Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

W artykule opisano protokół wytwarzania chipów mikroprzepływowych opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy oraz eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Jedną z głównych zalet tych mikroprocesorów jest wybór materiałów produkcyjnych, dzięki czemu chipy są kompatybilne z gromadzeniem danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Eksperymenty z krystalizacją w układzie scalonym wymagają małych objętości próbki białka, co zmniejsza całkowity koszt pracy z tymi makrocząsteczkami o wysokiej wartości.

Krystalizacja w układzie scalonym eliminuje również ręczne zbieranie delikatnych kryształów białka, często stosowane w połączeniu z chłodzeniem kriogenicznym podczas konwencjonalnych eksperymentów krystalograficznych. Ponadto nasze mikroczipy wykorzystują mikrodializę do krystalizacji białek, która jest metodą opartą na dyfuzji, mającą na celu zrównoważenie stężenia strącania przez półprzepuszczalną membranę, w celu zbliżenia się do stężenia kromulentów do krystalizacji białek i umożliwia precyzyjną i odwracalną kontrolę warunków krystalizacji. Mikrodializa w połączeniu z kontrolą temperatury może być stosowana do oddzielania zarodkowania od wzrostu kryształów w celu zbadania diagramów fazowych, poprzez zmianę stężenia strącania przy użyciu tej samej próbki białka.

Najpierw przygotuj 50 gramów bazy silikonowej PDMS i jej utwardzacza w stosunku 10 do jednego masy. Wymieszaj oba składniki w zlewce za pomocą szpatułki. Po wymieszaniu umieść mieszaninę w komorze próżniowej w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.

Umieść 25 gramów wstępnie zmieszanego PDMS w pierwszym SU8, aby opanować wzorce zawierające wzorce kanału mikroprzepływowego i filarów, do wysokości około pięciu milimetrów. Następnie wlej pozostałe 25 gramów PDMS do drugiego mastera SU8, zawierającego tylko wzory filarów. Utwardź dwie warstwy PDMS w piekarniku w temperaturze 338 kelwinów przez godzinę.

Wytnij utwardzone warstwy PDMS wokół wzorów mistrzów SU8 za pomocą skalpela i delikatnie oderwij formy PDMS od silikonowych wzorców. Umieść formę PDMS, obejmującą zarówno kanały, jak i filary, na szkiełku mikroskopowym z wzorami skierowanymi do góry. Wytnij mały kawałek membrany dializacyjnej z regenerowanej celulozy, aby pokryć centralny filar formy PDMS, który ma być komorą białkową.

Punkt odcięcia masy cząsteczkowej błony dializacyjnej dobiera się odpowiednio do masy cząsteczkowej próbki białka i substancji strącających roztworu krystalizacyjnego. Następnie należy ostrożnie oddzielić suchy kawałek membrany do dializy z regenerowanej celulozy. Wyciąć mały kawałek oddzielonej membrany dializacyjnej.

Rozmiar tego kawałka membrany zależy od konstrukcji chipa. A konkretnie zależy to od wymiarów środkowego filaru. Umieść kawałek membrany dializacyjnej na środkowym filarze formy PDMS, który jest wsparty na szklanym szkiełku, z filarem i kanałami skierowanymi do góry.

Następnie umieść drugą formę PDMS, w której tylko filary są skierowane w dół, na wierzchu formy PDMS, która jest już podparta na szklanym szkiełku. Wyrównaj wszystkie filary dwóch form PDMS. Kawałek membrany do dializy z regenerowanej celulozy jest umieszczony pomiędzy dwoma centralnymi filarami form PDMS.

Ten etap procedury produkcyjnej można przeprowadzić pod mikroskopem optycznym lub po prostu poprzez dokładną wizualną kontrolę wyrównania wszystkich filarów. Umieść zespół w komorze próżniowej i wysuszaj przez 30 minut w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza w formach PDMS i zwiększenia wprowadzania fotoutwardzalnej żywicy NOA, która zostanie opisana w następnym kroku tego protokołu. Wyjmij zespół z komory próżniowej i wypełnij pustą przestrzeń między dwiema formami PDMS fotoutwardzalną żywicą na bazie tioliny, NOA 81, przez wchłanianie kapilarne.

Nałóż żywicę na trzy z czterech stron zespołu. Umieść zespół w sieciowniku i utwardź żywicę NOA, wystawiając ją na działanie światła UV przez osiem sekund, używając skolimowanej lampy UV o mocy 35 miliwatów na centymetr kwadratowy. Wytnij kawałek PMMA o grubości 175 mikrometrów w standardowych wymiarach szkiełka mikroskopowego i zdejmij plastikową osłonę z każdej strony elementu PMMA.

Po zakończeniu pierwszej ekspozycji na promieniowanie UV usuń górną formę PDMS z częściowo usieciowaną żywicą NOA naklejoną na nią z dolnej formy PDMS i szkiełka podstawowego. Delikatnie dociśnij zespół górnej formy PDMS i częściowo utwardzoną żywicę NOA na elemencie PMMA. Umieść nowy zespół w urządzeniu sieciującym i ponownie utwardź żywicę NOA przez wystawienie na działanie światła UV przez 60 sekund.

Ostrożnie usuń górną formę PDMS. Chip do dializy wykonany z w pełni usieciowanej żywicy NOA, osadzony w membranie dializacyjnej z regenerowanej celulozy i podparty na kawałku PMMA, jest gotowy. Złącza dostępne w handlu należy przykleić w punktach wlotowych i wylotowych kanału mikroprzepływowego za pomocą szybkiego kleju epoksydowego.

Do obsługi płynów należy wybrać średnicę rurek PTFE w zależności od rozmiaru złączy. Probówki służą do wprowadzania roztworu krystalizacyjnego do kanału płynnego chipa dializacyjnego. Ręcznie odpipetować kroplę próbki białka znajdującą się w zbiorniku białkowym znajdującym się bezpośrednio na błonie dializy.

Objętość kropelki białka zależy od konstrukcji używanego mikroczipa. A konkretnie zależy to od objętości środkowego słupka i może to być 0,1 lub 0,3 mikrolitra. Ostrożnie nałóż cienką warstwę wysokopróżniowego smaru silikonowego wokół zbiornika białka.

Wytnij mały kawałek PMMA i delikatnie umieść go nad cienką warstwą smaru silikonowego. Wytnij kawałek taśmy kaptonowej, wystarczająco duży, aby zakryć kawałek PMMA umieszczony nad zbiornikiem białka i przykleić się do chipa NOA na wszystkich krawędziach. Próbka białka jest zamknięta w zbiorniku, a chip może być wykorzystany do eksperymentów krystalizacji.

Najpierw należy przygotować około 500 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego, mieszając odpowiednie objętości buforu i roztworów strącających. Wstrzyknąć roztwór krystalizacyjny w punkt chipa dializacyjnego przez złącza płynów, ręcznie za pomocą strzykawki lub za pomocą zautomatyzowanego systemu napędzanego ciśnieniem. Gdy kanał fluidyczny zostanie wypełniony roztworem krystalizacyjnym i nie zostanie w nim uwięzione powietrze, uszczelnij porty wlotowe i wylotowe chipa taśmą Parafilm.

Odpipetować odpowiednią objętość roztworu białkowego w zbiorniku białkowym i zamknąć próbkę białka w kapsułkach, jak to już opisano. Wzrost kryształów białka można wizualizować i rejestrować za pomocą kamery cyfrowej. Do produkcji mikroczipów do dializy wybraliśmy optycznie przezroczyste i biologicznie obojętne materiały, wykazujące wysoką kompatybilność z eksperymentami dyfrakcji rentgenowskiej in situ.

Oceniono szum tła generowany przez materiały składające się na przedział białkowy chipa, który znajduje się na bezpośredniej drodze wiązki promieniowania rentgenowskiego. Przedział białkowy składa się z regenerowanej celulozowej membrany dializowej, taśmy kaptonowej i dwóch warstw PMMA, jednej używanej jako substrat mikroczipów, a drugiej służącej do kapsułkowania próbki białka. Na tym zdjęciu zilustrowany jest szum tła generowany przez taśmę kaptonową, membranę do dializy z regenerowanej celulozy, warstwę PMMA oraz ich montaż.

Mimo że żywica fotoutwardzalna NOA stanowi główny korpus mikroczipów, nie jest uwzględniona w tych pomiarach, ponieważ nie jest częścią komory białkowej. Rozproszone pierścienie przypisywane oddziaływaniom promieniowania rentgenowskiego z materiałami można zaobserwować dla taśmy kaptonowej o rozdzielczości niższej niż cztery angstremy, PMMA od czterech do ośmiu angstremów, a membrany dializacyjnej od czterech do pięciu angstremów. Całkowity szum tła generowany przez chip jest obserwowany głównie w rozdzielczości niższej niż sześć angstremów, co wskazuje, że nie ma to wpływu na przetwarzanie danych dyfrakcyjnych lizozymu o wysokiej rozdzielczości.

Mikroczipy zostały zamontowane przed wiązką promieniowania rentgenowskiego za pomocą wydrukowanego w 3D wspornika, który zaprojektowaliśmy do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ i może pomieścić do trzech chipów jednocześnie. Przeprowadzono eksperymenty mające na celu ocenę skuteczności mikroczipów w krystalizacji białek rozpuszczalnych w modelu metodą mikrodializy. Kryształy lizozymu hodowano w temperaturze 293 kelwinów w dwóch różnych warunkach.

Pierwszy warunek krystalizacji zawierał 1,5 molowego chlorku sodu i 0,1 molowego octanu sodu. Drugi warunek krystalizacji zawierał jeden molowy chlorek sodu, 0,1-molowy octan sodu i 30% glikol polietylenowy 400 i został wybrany, aby wykazać kompatybilność mikroczipów i metody mikrodializy z osadami strącającymi o dużej masie cząsteczkowej i lepkich roztworach. Eksperymenty krystalizacji przeprowadzono w warunkach statycznych.

Po wyhodowaniu kryształów lizozymu na mikrochipie, wykorzystano je do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Mikroczipy zostały zamontowane na linii wiązki za pomocą wydrukowanego w 3D wspornika, a następnie zebrano kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej z dwóch kryształów lizozymu. Po obróbce danych dyfrakcji rentgenowskiej uzyskano mapę gęstości elektronów pojedynczego kryształu lizozymu z rozdzielczością 1,95 angstrema, jak pokazano na rysunku A.Rysunek B przedstawia mapę gęstości elektronów uzyskaną z rozdzielczością 1,85 angstremów.

Po połączeniu dwóch zestawów danych uzyskanych z dwóch różnych kryształów lizozymu, obie mapy gęstości elektrycznej pokazują szczegółowe informacje strukturalne, które można uzyskać za pomocą eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ przeprowadzonych bezpośrednio na mikroczipach dializacyjnych w temperaturze pokojowej, z pojedynczych lub wielu kryształów białka. Zademonstrowaliśmy procedurę wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych przeznaczonych do krystalizacji białek w układzie scalonym metodą mikrodializy oraz eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Użyliśmy materiałów produkcyjnych o wysokiej przezroczystości rentgenowskiej, kompatybilnych z krystalografią białek in situ.

Zbieranie danych dyfrakcyjnych jest zautomatyzowane za pomocą wydrukowanej w 3D podpory dla chipów, które mogą być montowane bezpośrednio w liniach wiązki krystalografii makromolekularnej. Wszechstronność tego mikroprocesora wynika z zastosowania mikrodializy do odwracalnej kontroli warunków krystalizacji i mapowania diagramów fazowych przy użyciu małej objętości białka. Prototypowanie urządzenia jest proste, umożliwia wyprodukowanie do 30 mikroczipów w ciągu jednego dnia w czystym pomieszczeniu, przy użyciu stosunkowo niedrogich materiałów.

Spodziewamy się, że te cechy chipów mogą być wykorzystane do seryjnych badań krystalografii rentgenowskiej trudniejszych celów białkowych.