Name: Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Naucz się przygotowywać klinowe plastry mózgu do badania obwodów neuronalnych z zachowaniem presynaptycznych połączeń. Ta metoda umożliwia wysokorozdzielcze pomiary elektrofizjologiczne in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program of the NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.
1. Przygotowania eksperymentalne
UWAGA: Szczegóły dotyczące przygotowania plastrów, w tym roztwór do krojenia, temperatura krojenia, temperatura inkubacji plastrów i aparatura (itp.) są specyficzne dla przygotowania pnia mózgu wykonanego w tym eksperymencie. Szczegóły inkubacji plastrów mogą być zmieniane w zależności od doświadczenia laboratoryjnego.
<ol>
	<li>Przygotuj wewnętrzne roztwory do mocowania kropek.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór cęgowy napięcia zawierający (w mM) 76 Cs-metanosulfonianu, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na 2-fosfokreatyna, 5 QX-314 i 0,01 hydrazydu Alexa Fluor-488. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą CsOH.</li>
		<li>Przygotować bieżący roztwór cęgowy zawierający (w mM) 125 K-glukonian, 5 KCl, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na 2-fosfokreatynę i 0,01 hydrazydu Alexa Fluor-488. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 100 ml 4% agaru, dodając 4 g agaru do 100 ml gorącej (prawie wrzącej) wody. Umieść na rozgrzanej płytce mieszającej, aby utrzymać temperaturę i mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Wlać do plastikowych szalek Petriego o średnicy 100 mm na głębokość około 1 cm i ostudzić. Wstaw do lodówki, aż będzie potrzebny.</li>
	<li>Przygotować 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierającego w mM: 124 NaCl, 1,2 CaCl2, 1,3MgSO4, 5 KCl, 26NaHCO3, 1,25 KH2PO4 i 10 dekstrozy. Bąbelkować karbogenem (5% CO2 / 95% O2 ) przez co najmniej 10 minut, a następnie w razie potrzeby dostosować końcowe pH do 7,4 za pomocą 1 M NaOH. Utrzymuj natlenienie i pH roztworu, bulgocząc w sposób ciągły karbogenem przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Przygotuj 200 ml roztworu do krojenia, dodając 1 mM kwasu kynureninowego do ACSF. Sonikować roztwór w sonikującej łaźni wodnej przez 10 minut, aż do rozpuszczenia kwasu kynureninowego. Ciągle bulgotać karbogenem i umieszczać na lodzie. 
	UWAGA: Podczas obchodzenia się z kwasem kynureniowym należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Zamontuj odpowiednie ostrze w wibratomie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Schłodź komorę do krojenia wibratomu, otaczając ją lodem.</li>
</ol>
2. Usunięcie mózgu z nienaruszonym korzeniem nerwu słuchowego do stymulacji
UWAGA: Myszy do tych eksperymentów uzyskano poprzez skrzyżowanie transgenicznych myszy ChAT-IRES-Cre na tle C57BL/6J z myszami reporterowymi tdTomato (Ai14). Myszy używane do histologii i elektrofizjologii miały początek po usłyszeniu (P14-P23), czyli około P12 u myszy. Neurony wyrażające tdTomato w jądrze brzusznym ciała trapezoidalnego (VNTB) zostały wcześniej scharakteryzowane jako neurony MOC w tej linii myszy57.
<ol>
	<li>Poddać zwierzę eutanazji (np. uduszenie CO2 ) i odciąć głowę zwierzęciu przy użyciu zatwierdzonych procedur instytucjonalnych.</li>
	<li>Za pomocą żyletki przetnij skórę w linii środkowej czaszki od nosa do tyłu szyi. Oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek wykonaj nacięcie w czaszce przez linię środkową, zaczynając od podstawy (koniec ogonowy w pobliżu rdzenia kręgowego) czaszki i kontynuując w kierunku nosa.</li>
	<li>Na szwie lambda wykonaj nacięcia w czaszce od linii środkowej, bocznie w kierunku ucha po obu stronach. Oderwij czaszkę, aby odsłonić mózg.</li>
	<li>Zaczynając od końca rostralnego, delikatnie unieś mózg z czaszki za pomocą małej szpatułki laboratoryjnej lub kleszczy. Przetnij nerw wzrokowy i kontynuuj delikatną pracę mózgu do tyłu, odsłaniając powierzchnię brzuszną.</li>
	<li>Przetnij nerwy trójdzielne, ściskając je drobnymi kleszczami w pobliżu brzusznej powierzchni pnia mózgu. 
	UWAGA: Zrób to ostrożnie, ponieważ nerw przedsionkowo-ślimakowy leży tuż poniżej i musi być nienaruszony do ewentualnej stymulacji.</li>
	<li>Umieść preparat na szklanej szalce Petriego wypełnionej zimnym roztworem do krojenia. Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie bąbelkuj karbogenem.</li>
	<li>Przytnij nerw twarzowy blisko pnia mózgu i odsłoń nerw przedsionkowo-ślimakowy.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy wepchnij końcówki w otwór, w którym nerw przedsionkowo-ślimakowy wychodzi z czaszki, tak daleko, jak to możliwe, i ściśnij nerw, aby go przeciąć, pozostawiając korzeń nerwowy przyczepiony do pnia mózgu. Powtórz to po drugiej stronie.</li>
	<li>Gdy oba korzenie nerwowe są wolne, usuń opony mózgowe i naczynia krwionośne z brzusznej powierzchni pnia mózgu w pobliżu ciała trapezu.</li>
	<li>Uwolnij mózg całkowicie od czaszki, ściskając pozostałe nerwy czaszkowe i tkankę łączną, dbając o zachowanie pozostałego rdzenia kręgowego, jeśli to możliwe.</li>
</ol>
3. Zablokuj i zamontuj mózg na scenie (dysk magnetyczny)
<ol>
	<li>Przygotuj powierzchnię mózgu do utrwalenia się do etapu, blokując mózg na poziomie skrzyżowania wzrokowego.
	<ol>
		<li>Z powierzchnią brzuszną do góry, ustabilizuj mózg za pomocą narzędzia, aby delikatnie unieruchomić rdzeń kręgowy, aby mózg nie przechylił się podczas następnego kroku.</li>
		<li>Na poziomie skrzyżowania wzrokowego użyj otwartych kleszczy, aby stworzyć płaszczyznę do blokowania mózgu poprzez włożenie przez mózg do dna naczynia. Włóż kleszcze pod kątem około 20° od pionu, tak aby końcówki wychodziły z grzbietowej powierzchni ogonowej mózgu do skrzyżowania wzrokowego.</li>
		<li>Przetnij wzdłuż kleszczy za pomocą żyletki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyklej mózg do powierzchni sceny.
	<ol>
		<li>Przygotuj mały blok (~1 cm3) 4% agaru dla wsparcia mózgu.</li>
		<li>Umieść małą kroplę kleju na scenie i rozprowadź ją w prostokąt, aby można było przykleić zarówno mózg, jak i blok agaru.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie unieś mózg i delikatnie przetrzyj nadmiar płynu za pomocą krawędzi ręcznika papierowego. Umieść zablokowaną powierzchnię na kleju, powierzchnia brzuszna będzie skierowana w stronę ostrza podczas krojenia.</li>
		<li>Delikatnie dociśnij blok agaru do grzbietowej powierzchni mózgu, aby podeprzeć go podczas krojenia i zapewnić prawidłowe ustawienie mózgu (tj. kąt).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pokrój mózg, aby utworzyć plasterek klinowy
UWAGA: Przygotuj wycinek mózgu za pomocą wibratomu, który ma korzeń nerwu ślimakowego po grubej stronie i przyśrodkowe neurony olivocochlear (MOC) oraz jądro przyśrodkowe ciała trapezoidalnego (MNTB) po cienkiej stronie.
<ol>
	<li>Umieść dysk magnetyczny z dołączonym mózgiem na podstawie stolika i umieść go w komorze krojenia z brzuszną powierzchnią mózgu skierowaną w stronę ostrza.</li>
	<li>Napełnij komorę lodowatym roztworem do krojenia i bąbelkuj karbogenem.</li>
	<li>Opuść ostrze do roztworu i pokrój plastry doogonowo do obszaru zainteresowania, aby upewnić się, że plastry są symetryczne. Jeśli plasterki wydają się asymetryczne, lekko przechyl stół montażowy, aby uzyskać symetrię. 
	UWAGA: Prędkości ostrza w zakresie 0,05-0,10 mm/s były skuteczne w krojeniu zdrowych plastrów i mogą się różnić w zależności od wieku zwierzęcia i regionu mózgu.</li>
	<li>Gdy plastry są symetryczne, przesuń stolik o ~15° (co odpowiada około 3 koncentrycznym pierścieniom na podstawie stolika) w jedną stronę. 
	UWAGA: Odsuń scenę od korzenia nerwu słuchowego, który chcesz zachować w plasterku.</li>
	<li>Kontynuuj ostrożne krojenie, aż korzeń nerwu słuchowego znajdzie się blisko powierzchni po jednej stronie, a nerw twarzowy będzie widoczny na powierzchni po drugiej stronie.</li>
	<li>Przesuń stolik z powrotem o 15° do pierwotnej pozycji.</li>
	<li>Odsuń ostrze od tkanki i obróć stage podstawa o 90° tak, aby boczna krawędź cienkiej strony była skierowana w stronę ostrza. Opuść ostrze o kilkaset mikronów, a następnie powoli zbliż ostrze do krawędzi tkanki. Powtarzaj to, aż ostrze dotknie bocznej krawędzi. Opuść ostrze do żądanej grubości cienkiej krawędzi plastra, tutaj dodatkowe dwieście mikronów. 
	UWAGA: Otrzymany plaster ma idealnie grubość ~300 mm na poziomie jądra brzusznego korpusu trapezowego (VNTB) po stronie, po której będzie miało miejsce zaciśnięcie łatki.</li>
	<li>Odsuń ostrze z powrotem od tkanki i obróć podstawę stopnia z powrotem tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana w jego stronę.</li>
	<li>Wykonaj cięcie, które wyznacza powierzchnię rostralną wycinka klina. Przenieś plasterek na kawałek papieru interfejsowego (1 cm2) powierzchnią ogonową w dół. Przenieść plaster do komory inkubacyjnej lub innego odpowiedniego aparatu do inkubacji w celu odzysku (30 min w temperaturze 35 °C). 
	UWAGA: Nerw twarzowy powinien być widoczny na obu półkulach wycinka na powierzchni rostralnej (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
</ol>
5. Konfiguracja i rejestracja elektrofizjologii
<ol>
	<li>Umieść plasterek klinowy w komorze nagrywającej i zabezpiecz plasterek harfą lub systemem stabilizującym. Perfaktorować tkankę w sposób ciągły z szybkością 7-10 ml/min ciepłym (35 °C) ACSF z bąbelkami karbogenu.</li>
	<li>Zidentyfikuj genetycznie znakowane neurony MOC w VNTB za pomocą epifluorescencji z filtrami emisyjnymi 561 nm do nagrań typu patch-clamp. Odwróć plasterek, jeśli nie ma komórek, które można potencjalnie załatać.</li>
	<li>Korzystając z optyki DIC, skup się na korzeniu nerwu słuchowego na grubej stronie plastra i użyj mikromanipulatora, aby przesunąć bipolarną elektrodę stymulującą wolfram w dół do korzenia nerwu słuchowego i delikatnie w powierzchnię tkanki. 
	UWAGA: Elektrody ssące były używane w eksperymentach stymulacji nerwów słuchowych w innych laboratoriach. Elektrody ze szkła Theta lub metody stymulacji optycznej mogą być stosowane, jeśli ma to zastosowanie do innych specyficznych preparatów.</li>
	<li>Przesuń pole widzenia z powrotem do VNTB, aby wybrać neuron MOC, który ma być celem elektrofizjologii klamry krosowej.</li>
	<li>Napełnij pipetę rejestracyjną roztworem wewnętrznym odpowiednim do proponowanego eksperymentu.</li>
	<li>Łatka i zapis z neuronu MOC w konfiguracji całej komórki. W razie potrzeby skompensuj pojemność membrany i rezystancję szeregową.</li>
	<li>Dostosuj amplitudę stymulacji elektrycznej korzenia nerwu słuchowego, aby uzyskać spójne zdarzenia postsynaptyczne w neuronie MOC. 
	UWAGA: Może być konieczne przesunięcie elektrody stymulacyjnej.</li>
	<li>Uruchom odpowiednie protokoły stymulacji, aby zaobserwować wywołane prądy synaptyczne w MOC (cęgi napięciowe) lub wzorce potencjału czynnościowego (cęgi prądowe). 
	UWAGA: Preparat do cięcia klinów może być używany z dowolnymi typowymi narzędziami do zaciskania plastrów, takimi jak luźne zapisy plastrów, farmakologia, optogenetyka, obrazowanie wapnia, odblokowywanie neuroprzekaźników itp.</li>
</ol>
6. Histological confirmation jąder pnia mózgu
UWAGA: Odbywa się to za pomocą barwienia krezylofioletowego, w stałym, ponownie pociętym kawałku klina. Metoda ta pozwala na wizualizację jąder, które znajdują się w wycinku.
<ol>
	<li>Po przygotowaniu plasterka klinowego, zanurz plasterek w utrwalaczu (4% PFA w PBS) na noc. Opłucz plasterek 3x przez 10 minut w PBS (temperatura pokojowa na shakerze), a następnie umieść w 30% sacharozie w PBS na noc w temperaturze 4 °C w celu krioochrony.</li>
	<li>Ponownie wyciąć plaster na mikrotomie do zamrażania (40-70 mm) i zebrać skrawki seryjne na płytce 24-dołkowej w PBS.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Umieść slajdy w wózku ślizgowym.</li>
	<li>Przygotuj roztwory fioletu krezylowego
	<ol>
		<li>Przygotować 1% octan fioletu krezylowego, mieszając 5 g octanu fioletu krezylowego w 500 ml dH2O</li>
		<li>Przygotować bufor octanowy, przygotowując najpierw 90 ml roztworu A (540 ml lodowatego kwasu octowego + 89,46 ml dH2O) i 10 ml roztworu B (136 mg octanu sodu w 10 ml dH2O). Połączyć roztwór A i roztwór B, uzyskując bufor octanowy.</li>
		<li>Połączyć 1% octanu fioletu krezylowego z buforem octanowym 1:1, aby uzyskać 0,5% fioletu krezylowego w buforze octanowym . Przefiltruj przed użyciem.</li>
		<li>Przygotować 95% i 70% etanol, rozcieńczając 100% etanol o odpowiednich objętościachdH2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj protokół barwienia fioletem krezylowym. Przesuwać wózek szkiełkowy przez tacki z roztworami, osuszając nadmiar roztworu na ręczniku papierowym między tacami: ksylen – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanolu – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% roztwór fioletu krezylowego – częste monitorowanie 8-14 minut, aż barwienie jądrowe stanie się ciemnofioletowe; dH2O – 3 min; 70% etanolu – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – dwukrotne zanurzanie ślizgów; ksylen – 5 min; Ksylen: 25 min do momentu montażu. 
	UWAGA: Ksylenów należy używać tylko pod wyciągiem.</li>
	<li>Zdejmuj szkiełka z ksylenu pojedynczo i natychmiast umieszczaj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą medium montażowego. Pozostaw podłoże montażowe do wyschnięcia (na noc).</li>
	<li>Sekcje obrazów.</li>
</ol>
7. Znakowanie biocytyny do śledzenia aksonów w żywych, nieutrwalonych tkankach
<ol>
	<li>Przygotuj plasterek klina jak powyżej (kroki 2-4).</li>
	<li>Przenieś plasterek na papier interfejsowy (~1 cm2). Pod mikroskopem preparacyjnym zlokalizuj CN na grubej stronie plasterka.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadmiar ACSF z obszaru otaczającego plasterek, przekręcając róg bibuły, aby odciągnąć ACSF od tkanki. Zapobiega to rozprzestrzenianiu się biocytyny na otaczające obszary wycinka, co mogłoby prowadzić do wychwytu do komórek poza CN.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy wybierz mały kryształ biocytyny i umieść go na powierzchni CN. Delikatnie wciśnij kryształ w tkankę, aby ułatwić kontakt z neuronami i późniejszy wychwyt do somatów. Powtórz ten krok, aby pokryć żądany obszar zainteresowania, w tym przypadku regiony CN zawierające neurony T-gwiaździste i GBC.</li>
	<li>Umieść plaster w komorze inkubacyjnej. Pozostawić plaster do inkubacji przez 2-4 godziny w temperaturze 35 °C, aby umożliwić pobieranie i transport biocytyny. Po inkubacji opłucz plasterek w ACSF, aby usunąć wszelkie cząsteczki biocytyny.</li>
	<li>Umieść plasterek w utrwalaczu (4% PFA w PBS) na noc. Płukać 3x przez 10 min w PBS.</li>
	<li>Cryoprotect plastrować w 30% sacharozie w PBS przez noc w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy plasterek opadnie.</li>
	<li>Wyciąć tkankę w celu wytworzenia przekrojów poprzecznych na mikrotomie zamrażającym na głębokości 70-100 mm.</li>
	<li>Przetwarzaj tkankę przy użyciu standardowych metod immunohistochemicznych za pomocą fluorescencyjnie sprzężonej streptawidyny. 
	UWAGA: Dodatkowe immunohistochemie można przeprowadzić na sekcjach, jeśli jest to pomocne do znakowania presynaptycznych ciał komórkowych, aksonów, receptorów lub innych cząsteczek synaptycznych ważnych dla wizualizacji obwodu (tj. Etapy przeciwciał pierwotnych nie powinny negatywnie wpływać na wtórną wizualizację biocytyny).</li>
	<li>Zobrazuj tkankę.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj procedura krojenia, zwana wycinkiem klinowym, jest skuteczna w utrzymywaniu nienaruszonych presynaptycznych obwodów neuronalnych, ale z dostępnością eksperymentów z wycinkami mózgu w celu analizy funkcji neuronów. Należy zachować dużą ostrożność w kilku początkowych krokach, aby zmaksymalizować użyteczność przygotowania do analizy obwodu. Wymiary klina należy potwierdzić za pomocą badania histologicznego, które jest integralną częścią potwierdzenia, że zarówno jądra presynaptyczne, jak i ich wypustki aksona...

Obserwacja aktywności obwodów nerwowych jest idealnie wykonywana za pomocą natywnych bodźców sensorycznych i informacji zwrotnych, oraz nienaruszonej łączności między obszarami mózgu, in vivo. Jednak przeprowadzanie eksperymentów, które dają rozdzielczość funkcji obwodów nerwowych w jednej komórce, jest nadal ograniczone przez wyzwania techniczne w nienaruszonym mózgu. Podczas gdy elektrofizjologia zewnątrzkomórkowa in vivo lub metody obrazowania wielofotonowego mogą być wykorzystywane do badania aktywności w nienaruszonym układzie nerwowym, interpretacja, w jaki sposób różne dane wejściowe integrują się lub pomiar podprogowych wejść synaptycznych pozostaje trudna. Zapisy in vivo całych komórek przezwyciężają te ograniczenia, ale są trudne do wykonania, nawet w obszarach mózgu, które są łatwo dostępne. Wyzwania techniczne związane z eksperymentami z rozdzielczością pojedynczych komórek są dodatkowo wzmacniane w niektórych populacjach neuronów, które znajdują się głęboko w mózgu, lub w populacjach rozproszonych przestrzennie, które wymagają narzędzi genetycznych do lokalizacji komórek in vivo (np. ekspresja genetyczna rodopsyny kanałowej w połączeniu z zapisem optrodowym) lub identyfikacji histochemicznej post hoc po znakowaniu miejsca rejestracji (np. za pomocą markerów specyficznych dla neurotransmisji). Neurony przyśrodkowe olivochlear (MOC), zlokalizowane dyfuzyjnie blisko brzusznej powierzchni pnia mózgu, cierpią z powodu powyższych ograniczeń1, co czyni je niezwykle trudno dostępnymi w eksperymentach in vivo.
Plastry mózgu (grubość ~100-500 μm) od dawna są używane do badania obwodów mózgu, w tym obwodów słuchowych pnia mózgu, ze względu na fizyczną segregację połączonych neuronów, które są zawarte w tym samym wycinku2,3,4,5,6,7,8,9. Eksperymenty z użyciem znacznie grubszych plastrów (>1 mm) zostały wykorzystane w innych laboratoriach, aby zrozumieć, w jaki sposób obustronne dane wejściowe integrują się w obszarach górnego kompleksu oliwkowego (SOC), w tym w przyśrodkowym górnym oliwce10,11. Wycinki te zostały przygotowane w taki sposób, że aksony nerwu słuchowego (AN) pozostały nienaruszone w wycinku i były stymulowane elektrycznie do zainicjowania uwalniania neuroprzekaźnika synaptycznego w CN, naśladując aktywność neuronów słuchowych pierwszego rzędu, gdy reagowałyby na dźwięk. Jedną z głównych wad tych grubych plastrów jest widoczność neuronów dla zapisów elektrofizjologicznych ("patchingu"). Łatanie staje się coraz trudniejsze, ponieważ liczne aksony w tym obszarze z wiekiem ulegają mielinizacji12,13,14,15, co sprawia, że tkanka jest optycznie gęsta i zasłania neurony nawet w typowym, cienkim wycinku mózgu. Naszym celem jest stworzenie preparatów in vitro, które bardziej przypominają łączność obwodową nagrań in vivo, ale z wysoką przepustowością i możliwościami nagrywania w wysokiej rozdzielczości wizualnie kierowanej elektrofizjologii patch-clamp w wycinkach mózgu.
Nasze laboratorium bada fizjologię neuronów słuchowego układu odprowadzającego, w tym neuronów MOC. Te neurony cholinergiczne dostarczają odprowadzające sprzężenie zwrotne do ślimaka, modulując aktywność zewnętrznych komórek rzęsatych (OHC)16,17,18,19,20. Wcześniejsze badania wykazały, że modulacja ta odgrywa rolę w kontroli wzmocnienia w klasie cochlea<sup="xref">21,22,23,24,25,26 i ochronie przed urazami akustycznymi27,28,29,30,31,32,33. U myszy neurony MOC są rozproszone w jądrze brzusznym ciała trapezoidalnego (VNTB) w słuchowym pniu mózgu1. Nasza grupa wykorzystała linię myszy ChAT-IRES-Cre skrzyżowaną z linią myszy reporterowej tdTomato, aby celować w neurony MOC w wycinkach pnia mózgu w oświetleniu epifluorescencyjnym. Wykazaliśmy, że neurony MOC otrzymują aferentne hamujące dane wejściowe z ipsilateralnego jądra przyśrodkowego ciała trapezoidalnego (MNTB), które jest z kolei pobudzane przez aksony z globularnych komórek krzaczastych (GBC) w przeciwległym jądrze ślimaka (CN)34,35,36,37,38. Dodatkowo, neurony MOC prawdopodobnie otrzymują pobudzające dane wejściowe z komórek T-gwiaździstych w przeciwległym CN39,40,41. Podsumowując, badania te pokazują, że neurony MOC otrzymują zarówno bodźce pobudzające, jak i hamujące pochodzące z tego samego (przeciwległego) ucha. Jednak neurony presynaptyczne i ich aksony zbiegające się na neuronach MOC nie są wystarczająco blisko siebie, aby były w pełni nienaruszone w typowym preparacie koronalnym. Aby zbadać, w jaki sposób integracja wejść synaptycznych z neuronami MOC wpływa na ich wzorce wypalania potencjału czynnościowego, koncentrując się na nowo opisanym hamowaniu, opracowaliśmy preparat, w którym możemy stymulować różne aferenty do neuronów MOC z jednego ucha w najbardziej fizjologicznie realistyczny sposób, ale z technicznymi korzyściami eksperymentów in vitro z wycinkami mózgu.
Plasterek klinowy to zmodyfikowany preparat z grubym plasterkiem przeznaczony do badania integracji obwodów w neuronach MOC (schematyzowany w Rysunek 1A). Na grubej stronie plastra klin zawiera odcięte aksony nerwu słuchowego (zwanego dalej "korzeniem nerwu słuchowego"), które wchodzą do pnia mózgu z obwodu i synapsy w CN. Korzeń nerwu słuchowego może być stymulowany elektrycznie w celu wywołania uwalniania neuroprzekaźników i aktywacji synaptycznej komórek w pełni nienaruszonego CN42,43,44,45,46. Ten format stymulacji ma kilka zalet dla analizy obwodów. Po pierwsze, zamiast bezpośrednio stymulować aksony T-gwiaździste i GBC, które dostarczają aferentny wkład do neuronów MOC, stymulujemy AN, aby umożliwić aktywację wewnętrznych obwodów obfitujących w CN. Obwody te modulują wyjście neuronów CN do ich celów w całym mózgu, w tym neuronów MOC46,47,48,49,50,51. Po drugie, polisynaptyczna aktywacja obwodów aferentnych od AN przez CN przed neuronami MOC pozwala na bardziej naturalny czas aktywacji i plastyczność w tych synapsach, tak jak miałoby to miejsce in vivo podczas stymulacji słuchowej. Po trzecie, możemy zmieniać nasze wzorce stymulacji, aby naśladować aktywność AN. Wreszcie, zarówno pobudzające, jak i hamujące projekcje monofoniczne do neuronów MOC są nienaruszone w wycinku klina, a ich integrację można zmierzyć w neuronie MOC z precyzją elektrofizjologii patch-clamp. Ogólnie rzecz biorąc, ten schemat aktywacji zapewnia bardziej nienaruszony obwód neuronom MOC w porównaniu z typowym preparatem do wycinków mózgu. Ten wycinek klina pnia mózgu może być również używany do badania innych obszarów słuchowych, które otrzymują hamujące dane z ipsilateral MNTB, w tym bocznej górnej oliwki, górnego jądra oliwkowego i przyśrodkowego górnego oliwki oliwkowej10,11,52,53,54,55,56. Poza naszym specyficznym przygotowaniem, ta metoda krojenia może być stosowana lub modyfikowana do oceny innych systemów z korzyściami płynącymi z utrzymania łączności danych wejściowych dalekiego zasięgu i poprawy wizualizacji neuronów dla różnych technik elektrofizjologii lub obrazowania w rozdzielczości pojedynczej komórki.
Ten protokół wymaga użycia sceny wibratomicznej lub platformy, którą można przechylić o około 15°. Tutaj używamy dostępnego na rynku 2-częściowego stolika magnetycznego, w którym "stolik" to metalowy dysk z zakrzywionym dnem umieszczony we wklęsłej magnetycznej "podstawie sceny". Stolik można następnie przesunąć, aby dostosować kąt cięcia. Koncentryczne okręgi na podstawie stolika służą do powtarzalnego szacowania kąta. Stolik i podstawa stolika są umieszczone w komorze krojenia, gdzie można również obracać magnetyczną podstawę stolika.

<table><tbody><tr><td>Preparaty eksperymentalne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, proszek</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423500</td><td>4% blok agarowy stosowany do stabilizacji tkanki mózgowej podczas sekcji wibratomu</td></tr><tr><td>AlexaFluor Hydrazide 488</td><td>Invitrogen</td><td>A10436</td><td>Fluorofor stosowany w roztworze wewnętrznym w celu potwierdzenia udanej łatki neuronowej MOC</td></tr><tr><td>Geny równowagi analitycznej</td><td> Scientific (Intramalls)</td><td>AV114</td><td>Chemikalia do ważenia</td></tr><tr><td>Dwustronna żyletka</td><td>Ted Pella</td><td>121-6</td><td>Ostrze do cięcia wibratomu</td></tr><tr><td>Kwas kynureninowy (5g)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375-5G</td><td>Plasterkowanie Dodatek ACSF stosowany w celu zmniejszenia aktywności neuronów podczas preparowania i krojenia w celu poprawy zdrowia tkanek do zaciskania łat</td></tr><tr><td>Miernik pH</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>13-620-451</td><td>Tester pH roztworu</td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego o średnicy 100 mm X 20 mm</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td> <td>12-556-002</td><td>4% Przygotowanie agaru</td></tr><tr><td>Mieszanie Płyta grzejna</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td> <td>11-500-150</td><td>Ogrzewanie dla 4% Przygotowanie</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> agaru<tr><td>Rozwarstwienie i krojenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261-250MG</td><td>Substancja chemiczna używana do śledzenia aksonów (sprzężona ze Streptawidyną 488)</td></tr> <tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Amscope</td><td>SM-1BN</td><td>Do precyzyjnego preparowania podczas usuwania mózgu</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Narzędzie do preparowania drobnych kleszczy</td></tr><tr><td>Pęseta ekonomiczna #3</td><td>WPI</td><td>501976</td><td>Kleszcze do preparowania</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego 150mm średnica x 15mm H</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>08-747E</td><td>Naczynie preparacyjne</td></tr><tr><td>Papier interfejsowy (membrana PCTE 203 x 254 mm 10um)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1220823</td><td>Inkubacja plastrów/aplikacja biocytyny</td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratome</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td>Vibratome do cięcia plastrów klinowych</td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo</td><td>Roboz</td><td>RS-6872</td><td>Narzędzie</td></tr> <tr><td>do preparowaniaOstrza jednosieczne ze stali węglowej</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-640</td><td>Żyletka do preparacji</td></tr><tr><td>Tarcza do próbek, orientująca</td><td>Leica</td><td>14048142068</td><td>Specjalistyczny stolik wibratomisowy do powtarzalnego przechylania</td></tr><tr><td>Spoonula</td><td>FisherSci</td><td>14-375-10</td><td>Narzędzie do preparowania</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Newegg</td><td>15187</td><td>Służy do klejenia tkanki do etapu</td></tr> <tr><td>wibratomuVannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> do preparacji<tr><td>Elektrofizjologia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1R Pionowy mikroskop konfokalny</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Elektrofizjologia i mikroskop obrazowy, może być dowolnym mikroskopem zgodnym z elektrofizjologią</td></tr><tr><td>Elektroda ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnicy wewnętrznej 1,1 mm, długości 10 cm</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10</td><td>Szkło do pipet z mocowaniem krosowym</td></tr><tr><td>Wypełniacz elektrod MicroFil</td><td>WPI</td><td>CMF20G</td><td>Napełniacz do pipet z elektrodą krosową</td></tr><tr><td>Podgrzewacz roztworu w linii</td><td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td><td>SH-27B</td><td>Grzałka systemu perfuzyjnego Slice</td></tr><tr><td>Systemy Multi-Micromanipulator</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>MPC-200 z MP285</td><td>Mikromanipulatory do zacisku krosowego i umieszczania elektrod stymulacyjnych</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet poziomych P-1000 do mikropipet szklanych</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>FG-P1000</td><td>Ściągacz do pipet z zaciskiem krosowym</td></tr><tr><td>Wzmacniacz krosowy i oprogramowanie</td><td>HEKA</td><td>EPC-10 / Patchmaster Dalej</td><td>Może to być dowolny wzmacniacz/oprogramowanie</td></tr><tr><td>Komora nagraniowa</td><td>Warner Instruments</td><td>RC26G</td><td>Slice "kąpiel" podczas nagrywania</td></tr><tr><td>Komora nagraniowa Harfa</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Stabilizuje plasterek podczas nagrywania elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Slice Inkubacja Custom</td><td>Build Podgrzewana</td><td></td><td>, natleniona komora trzymająca plastry podczas rekonwalescencji po krojeniu</td></tr><tr><td>Jednostka izolacji bodźców</td><td>A.M.P.I.</td>Jednostka izolacyjna <td>Iso-Flex</td><td>Stimulus do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Strzykawka 60CC</td><td>Fischer Scientific (Intramalls)</td><td>14-820-11</td><td>Elektrofizjologia obsługa płynów perfuzyjnych</td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td><td>TC-324C</td><td>Regulator temperatury systemu perfuzji</td></tr><tr><td>Slice Rurka 1/8 OD 1/16 ID</td><td>Fischer Scientific (Intramalls)</td><td>14-171-129</td><td>Elektrofizjologia obsługa płynów perfuzyjnych</td></tr><tr><td>Koncentryczna mikroelektroda bipolarna Tugsten</td><td>WPI</td><td>TM33CCINS</td><td>Elektroda stymulująca do elektrofizjologii</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 well Plate</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-556006</td><td>Histologia, zbieranie plastrów i barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Streptawidyna</td><td>Jackson Immuno labs</td><td>016-540-084</td><td>Przeciwciało wtórne do wizualizacji biocytyny</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Corning</td><td>Wytrząsarka CLS6780FP Sigma</td><td>do</td><td>mieszania immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Octan fioletu krezylowego</td><td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td><td>C5042-10G</td><td>Barwnik komórkowy do histologii</td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrza mikrotomu</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-210-052</td><td>Przesuwne ostrze mikrotomu</td></tr><tr><td>Filtr-strzykawka Nalgene 4mm Octan celulozy 0,2um</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>09-740-34A</td><td>Filtr strzykawkowy do napełniania pipet rejestrujących roztworem wewnętrznym</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Medium do montażu ślizgowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>Immunohistochemia fluorescencja montaż medium</td></tr><tr><td>szklane szkiełko naczynie barwiące ze stojakiem</td><td>Fisher Scientific ( Intramalls)</td><td>08-812</td><td>Komora do barwienia Cresyl Violet</td></tr><tr><td>Microm HM450 Mikrotom przesuwny</td><td>ThermoFisher</td><td>910020</td><td>Mikrotom do zamrażania do histologii</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe mikroskopu: Prostokąty 50mm X 24mm</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-543D</td><td>Szklana osłona przesuwna histochemiczna</td></tr><tr><td>Nośnik montażowy Permount Fisher</td><td>Scientific</td><td>SP15-100</td><td>Montaż sekcji Cresyl violet średnie</td></tr><tr><td>Slajdy Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034980</td><td>Szkiełka histologiczne</td></tr></tbody></table>

przygotowanie in vitro wedge slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Techniki elektrofizjologii in vitro mierzą aktywność pojedynczej komórki z precyzyjną rozdzielczością elektryczną i czasową. Wycinki mózgu muszą być stosunkowo cienkie, aby prawidłowo uwidocznić i uzyskać dostęp do neuronów w celu zaciśnięcia łatki lub obrazowania, a badanie in vitro obwodów mózgowych jest ograniczone tylko do tego, co jest fizycznie obecne w ostrym wycinku. Aby utrzymać korzyści płynące z eksperymentów in vitro z plastrami przy jednoczesnym zachowaniu większej części jąder presynaptycznych, opracowaliśmy nowatorski preparat warstwowy. Ten "plasterek klinowy" został zaprojektowany do nagrań elektrofizjologii z klamrą krosową w celu scharakteryzowania różnorodnych, monofonicznych, napędzanych dźwiękiem danych wejściowych do neuronów przyśrodkowych oliwoślimakowych (MOC) w pniu mózgu. Neurony te otrzymują pierwotne aferentne, pobudzające i hamujące dane wejściowe z neuronów aktywowanych przez bodźce w uchu przeciwległym i odpowiadającym mu jądrze ślimakowym (CN). Zaprojektowano asymetryczny wycinek mózgu, który jest najgrubszy w domenie rostro-ogonowej na bocznej krawędzi jednej półkuli, a następnie przerzedza się w kierunku bocznej krawędzi przeciwnej półkuli. Ten plasterek zawiera, po grubej stronie, korzeń nerwu słuchowego przekazujący informacje o bodźcach słuchowych do mózgu, wewnętrzne obwody CN oraz zarówno disynaptyczne pobudzające, jak i trisynaptyczne hamujące szlaki aferentne, które zbiegają się w przeciwległych neuronach MOC. Zapis odbywa się z neuronów MOC po cienkiej stronie wycinka, gdzie są one wizualizowane za pomocą optyki DIC do typowych eksperymentów z zaciskiem krosowym. Bezpośrednia stymulacja nerwu słuchowego jest wykonywana, gdy wchodzi on do słuchowego pnia mózgu, co pozwala na wewnętrzną aktywność obwodu CN i plastyczność synaptyczną w synapsach przed neuronami MOC. Dzięki tej technice można naśladować aktywację obwodu in vivo tak ściśle, jak to możliwe w obrębie wycinka. To przygotowanie warstwy klinowej ma zastosowanie do innych obwodów mózgu, w których analizy obwodów skorzystałyby na zachowaniu łączności upstream i danych wejściowych dalekiego zasięgu, w połączeniu z technicznymi zaletami fizjologii plasterków in vitro.

Badanie histologiczne skrawka klinowego 
Na potrzeby naszego badania funkcji neuronów pnia słuchowego, preparat skrawka klinowego został zaprojektowany tak, aby zawierał korzeń nerwu słuchowego oraz CN po stronie przeciwległej do neuronów MOC, z których prowadzono rejestrację (przykład skrawka pokazano na Rysunku 1B). Wstępne badanie histologiczne preparatu jest istotne w celu potwierdzenia, że skrawek zawiera jądra niezbędne do aktywacji obwodów oraz że projekcje aksonal...

Integracja różnych wejść synaptycznych do neuronów jest najlepiej mierzona w preparacie, który zachowuje wszystkie jądra presynaptyczne dla naturalnego wyczucia czasu i plastyczności obwodów, ale wycinki mózgu zazwyczaj zrywają wiele połączeń. Opracowaliśmy zmodyfikowany wycinek mózgu, aby naśladować aktywność obwodów in vivo, zachowując jednocześnie możliwość eksperymentowania in vitro.

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Eksperymenty z wycinkami mózgu pozwalają na badanie funkcji neuronalnych z wysoką rozdzielczością elektryczną i czasową, ale te wycinki zazwyczaj przecinają wiele połączeń presynaptycznych. Wycinek w kształcie klina utrzymuje bardziej nienaruszone obwody presynaptyczne. Ten zmodyfikowany wycinek mózgu utrzymuje bardziej kompletny obwód neuronalny podobny do in vivo, zapewniając jednocześnie korzyści z eksperymentów in vitro, takich jak wizualnie sterowane nagrania zacisków plastrów, farmakologia i obrazowanie aktywności.Dokładna geometria wbita w plastry może być oszacowana na podstawie lokalizacji neuronów w atlasie w obwodzie, ale integralność schematów presynaptycznych i aksonów należy określić za pomocą histologii. Zacznij od użycia żyletki, aby przeciąć skórę w linii środkowej czaszki od nosa do tyłu szyi. Oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę i zaczynając od podstawy czaszki i kontynuując w kierunku nosa, użyj małych nożyczek, aby wykonać nacięcie w czaszce przez linię środkową.Przy szwie lambda wykonaj nacięcia w czaszce od linii środkowej bocznie w kierunku ucha po obu stronach, aby odkleić czaszkę i odsłonić mózg. Zaczynając od końca rostralnego, użyj małej szpatułki laborat

in-vitro-wedge-slice-preparation-for-mimicking-vivo-neuronal-circuit

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Ten film pokazuje proces przygotowywania wycinków mózgu w kształcie klina w warunkach laboratoryjnych. Za pomocą wibratomu wytwarzany jest plasterek w kształcie klina z mózgu myszy o różnej grubości. Ten wycinek zawiera korzeń nerwu słuchowego umieszczony na grubszym końcu, podczas gdy neurony związane ze słuchem znajdują się na cieńszym końcu.

Przygotowanie klinowych wycinków mózgu do wizualizacji neuronów słuchowych

Film opisuje elektrofizjologiczny zapis synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych w wycinkach mózgu myszy. Plastry zawierające grzbietowe jądro kolankowate boczne (dLGN) umieszcza się w komorze rejestracyjnej. Pipetę stymulującą umieszcza się na przewodzie wzrokowym w celu stymulacji komórek zwojowych siatkówki (RGC) i zbadania synaps retinogenikulacyjnych lub jądra reticularis thalami w celu stymulacji neuronów korowych i zbadania synaps kortogenicznych. Po stymulacji RGC i neurony...

Badanie elektrofizjologiczne synaps retinogenikulacyjnych i kortykopochodnych w wycinkach mózgu myszy

Ten film demonstruje protokół stymulacji korzenia nerwu słuchowego i rejestrowania prądów postsynaptycznych w przyśrodkowych neuronach olivocochlear w wycinkach klina mózgu myszy.

Stymulacja korzeni nerwów słuchowych i nagrania prądu postsynaptycznego w klinie mózgu myszy

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Naucz się przygotowywać klinowe plastry mózgu do badania obwodów neuronalnych z zachowaniem presynaptycznych połączeń. Ta metoda umożliwia wysokorozdzielcze pomiary elektrofizjologiczne in vitro.

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

Przeglądaj więcej filmów