Name: Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj metodę krystalizacji białek na chipie mikrofluidycznym z wykorzystaniem mikrodializy i dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Protokół umożliwia precyzyjną kontrolę warunków krystalizacji przy małych objętościach próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MBS potwierdza wsparcie MI / CNRS w ramach kontraktu Instrumentation at the limits 2014-2015. NJ przyjmuje do wiadomości Międzynarodowy Program Badań Doktoranckich CEA (Irtelis) w celu uzyskania stypendium doktoranckiego. MBS i SJ potwierdzają finansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" w ramach umowy o udzielenie dotacji "Maria Skłodowska-Curie" nr 722687. MBS, SJ i NJ dziękują LIPhy (UGA) za ustanowienie pomieszczenia czystego do eksperymentów mikrofabrykacyjnych. IBS potwierdza integrację z Interdyscyplinarnym Instytutem Badawczym w Grenoble (IRIG, CEA).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowano urządzenie mikroprzepływowe do krystalizacji białek w układzie scalonym metodą mikrodializy oraz eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Można wytwarzać chipy NOA 81 integrujące membrany dializacyjne RC dowolnego MWCO w celu wykorzystania mikrodializy do krystalizacji białek w chipie. Użyto materiałów produkcyjnych o stosunkowo wysokiej przezroczystości rentgenowskiej, dzięki czemu chipy są kompatybilne z krystalografią białek in situ. Materiały produkcyjne, które składają się na komorę do krystalizacji białek w urządzeniu (PMMA, Kapton, membrana do dializy RC) zostały ocenione pod kątem generowania niskiego poziomu szumów tła. W szczególności szum tła generowany przez chip do dializy obserwuje się głównie w niskiej rozdzielczości (> 6 A) i nie ma on wpływu na przetwarzanie danych dyfrakcyjnych o wysokiej rozdzielczości dużych kryształów lizozymu wymaganych do określenia struktury białka. Automatyzacja zbierania danych jest wzmocniona za pomocą wydrukowanego w 3D wspornika, który może być montowany bezpośrednio w liniach badawczych krystalografii makromolekularnej i przenosić do trzech mikroprocesorów jednocześnie. W ten sposób unika się ręcznego zbierania i manipulowania delikatnymi kryształami białka. Co więcej, gromadzenie danych odbywa się w temperaturze pokojowej, co pozwala uniknąć konieczności krioprotekcji, która może być związana ze zmianami konformacyjnymi w natywnej strukturze białka 2,3.
Zastosowanie mikrodializy jako metody hodowli kryształów na chipie pozwala na dokładne monitorowanie i kontrolowanie procesu krystalizacji. Jak omówiono we wprowadzeniu, większość konwencjonalnych metod krystalizacji białek została wdrożona przy użyciu urządzeń mikroprzepływowych11,14. Jednak korzyści płynące z dializy w krystalizacji białek nie zostały jeszcze w pełni wykorzystane w mikroskali. Mikrodializa wbudowana w chip daje możliwość badania diagramów fazowych oraz przeprowadzania badań przesiewowych i optymalizacji warunków krystalizacji na tej samej próbce białka19. W przypadku prototypów przedstawionych w tej pracy zużycie białka na chip jest ograniczone do 0,1 lub 0,3 μl. Na podstawie dotychczasowych prac eksperymentalnych można stwierdzić, że najbardziej krytyczne etapy protokołu nie wynikają z procedury wytwarzania chipów, ale z procesu krystalizacji. Protokół produkcyjny obejmuje wiele kroków, ale jest prosty i umożliwia wytwarzanie wielu urządzeń (od 20 do 30 chipów) w ciągu jednego dnia w czystym pomieszczeniu, przy użyciu stosunkowo niedrogich materiałów. Jednak krystalizacja białek w układzie scalonym może być delikatną procedurą ze względu na wewnętrzną stochastyczną naturę zarodkowania i wzrostu kryształów, zwłaszcza w mikroskali. Opisano studium przypadku, w którym do krystalizacji lizozymu wykorzystano dobrze ugruntowane warunki, w wyniku których uzyskano solidne, dobrze zdefiniowane kryształy nadające się do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Niemniej jednak mogą pojawić się trudności w przypadku stosowania bardziej wymagających celów białkowych, takich jak białka błonowe, w przypadku których podłoże krystalizacyjne jest znacznie bardziej skomplikowane, schematy fazowe nie są znane, a dobrze działające warunki krystalizacji nie są jeszcze dobrze ustalone. Chip do dializy daje możliwość pokonania tych trudności i badania diagramów faz na chipie, bez pozbywania się cennej i często kosztownej próbki białka, poprzez zwykłą wymianę roztworu krystalizacyjnego w kanale mikroprzepływowym.
Wszechstronność urządzeń mikroprzepływowych wynika z wykorzystania mikrodializy do krystalizacji białek w układzie scalonym w celu odwracalnej kontroli warunków krystalizacji oraz mapowania diagramów fazowych o zmiennym stężeniu i temperaturze przy użyciu małej objętości białka. Co więcej, urządzenie jest kompatybilne z eksperymentami dyfrakcji rentgenowskiej in situ , a prototypowanie urządzeń jest niedrogie i szybkie. Liczne, izomorficzne kryształy białek rozpuszczalnych i błonowych (w przygotowaniu) mogą być hodowane na chipie i oczekuje się, że wszystkie te cechy mogą być wykorzystane do seryjnych badań krystalografii rentgenowskiej trudnych celów białkowych w obiektach synchrotronowych i XFEL. Wreszcie, przeprowadzanie badań rozdzielczych w układzie scalonym i in situ z rozdzielczością czasową jest przyszłą możliwością, która może być bardzo interesująca dla społeczności krystalograficznej. W związku z tym, poprzez hodowanie kryształów na chipie dializacyjnym i wprowadzanie odczynników do kanału mikroprzepływowego, ręcznie (za pomocą strzykawki) lub automatycznie (za pomocą systemu płynu kontrolującego ciśnienie lub pompy strzykawkowej), przyszłe wysiłki będą koncentrować się na udowodnieniu, że chipy mikroprzepływowe mogą być z powodzeniem wykorzystywane do uruchamiania eksperymentów czasowo-rozdzielczych na liniach synchrotronowych.

Wyjaśnienie trójwymiarowej (3D) struktury makrocząsteczek biologicznych jest nieustannym dążeniem w biologii strukturalnej, gdzie krystalografia rentgenowska pozostaje główną techniką badawczą. Stosowana do odkrywania szczegółów strukturalnych złożonych makrocząsteczek, takich jak białka, ma na celu ułatwienie zrozumienia ich mechanizmów działania i udziału w różnych funkcjach biologicznych. Potężne źródła promieniowania rentgenowskiego w synchrotronach i rentgenowskie lasery na swobodnych elektronach (XFEL) dostarczają wszystkich narzędzi niezbędnych do głębszego wglądu w strukturę białek w rozdzielczości bliskiej atomowej. Pomimo zalet związanych z zastosowaniem promieni rentgenowskich do badań strukturalnych, istnieją nieodłączne ograniczenia dotyczące promieniowania rentgenowskiego i samego procesu krystalizacji. Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem wywołanym przez wysoki strumień promieniowania rentgenowskiego i długie czasy ekspozycji kryształu białka przed wiązką promieniowania rentgenowskiego są restrykcyjnymi parametrami, które krystalografowie muszą przekroczyć za pomocą chłodzenia kriogenicznego1. Jednak znalezienie optymalnych warunków kriochłodzenia może być pracochłonne, ponieważ zmiany konformacyjne wynikające z natywnej struktury białka lub artefaktów mogą być ukryte2,3. Co więcej, ostatnie badania wskazują, że przeprowadzanie eksperymentów dyfrakcyjnych w temperaturze pokojowej prowadzi do niższych uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem właściwym4. Kolejnym wąskim gardłem w biologii strukturalnej jest pozyskiwanie dobrze dyfrakcyjnych kryształów o wystarczającej wielkości5. Małe kryształy są łatwiejsze do wyprodukowania, szczególnie w przypadku białek błonowych, ale są bardziej podatne na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem nawet w warunkach kriochłodzenia, ponieważ wysoka dawka promieniowania musi być skierowana na mniejszą objętość w porównaniu z przypadku większych kryształów białkowych6. Nowatorskie podejście krystalografii szeregowej7,8 w synchrotronach i XFEL może obejść ograniczenia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem i jednocześnie wykorzystać mniejsze kryształy (od 200 nm do 2 μm)7 poprzez łączenie zestawów danych z wielu, izomorficznych i losowo zorientowanych kryształów białkowych oraz czerpanie korzyści z powiązanych osiągnięć technologicznych, takich jak impulsy femtosekundowe, krótsze czasy naświetlania i mikroogniskowane wiązki promieniowania rentgenowskiego5,7,9,10.
Technologia mikroprzepływowa jest cenna dla krystalografii rentgenowskiej, wykazując wielorakie zalety krystalizacji makrocząsteczek biologicznych i ich badań strukturalnych. Przeprowadzanie eksperymentów krystalizacji w urządzeniach mikroprzepływowych wymaga małych objętości próbek białek, co ogranicza koszty produkcji tych wysoko cenionych biomakrocząsteczek i ułatwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe i optymalizację wielu warunków krystalizacji. Co więcej, nieodłączny stosunek dużej powierzchni do objętości w skali mikroprzepływowej i zjawiska transportu ograniczone dyfuzją umożliwiają precyzyjną kontrolę nad przepływami i gradientami temperatury lub stężenia11,12,13,14, co sprawia, że urządzenia mikroprzepływowe są odpowiednie do hodowli kryształów o jednolitych rozmiarach i eksploracji diagramów fazowych15,16,17,18,19. Co więcej, narzędzia mikroprzepływowe wykazują szczególny potencjał w zakresie rozwiązania kolejnej przeszkody w krystalografii białek, jaką jest dostarczanie próbek oraz konieczność obróbki i zbierania kryształów białkowych przed ich użyciem do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej. Metoda krystalografii rentgenowskiej na chipie i in situ eliminuje manipulację kryształami i potencjalne pogorszenie jakości kryształów przed zebraniem danych. Szeroka gama chipów mikroprzepływowych kompatybilnych z krystalografią białek rentgenowskich in situ została zaprojektowana, opracowana i przetestowana przez wiele grup badawczych, które konfrontują się z powiązanymi ograniczeniami wynikającymi z charakteru materiałów mikroprodukcyjnych i ich interakcji z promieniowaniem rentgenowskim14,19,20,21,22,23. Materiały produkcyjne muszą być optycznie przezroczyste, biologicznie obojętne i wykazywać wysoką przezroczystość dla promieniowania rentgenowskiego oraz optymalny stosunek sygnału do szumu podczas zbierania danych.
Większość metod krystalizacji stosowanych w konwencjonalnej krystalografii białek24,25 zostały również zaimplementowane w skali mikroprzepływowej11,14 do krystalizacji na chipie i analizy dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proste, hybrydowe lub wielowarstwowe aparaty mikroprzepływowe zawierające dyfuzję pary26, evaporation27, free interface diffusion (FID)28, microbatch26, a nawet seeding29 były używane do krystalizacji białek rozpuszczalnych i błonowych. Można osiągnąć wysoką przepustowość badań przesiewowych i optymalizację warunków krystalizacji30,31 w dobrze opartych 32, droplet-based33, lub uruchamiane zaworem34. In situ Eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej trudnych celów białkowych w temperaturze pokojowej przeprowadzono w mikroczipach wykonanych z różnych materiałów, takich jak PDMS (polidimetylosiloksan), COC (cykliczny kopolimer olefiny), PMMA (poli(metakrylan metylu)))21,22,26,28,29, graphene films23, Kapton35, epoxy glue6, lub NOA (Norland Optical Adhesive)19 oraz oceniono przezroczystość materiałów na promieniowanie rentgenowskie i ich wpływ na szum tła. Co więcej, mikroczipy zostały zaprojektowane tak, aby łączyć strategie zbierania danych in situ i szeregowego w jednym narzędziu do eksperymentów krystalografii białek rentgenowskich w źródłach synchrotronowych23,35,36 i XFELs7.
Zbieranie danych in situ o temperaturze pokojowej zostało również zaimplementowane w różnych metodach dostarczania i urządzeniach. Na przykład Nogly et al.54 użyli iniektora lipidowej fazy sześciennej (LCP) w celu zbadania struktury sterowanej światłem pompy fotonowej bakteriorodopsyny (bR) za pomocą seryjnej krystalografii femtosekundowej (SFX) przy użyciu źródła XFEL. Struktura krystaliczna bR została rozwiązana z rozdzielczością 2,3 A, wykazując kompatybilność wtryskiwacza LCP z czasowo-rozdzielczą szeregową krystalografią femtosekundową (TR-SFX). Baxter i in.55 zaprojektowali wielokrystaliczną siatkę o dużej gęstości, wykonaną z poliwęglanowego tworzywa sztucznego o grubości 100 lub 200 μm z laserowo wycinanymi otworami o różnych rozmiarach. Dodatkowa folia poliwęglanowa o grubości 5 μm może być przymocowana po jednej stronie siatki podczas korzystania z urządzenia do eksperymentów krystalizacji w pozycji siedzącej lub wiszącej. Ta siatka o dużej gęstości może być używana na wiele sposobów, ponieważ kryształy mogą być ładowane bezpośrednio do portów urządzenia lub kryształy mogą być hodowane na urządzeniu przez dyfuzję pary lub metodę LCP. Co więcej, siatkę można ustawić w standardowej podstawie magnetycznej i wykorzystać do zbierania danych rentgenowskich in situ w warunkach kriogenicznych lub w temperaturze pokojowej. Niedawno Feiler et al.56 opracowali uchwyt na próbkę do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej in situ w temperaturze kriogenicznej i temperaturze otoczenia przy minimalnym udziale szumów tła. W szczególności uchwyt składa się z plastikowego wspornika, przezroczystej folii COC i mikroporowatej strukturalnej folii poliimidowej. Został zaprojektowany, aby zastąpić powszechnie używane szkiełka pokrywowe do ustawiania kropli krystalizacji, umożliwiając jednocześnie manipulację na miejscu, taką jak moczenie ligandów, tworzenie kompleksów i ochrona kriogeniczna bez otwierania kropli krystalizacji lub ręcznego obchodzenia się z kryształami. Co więcej, uchwyt próbki można wyjąć z płytki krystalizacyjnej i umieścić na podstawie magnetycznej w celu zbierania danych in situ na standardowych liniach badawczych opartych na goniometrze. W celu zebrania danych o temperaturze otoczenia folia COC jest usuwana przed eksperymentem i tylko folia poliimidowa o grubości 21 μm przyczynia się do rozpraszania tła, które w tym przypadku jest minimalne. Przykłady te stanowią tylko niewielki ułamek trwających badań i mnogość wszechstronnych mikroczipów opracowanych do krystalografii białek rentgenowskich.
Jednakże, metoda krystalizacji białek dializacyjnych nie została powszechnie włączona do mikrofluidyki. Dializa jest metodą opartą na dyfuzji, mającą na celu zrównoważenie stężenia strącania przez półprzepuszczalną membranę w celu zbliżenia się do nominalnego stężenia krystalizacji białka i umożliwia precyzyjną i odwracalną kontrolę warunków krystalizacji24. Odcięcie masy cząsteczkowej (MWCO) półprzepuszczalnej membrany dializacyjnej można wybrać w zależności od masy cząsteczkowej makrocząsteczki i środków strącających, aby umożliwić dyfuzję małych cząsteczek strącających przy jednoczesnym zachowaniu makrocząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. Ze względu na odwracalność procesu dializy, może być on stosowany w połączeniu z kontrolą temperatury w celu niezależnego oddzielania i optymalizacji zarodkowania i wzrostu kryształów37 do badania diagramów fazowych poprzez zmianę stężenia strącania przy użyciu tej samej próbki białka. Integracja membran w mikrofluidyce została oceniona przez de Jong et al.38, a studia przypadków w biologii wszczepiającej dializę do mikroczipów można głównie wymienić w zastosowaniach związanych z przygotowaniem, zatężaniem lub filtracją próbek39,40,41,42 lub badania związane z komórkami43,44. Perwaporacja przez PDMS została wykorzystana przez Shim et al.37 do badania zarodkowania i wzrostu ksylanazy w różnych warunkach. Woda przenikała przez membranę PDMS o grubości 15 μm do zbiornika białkowego urządzenia mikroprzepływowego, zmieniając następnie stężenie białka i strącacza.
Przedstawiono protokół opracowany przez Junius et al.19,45 do produkcji mikroprzepływowego chipa kompatybilnego zarówno z krystalizacją białek na chipie za pomocą mikrodializy, jak i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Protokół produkcji urządzenia jest bezpośrednio inspirowany pionierską pracą wykonaną przez Studera i współpracowników12,46 dla mikrowzorzystych naklejek z fotoutwardzalnej żywicy na bazie tiolenu NOA 81 osadzającej dostępne na rynku membrany, przy użyciu miękkiej litografii. Innowacyjna modyfikacja metody zaowocowała opracowaniem mikroczipów umożliwiających wykorzystanie mikrodializy do dokładnego monitorowania i kontrolowania parametrów eksperymentalnych wzrostu kryształów białek w układzie scalonym przy jednoczesnym wykorzystaniu zalet mikrofluidyki, takich jak zmniejszone zużycie próbek białek na eksperyment (<1 μl). W poprzedniej pracy zademonstrowano zasady dializy stosowane w systemie makroskalowym (typowa objętość >20 μl) do badania przesiewowego i optymalizacji warunków krystalizacji poprzez mapowanie wykresów fazowych stężenia temperatury i strącania47. W niniejszej pracy opisano protokół produkcji mikroczipów do dializy zawierających membrany dializacyjne z regenerowanej celulozy (RC) różnych MWCO w celu przeprowadzenia testów krystalizacji na chipie i zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Materiały, z których wykonane są mikroczipy, zostały ocenione pod kątem ich przezroczystości na promieniowanie rentgenowskie19, a urządzenia można ustawić bezpośrednio przed wiązką promieniowania rentgenowskiego w celu przeprowadzenia eksperymentów dyfrakcyjnych in situ w temperaturze pokojowej, z wyłączeniem ręcznej obsługi i zminimalizowania degradacji delikatnych kryształów białkowych. W jednym ze studiów przypadków kryształy lizozymu z białka jaja kurzego wyhodowano na chipie za pomocą mikrodializy, generując populację o jednolitej wielkości. Mikrochip został następnie zamontowany przed wiązką promieniowania rentgenowskiego za pomocą wydrukowanego w 3D supportu19 i kompletne zestawy danych dyfrakcyjnych in situ zebrano w temperaturze pokojowej z wielu izomorficznych kryształów, wykazując wysoki potencjał i znaczenie chipów dla badań krystalografii szeregowej synchrotronu trudnych celów makromolekularnych.

<table><tbody><tr><td>3 w wafli</td><td>Silicon Materials Inc.</td><td></td><td>Wirówka do wafli krzemowych</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Minispin</td><td>Wirówka stołowa</td></tr><tr><td>CleWin 3.0</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> WieWeb <td>Oprogramowanie do projektowania</td></tr><tr><td>Klej epoksydowy</td><td>Devcon</td><td></td><td>5 minut klej epoksydowy</td></tr><tr><td>Złącza płynowe</td><td>Cluzeau Info Lab</td><td>N-333</td><td>Zestaw NanoPort do węży o średnicy zewnętrznej 1/16"</td></tr><tr><td>Lizozym z białka kurzego</td><td>Roche</td><td>10 837 059 001</td><td>Liofilizowany smar białkowy w proszku</td></tr><tr><td>Wysokopróżniowy smar silikonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Dow Corning&nbsp; wysokopróżniowy smar silikonowy</td></tr><tr><td>HMDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>Silan, chemiczny</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Sawatec</td><td>HP-200-Z-HMDS BM</td><td>Płyta grzejna</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Taśma kaptonowa</td><td>DuPont</td><td></td><td>Taśma poliamidowa</td></tr><tr><td>Wyrównywacz do masek</td><td>SUSS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Nakładka do maski, źródło UV</td></tr><tr><td>Filtr membranowy</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>0,22 &mu; m filtr wielkości porów</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific 12164682</td><td></td><td>3 x 1 cal szkiełka</td></tr><tr><td>podstawowe NOA81</td><td>Norland Products Inc.&nbsp;</td><td>NOA81</td><td>Żywica fotoutwardzalna</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Memmert</td><td></td><td>Piekarnik</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6543</td><td>Parafilm M rozmiar rolki 20&nbsp; w. &czasy; 50&nbsp; ft</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silikon</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-603</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Developer</td></tr><tr><td>Sprzęt plazmowy</td><td>Diener Electronic</td><td>ZEPTO</td><td>Obróbka plazmowa</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>Goodfellow</td><td>137-745-63</td><td>Arkusze PMMA 150x150 mm, grubość 0,175 mm</td></tr><tr><td>System napędzany ciśnieniem</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td>Regulator ciśnienia/podciśnienia</td></tr><tr><td>Rurki PTFE</td><td>Mikrofluidyka Elveflow/Darwin</td><td>LVF-KTU-15</td><td>Rolka rurki PTFE 1/16" OD X 1/32" ID</td></tr><tr><td>RC membrana dializacyjna</td><td>Spectra/Por</td><td></td><td>Różne MWCO</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td>Ostrza chirurgiczne ze stali węglowej</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Solidworks</td> Oprogramowanie do projektowania <td>Dassault Systemes</td><td></td><td>3D-CAD</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>SPS</td><td>Spin150</td><td>Przędzarka waflowa</td></tr><tr><td>SU-8 seria 3000</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3050</td> Strzykawka <td>fotorezystyczna</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL strzykawka Luer-Lok</td></tr><tr><td>Sieciownik UV</td><td>Uvitec</td><td>CL-508</td><td>Usieciownik UV</td></tr></tbody></table>

krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Ten protokół opisuje produkcję powtarzalnych i niedrogich urządzeń mikroprzepływowych, obejmujących cały rurociąg do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i umożliwiających eksperymenty in situ z monokryształami lub krystalografią seryjną w temperaturze pokojowej. Protokół szczegółowo opisuje proces wytwarzania mikrochipów, manipulowanie eksperymentami krystalizacji na chipie oraz obróbkę zebranych in situ danych dyfrakcji rentgenowskiej w celu wyjaśnienia strukturalnego próbki białka. Główna cecha tej procedury mikroprodukcji polega na zintegrowaniu dostępnej na rynku, półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy pomiędzy dwiema warstwami chipa. Odcięcie masy cząsteczkowej osadzonej membrany różni się w zależności od masy cząsteczkowej makrocząsteczki i środków strącających. Urządzenie wykorzystuje zalety technologii mikroprzepływowej, takie jak wykorzystanie niewielkich objętości próbek (<1 μl) i precyzyjne dostrajanie zjawisk transportowych. Chip połączył je z metodą dializy, zapewniając precyzyjną i odwracalną kontrolę nad procesem krystalizacji i może być używany do badania diagramów fazowych białek w skali mikrolitrów. Urządzenie jest wzorowane przy użyciu fotoutwardzalnej żywicy na bazie tiolenu z miękką litografią odciskową na optycznie przezroczystym podłożu polimerowym. Co więcej, oceniono rozproszenie tła materiałów składających się na mikroczipy i generujące szum tła, dzięki czemu chip jest kompatybilny z eksperymentami dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Gdy kryształy białka zostaną wyhodowane na chipie do odpowiedniej wielkości i jednorodności populacji, mikroczipy można zamontować bezpośrednio przed wiązką promieniowania rentgenowskiego za pomocą uchwytu wydrukowanego w 3D. Podejście to pozwala w łatwy i niedrogi sposób sprostać wyzwaniom wynikającym ze stosowania krioprotektantów i ręcznego zbierania w konwencjonalnych eksperymentach krystalografii białek. Kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej z wielu izomorficznych kryształów lizozymu wyhodowanych na chipie zebrano w temperaturze pokojowej w celu określenia struktury.

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

W artykule opisano protokół wytwarzania chipów mikroprzepływowych opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy oraz eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Jedną z głównych zalet tych mikroprocesorów jest wybór materiałów produkcyjnych, dzięki czemu chipy są kompatybilne z gromadzeniem danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Eksperymenty z krystalizacją w układzie scalonym wymagają małych objętości próbki białka, co zmniejsza całkowity koszt pracy z tymi makrocząsteczkami o wysokiej wartości.Krystalizacja w układzie scalonym eliminuje również ręczne zbieranie delikatnych kryształów białka, często stosowane w połączeniu z chłodzeniem kriogenicznym podczas konwencjonalnych eksperymentów krystalograficznych. Ponadto nasze mikroczipy wykorzystują mikrodializę do krystalizacji białek, która jest metodą opartą na dyfuzji, mającą na celu zrównoważenie stężenia strącania przez półprzepuszczalną membranę, w celu zbliżenia się do stężenia kromulentów do krystalizacji białek i umożliwia precyzyjną i odwracalną kontrolę warunków krystalizacji. Mikrodializa w połączeniu z kontrolą temperatury może być stosowana do oddzielania zarodkowania od wzrostu kryształów w celu zbadania diagramów fazowych, poprzez zmianę stężenia strącania przy użyciu tej samej próbki białka.Najpierw przygotuj 50 gramów bazy silikonowej PDMS i jej utwardzacza w stosunku 10 do jednego masy. Wymieszaj oba składniki w zlewce za pomocą szpatułki. Po wymieszaniu umieść mieszaninę w komorze próżniowej w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.Umieść 25 gramów wstępnie zmieszanego PDMS w pierwszym SU8, aby opanować wzorce zawierające wzorce kanału mikroprzepływowego i filarów, do wysokości około pięciu milimetrów. Następnie wlej pozostałe 25 gramów PDMS do drugiego mastera SU8, zawierającego tylko wzory filarów. Utwardź dwie warstwy PDMS w piekarniku w temperaturze 338 kelwinów przez godzinę.Wytnij utwardzone warstwy PDMS wokół wzorów mistrzów SU8 za pomocą skalpela i delikatnie oderwij formy PDMS od silikonowych wzorców. Umieść formę PDMS, obejmującą zarówno kanały, jak i filary, na szkiełku mikroskopowym z wzorami skierowanymi do góry. Wytnij mały kawałek membrany dializacyjnej z regenerowanej celulozy, aby pokryć centralny filar formy PDMS, który ma być komorą białkową.Punkt odcięcia masy cząsteczkowej błony dializacyjnej dobiera się odpowiednio do masy cząsteczkowej próbki białka i substancji strącających roztworu krystalizacyjnego. Następnie należy ostrożnie oddzielić suchy kawałek membrany do dializy z regenerowanej celulozy. Wyciąć mały kawałek oddzielonej membrany dializacyjnej.Rozmiar tego kawałka membrany zależy od konstrukcji chipa. A konkretnie zależy to od wymiarów środkowego filaru. Umieść kawałek membrany dializacyjnej na środkowym filarze formy PDMS, który jest wsparty na szklanym szkiełku, z filarem i kanałami skierowanymi do góry.Następnie umieść drugą formę PDMS, w której tylko filary są skierowane w dół, na wierzchu formy PDMS, która jest już podparta na szklanym szkiełku. Wyrównaj wszystkie filary dwóch form PDMS. Kawałek membrany do dializy z regenerowanej celulozy jest umieszczony pomiędzy dwoma centralnymi filarami form PDMS.Ten etap procedury produkcyjnej można przeprowadzić pod mikroskopem optycznym lub po prostu poprzez dokładną wizualną kontrolę wyrównania wszystkich filarów. Umieść zespół w komorze próżniowej i wysuszaj przez 30 minut w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza w formach PDMS i zwiększenia wprowadzania fotoutwardzalnej żywicy NOA, która zostanie opisana w następnym kroku tego protokołu. Wyjmij zespół z komory próżniowej i wypełnij pustą przestrzeń między dwiema formami PDMS fotoutwardzalną żywicą na bazie tioliny, NOA 81, przez wchłanianie kapilarne.Nałóż żywicę na trzy z czterech stron zespołu. Umieść zespół w sieciowniku i utwardź żywicę NOA, wystawiając ją na działanie światła UV przez osiem sekund, używając skolimowanej lampy UV o mocy 35 miliwatów na centymetr kwadratowy. Wytnij kawałek PMMA o grubości 175 mikrometrów w standardowych wymiarach szkiełka mikroskopowego i zdejmij plastikową osłonę z każdej strony elementu PMMA.Po zakończeniu pierwszej ekspozycji na promieniowanie UV usuń górną formę PDMS z częściowo usieciowaną żywicą NOA naklejoną na nią z dolnej formy PDMS i szkiełka podstawowego. Delikatnie dociśnij zespół górnej formy PDMS i częściowo utwardzoną żywicę NOA na elemencie PMMA. Umieść nowy zespół w urządzeniu sieciującym i ponownie utwardź żywicę NOA przez wystawienie na działanie światła UV przez 60 sekund.Ostrożnie usuń górną formę PDMS. Chip do dializy wykonany z w pełni usieciowanej żywicy NOA, osadzony w membranie dializacyjnej z regenerowanej celulozy i podparty na kawałku PMMA, jest gotowy. Złącza dostępne w handlu należy przykleić w punktach wlotowych i wylotowych kanału mikroprzepływowego za pomocą szybkiego kleju epoksydowego.Do obsługi płynów należy wybrać średnicę rurek PTFE w zależności od rozmiaru złączy. Probówki służą do wprowadzania roztworu krystalizacyjnego do kanału płynnego chipa dializacyjnego. Ręcznie odpipetować kroplę próbki białka znajdującą się w zbiorniku białkowym znajdującym się bezpośrednio na błonie dializy.Objętość kropelki białka zależy od konstrukcji używanego mikroczipa. A konkretnie zależy to od objętości środkowego słupka i może to być 0,1 lub 0,3 mikrolitra. Ostrożnie nałóż cienką warstwę wysokopróżniowego smaru silikonowego wokół zbiornika białka.Wytnij mały kawałek PMMA i delikatnie umieść go nad cienką warstwą smaru silikonowego. Wytnij kawałek taśmy kaptonowej, wystarczająco duży, aby zakryć kawałek PMMA umieszczony nad zbiornikiem białka i przykleić się do chipa NOA na wszystkich krawędziach. Próbka białka jest zamknięta w zbiorniku, a chip może być wykorzystany do eksperymentów krystalizacji.Najpierw należy przygotować około 500 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego, mieszając odpowiednie objętości buforu i roztworów strącających. Wstrzyknąć roztwór krystalizacyjny w punkt chipa dializacyjnego przez złącza płynów, ręcznie za pomocą strzykawki lub za pomocą zautomatyzowanego systemu napędzanego ciśnieniem. Gdy kanał fluidyczny zostanie wypełniony roztworem krystalizacyjnym i nie zostanie w nim uwięzione powietrze, uszczelnij porty wlotowe i wylotowe chipa taśmą Parafilm.Odpipetować odpowiednią objętość roztworu białkowego w zbiorniku białkowym i zamknąć próbkę białka w kapsułkach, jak to już opisano. Wzrost kryształów białka można wizualizować i rejestrować za pomocą kamery cyfrowej. Do produkcji mikroczipów do dializy wybraliśmy optycznie przezroczyste i biologicznie obojętne materiały, wykazujące wysoką kompatybilność z eksperymentami dyfrakcji rentgenowskiej in situ.Oceniono szum tła generowany przez materiały składające się na przedział białkowy chipa, który znajduje się na bezpośredniej drodze wiązki promieniowania rentgenowskiego. Przedział białkowy składa się z regenerowanej celulozowej membrany dializowej, taśmy kaptonowej i dwóch warstw PMMA, jednej używanej jako substrat mikroczipów, a drugiej służącej do kapsułkowania próbki białka. Na tym zdjęciu zilustrowany jest szum tła generowany przez taśmę kaptonową, membranę do dializy z regenerowanej celulozy, warstwę PMMA oraz ich montaż.Mimo że żywica fotoutwardzalna NOA stanowi główny korpus mikroczipów, nie jest uwzględniona w tych pomiarach, ponieważ nie jest częścią komory białkowej. Rozproszone pierścienie przypisywane oddziaływaniom promieniowania rentgenowskiego z materiałami można zaobserwować dla taśmy kaptonowej o rozdzielczości niższej niż cztery angstremy, PMMA od czterech do ośmiu angstremów, a membrany dializacyjnej od czterech do pięciu angstremów. Całkowity szum tła generowany przez chip jest obserwowany głównie w rozdzielczości niższej niż sześć angstremów, co wskazuje, że nie ma to wpływu na przetwarzanie danych dyfrakcyjnych lizozymu o wysokiej rozdzielczości.Mikroczipy zostały zamontowane przed wiązką promieniowania rentgenowskiego za pomocą wydrukowanego w 3D wspornika, który zaprojektowaliśmy do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ i może pomieścić do trzech chipów jednocześnie. Przeprowadzono eksperymenty mające na celu ocenę skuteczności mikroczipów w krystalizacji białek rozpuszczalnych w modelu metodą mikrodializy. Kryształy lizozymu hodowano w temperaturze 293 kelwinów w dwóch różnych warunkach.Pierwszy warunek krystalizacji zawierał 1,5 molowego chlorku sodu i 0,1 molowego octanu sodu. Drugi warunek krystalizacji zawierał jeden molowy chlorek sodu, 0,1-molowy octan sodu i 30% glikol polietylenowy 400 i został wybrany, aby wykazać kompatybilność mikroczipów i metody mikrodializy z osadami strącającymi o dużej masie cząsteczkowej i lepkich roztworach. Eksperymenty krystalizacji przeprowadzono w warunkach statycznych.Po wyhodowaniu kryształów lizozymu na mikrochipie, wykorzystano je do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Mikroczipy zostały zamontowane na linii wiązki za pomocą wydrukowanego w 3D wspornika, a następnie zebrano kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej z dwóch kryształów lizozymu. Po obróbce danych dyfrakcji rentgenowskiej uzyskano mapę gęstości elektronów pojedynczego kryształu lizozymu z rozdzielczością 1,95 angstrema, jak pokazano na rysunku A.Rysunek B przedstawia mapę gęstości elektronów uzyskaną z rozdzielczością 1,85 angstremów.Po połączeniu dwóch zestawów danych uzyskanych z dwóch różnych kryształów lizozymu, obie mapy gęstości elektrycznej pokazują szczegółowe informacje strukturalne, które można uzyskać za pomocą eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ przeprowadzonych bezpośrednio na mikroczipach dializacyjnych w temperaturze pokojowej, z pojedynczych lub wielu kryształów białka. Zademonstrowaliśmy procedurę wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych przeznaczonych do krystalizacji białek w układzie scalonym metodą mikrodializy oraz eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Użyliśmy materiałów produkcyjnych o wysokiej przezroczystości rentgenowskiej, kompatybilnych z krystalografią białek in situ.Zbieranie danych dyfrakcyjnych jest zautomatyzowane za pomocą wydrukowanej w 3D podpory dla chipów, które mogą być montowane bezpośrednio w liniach wiązki krystalografii makromolekularnej. Wszechstronność tego mikroprocesora wynika z zastosowania mikrodializy do odwracalnej kontroli warunków krystalizacji i mapowania diagramów fazowych przy użyciu małej objętości białka. Prototypowanie urządzenia jest proste, umożliwia wyprodukowanie do 30 mikroczipów w ciągu jednego dnia w czystym pomieszczeniu, przy użyciu stosunkowo niedrogich materiałów.Spodziewamy się, że te cechy chipów mogą być wykorzystane do seryjnych badań krystalografii rentgenowskiej trudniejszych celów białkowych.

crystallization-proteins-on-chip-microdialysis-for-situ-x-ray

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

W artykule przedstawiono metodę generowania kryształów białek pochodzonych z I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) za pomocą mikrozasiewania do generowania nowych warunków krystalizacji w rzadkich przesiewach matrycowych. Tacy można ustawić za pomocą robotów do dyspensowania płynów lub ręcznie.

Deriwatyzacja kryształów białek za pomocą I3C za pomocą losowego przesiewania macierzy mikronasion

Opisano wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia krystalizację enzymu za pomocą metody przeciwdyfuzyjnej, wprowadzenie substratu do kryształów poprzez moczenie, oraz określenie struktury 3D kompleksu enzym:substrat poprzez seryjną analizę kryształów wewnątrz chipa w temperaturze pokojowej.

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Tutaj prezentujemy protokół, jak określić ilość i rozkład metali w próbce za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej. Skupiamy się na komórkach przylegających i opisujemy metodę chemicznego utrwalania w celu przygotowania tej próbki. Następnie opisujemy, jak zamontować i zobrazować próbkę za pomocą synchrotronowego promieniowania rentgenowskiego.

Przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego

Przedstawiono dynamiczny pomiar jonów chlorkowych. Czas przejścia elektrody Ag/AgCl, podczas techniki chronopotencjometrycznej, może dać stężenie jonów chlorkowych w elektrolicie. Ta metoda nie wymaga stabilnej konwencjonalnej elektrody referencyjnej.

Dynamiczny pomiar elektrochemiczny jonów chlorkowych

Ta praca przedstawia protokół postępowania z cieczą i wprowadzania próbki do mikrokanału do analizy in situ spektrometrii mas jonów wtórnych biomolekuł białkowych w roztworze wodnym w czasie przelotu.

In Situ Charakterystyka uwodnionych białek w wodzie za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Poznaj metodę krystalizacji białek na chipie mikrofluidycznym z wykorzystaniem mikrodializy i dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Protokół umożliwia precyzyjną kontrolę warunków krystalizacji przy małych objętościach próbek.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Przeglądaj więcej filmów