdy ze szpilką i zidentyfikuj konkretne miejsce na odsłoniętej i zdezynfekowanej czaszce do kraniotomii. Użyj wiertła wyposażonego w wiertło o średnicy 0,6 milimetra, aby ostrożnie wykonać kraniotomię o średnicy 1,6 milimetra z prędkością wiertła 18 000 obrotów na minutę i umyj czaszkę sterylnym PBS. Odejmij grzbietowo-brzuszną różnicę między bregmą a odsłoniętą powierzchnią mózgu od 4,2 milimetra, grzbietowo-brzuszną współrzędną implantacji soczewki opartą na bregmie, aby obliczyć wartość odległości A, i załaduj trzy mikrolitry oleju mineralnego i 0,7 mikrolitra więcej niż jeden razy 10 do 13. genomów wirusa na mililitr roztworu AAV do szklanej pipety.Wyjąć szpilkę z uchwytu sondy stereotaktycznej, aby umożliwić przymocowanie pipety do ramy i umieścić pipetę nad przygotowanym miejscem wstrzyknięcia. Gdy krwawienie całkowicie ustaje, włóż szklaną końcówkę pipety na głębokość 4,3 milimetra do tkanki mózgowej od grzbietowo-brzusznej współrzędnej bregmy i użyj pompy iniekcyjnej, aby dostarczyć całą objętość wirusa przed powolnym wyjęciem pipety. Po wstrzyknięciu całego wirusa należy przewiercić czaszkę jeszcze dwa razy, jak pokazano, aby umożliwić wszczepienie dwóch czaszki i umyć frakcje czaszki PBS.Następnie wszczep wysterylizowane 70% etanolem tak głęboko, jak to możliwe i zainstaluj zmotoryzowane ramię chirurgiczne na ramie stereotaktycznej. Podłącz wymagany sprzęt do komputera przenośnego, na którym zainstalowane jest oprogramowanie sterujące i użyj uchwytu kaniuli, aby stabilnie przymocować igłę o rozmiarze 26 do ramy stereotaktycznej. Po obliczeniu współrzędnych miejsca wkłucia igły, użyj manipulatora stereotaktycznego, aby ustawić końcówkę igły na odsłoniętej powierzchni mózgu i nawodnić tkankę mózgową dwiema do trzech kropli PBS.Wprowadź odpowiednie współrzędne grzbietowo-brzuszne i bocznego ciała migdałowatego do oprogramowania i kliknij GoTo, aby obniżyć igłę. Gdy igła całkowicie się zatrzyma, wprowadź 45 milimetrów do pola pozycji początkowej i kliknij przycisk GoDo, aby podnieść igłę. Gdy igła przestanie się poruszać, usuń PBS z powierzchni mózgu i odinstaluj igłę i uchwyt kaniuli z ramy stereotaktycznej.Przymocuj uchwyt obiektywu do pręta stereotaktycznego i przymocuj obiektyw GRIN do uchwytu obiektywu. Wysterylizuj soczewkę 70% etanolem i przymocuj pręt stereotaktyczny do ramki stereotaktycznej. Umieść końcówkę soczewki GRIN w wyznaczonym miejscu na powierzchni mózgu i odejmij wartość bezwzględną A od współrzędnej grzbietowo-brzusznej powierzchni mózgu, aby określić współrzędną grzbietowo-brzuszną do implantacji soczewki.Nawodnij tkankę mózgową dodatkowymi dwiema do trzech kropli PBS i użyj zmotoryzowanego ramienia, aby ustawić głębokość opuszczania na 1000 mikrometrów i wysokość podnoszenia na 300 mikrometrów. Gdy soczewka GRIN dotrze do miejsca docelowego, wyjmij PBS i ostrożnie nałóż żywiczny cement dentystyczny wokół soczewki GRIN, i ścianek bocznych. Gdy cement dentystyczny stwardnieje, wyjmij uchwyt soczewki z soczewki i nałóż cement akrylowy na powierzchnię czaszki.Następnie wymień uchwyt obiektywu na płytkę głowicy przyklejoną do końcówki pręta w orientacji poziomej. Powoli opuść pręt, aż płyta głowicy znajdzie się w górnej części mankietu soczewki, a następnie opuść głowicę o 1 000 mikrometrów, aż soczewka znajdzie się na prawej krawędzi wewnętrznego pierścienia płyty czołowej. Użyj cementu akrylowego, aby przymocować płytę głowicy do warstw cementu i użyj folii parafinowej, aby zabezpieczyć wszczepioną powierzchnię soczewki GRIN przed kurzem, a następnie nałóż usuwalne wiązanie epoksydowe na folię parafinową, aby przymocować folię do powierzchni soczewki i przywróć zwierzę do klatki z monitorowaniem do pełnego leżenia.Aby ocenić jakość implantacji soczewki GRIN, umieść klatkę węglową pod znieczuloną myszą na pałąku pod głową systemu klatek do przyczep kempingowych i włącz przepływ powietrza, aby klatka poruszała się swobodnie bez tarcia. Użyj chwytaka mikroskopu i manipulatora stereotaktycznego, aby wyrównać zminiaturyzowany mikroskop w pionie do ramy przed opuszczeniem mikroskopu, aż powierzchnia wszczepionej soczewki GRIN pojawi się w polu widzenia obrazu w oprogramowaniu. Wyrównaj środek wszczepionej soczewki GRIN ze środkiem pola widzenia i uchwyć obraz powierzchni wszczepionej soczewki GRIN, a następnie powoli podnieś soczewkę obiektywu mikroskopu, obserwując obraz pod kątem pojawienia się komórek wykazujących ekspresję GCaMP.U zwierząt, u których udało się wszczepić soczewkę, zarówno komórki wykazujące ekspresję GCaMP, jak i naczynia krwionośne można wyraźnie zaobserwować w jednym zakresie ogniskowej. Natomiast u zwierząt z implantacją poza celem nie obserwuje się wyraźnego obrazu komórek wykazujących ekspresję GCaMP w zakresie płaszczyzny ogniskowej, chociaż naczynia krwionośne można zaobserwować z pewnymi trudnościami. W przypadku soczewki niewidocznej nie można uwidocznić ani naczyń krwionośnych, ani komórek wykazujących ekspresję GCaMP, a na wszczepionej soczewce GRIN można zaobserwować jasną krawędź.U zwierząt, u których udało się wszczepić soczewkę GRIN, około 50 do 150 prawdopodobnie spontanicznie aktywnych komórek zazwyczaj wykazuje znaczną zmianę fluorescencji w polu widzenia w bocznym ciele migdałowatym, nawet bez tonu. Po prezentacji tonu tylko kilka komórek wyświetla specyficzną dla tonu zmianę sygnału GCaMP, określoną przez analizę obrazu delta F. Gdy ta sama analiza jest przeprowadzana na myszach, którym wstrzyknięto AAV z ekspresją GFP jako kontrolę, komórki wyrażające GFP są wykrywane w zakresie płaszczyzny ogniskowej i żadne komórki nie wykazują znaczącej zmiany fluorescencji z tonem lub bez.Weryfikacja histologiczna ekspresji GCaMP i celowania w soczewki GRIN nie wykazuje oznak uszkodzenia tkanki z powodu zapalenia tkanki mózgowej wokół soczewki GRIN. Jeśli prędkość igły lub soczewki nie jest stała, może to powodować artefakty ruchu i niską jakość obrazu. Pomocne może być użycie zmotoryzowanego ramienia chirurgicznego.Jeśli system do pielęgnacji przyczepy domowej nie jest gotowy na etapie mocowania płytki podstawowej, można użyć gazu izofluranu o niskim stężeniu do znieczulenia myszy podczas mocowania płytki podstawowej.

successful-vivo-calcium-imaging-with-head-mount-miniaturized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Źródło: Thapa, R., et. al., Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki o indeksie gradientowym dla głębokiego mózgu In vivo Obrazowanie wapnia.  J. Vis. Exp. (2021)Film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą miniskopu u transdukowanej myszy, korelując aktywność neuronów z zachowaniem.

Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym przyśrodkowej kory przedczołowej myszy za pomocą miniskopu

Tutaj opisujemy procedury eksperymentalne związane z dwufotonowym obrazowaniem kory myszy podczas zachowania w środowisku wirtualnej rzeczywistości.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Ten protokół bada zależność między mózgiem a zachowaniem w hipokampie CA1 u myszy poruszających się po smugach zapachu. Zapewniamy protokół krok po kroku, w tym operację w celu uzyskania dostępu do obrazowania hipokampa, trening behawioralny, rejestrację i przetwarzanie mózgu w miniskopie GCaMP6f oraz dane behawioralne w celu dekodowania pozycji myszy na podstawie aktywności neuronalnej ROI.

Miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo neuronów podwzgórza za pomocą miniaturyzowanego mikroskopu (miniscope) u swobodnie zachowujących się myszy podczas manipulacji stanem społecznym (izolacja społeczna i spotkanie społeczne). Metoda ta umożliwia obrazowanie aktywności podwzgórza w rozdzielczości pojedynczych neuronów, reprezentując potrzeby społeczne i nasycenie, umożliwiając mechanistyczne badania homeostazy społecznej.

In Vivo Obrazowanie wapnia mikroskopem miniaturowym w podwzgórzu w celu zrozumienia zachowań społecznych u myszy

Poznaj metodę obrazowania wapnia in vivo w ciele migdałowatym myszy przy użyciu zminiaturyzowanego mikroskopu. Technika umożliwia ciągłe monitorowanie aktywności neuronów u swobodnie zachowujących się zwierząt.

Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy (Wideo) | JoVE Journal

Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy

Przeglądaj więcej filmów