Name: Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie w badaniach nad rozwojem rozrodczym mężczyzn w ryżu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metodę transformacji Agrobacterium w ryżu do edycji genu OsABCG15 za pomocą CRISPR-Cas9. Technika ta umożliwia tworzenie linii męskiej sterylności z częstotliwością transformacji około 85,71%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Xiaofei Chen za dostarczenie młodych kwiatostanów ryżu i pomoc w przygotowaniu podłoża do hodowli tkanek ryżowych. Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (31900611).

1. budowa wektora ekspresji roślinnej sgRNA-CAS9 i transformacja za pośrednictwem Agrobacterium
<ol>
	<li>Celuj w męski sterylny gen OsABCG15 w ryżu zgodnie z opublikowaną literaturą28.</li>
	<li>Zaprojektuj sgRNA dla docelowego miejsca zlokalizowanego między 106–125 pz w drugim eksonie OsABCG15 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Użyj kinazy polinukleotydowej T4 do syntezy oligonukleotydów sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' i 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').</li>
	<li>Użyj endonukleazy BbsI, aby strawić wektor szkieletowy psgR-Cas929.</li>
	<li>Liżować zsyntetyzowane oligonukleotydy sgRNA za pomocą zlinearyzowanego szkieletu psgR-Cas9 za pomocą ligazy T4 zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Korzystając z HindIII/EcoRI, przetraw kasetę sgRNA z kroku 1.5 i sklonuj do miejsca HindIII/EcoRI wektora binarnego pCAMBIA1300 w celu stabilnej transformacji29.</li>
	<li>Potwierdź zbudowany plazmid przez trawienie enzymatyczne i sekwencjonowanie. Następnie przekształć konstrukt binarny w szczep Agrobacterium tumefaciens EHA105 i hodować go na płytkach selekcyjnych Kan/Rif w temperaturze 28 °C przez 2–3 dni.</li>
</ol>
2. Genetyczna transformacja ryżu i hodowla tkanek roślinnych
<ol>
	<li>Indukcja i regeneracja kalusa 
	UWAGA: Użyj świeżych młodych kwiatostanów ryżu jako materiału wyjściowego do wywołania kalusa (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Zbierz młode kwiatostany z pola ryżowego lub szklarni na etapie mejozy, określone na podstawie długości różyczki 1,6-4,8 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)29. Upewnij się, że kwiatostany ryżu są pokryte pochwą liściową. Przetrzyj każdy kwiatostan wacikiem nasączonym 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia przed ścięciem.</li>
		<li>Przynieś kwiatostan do czystej, sterylnej ławki. Pokrój go na małe kawałki (im mniejszy, tym lepiej) za pomocą wysterylizowanych nożyczek, a następnie przenieś sadzonki na płytkę Petriego zawierającą pożywkę NBD2 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B, Tabela 1).</li>
		<li>Inkubuj płytkę w ciemności w temperaturze 26 °C przez około 10-14 dni, aby wywołać kalus (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
		UWAGA: Nowo utworzony kalus należy wykorzystać do infiltracji Agrobacterium bezpośrednio (krok 2.2.7) lub ponownie przeprowadzić kondycję w świeżej pożywce NBD2, aby uzyskać więcej modzeli. Przenieś kalus do nowego podłoża NBD2 co 8–10 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transformacja i współuprawa
	<ol>
		<li>Do transformacji należy użyć bakterii A. tumefaciens zawierających plazmid binarny z kroku 1.6. Szczepy A. tumefaciens należy przechowywać w pożywce YEB (Tabela 1) z 50% glicerolem w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.</li>
		<li>Smugę A. tumefaciens z glicerolu o temperaturze -80 °C do pożywki agarowej YEB zawierającej selektywne antybiotyki (Tabela 1) i wzrost w temperaturze 25–28 °C przez 48–72 godzin, aby umożliwić pojawienie się kolonii.</li>
		<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki YEB selektywnymi antybiotykami do 5 ml płynnej pożywki YEB zawierającej te same selektywne antybiotyki (Tabela 1), w stożkowej sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Wstrząsać na wytrząsarce orbitalnej o sile 250 x g, w temperaturze 25–28 °C, aż bakterie osiągną OD600 0,5.</li>
		<li>Dodać 1 ml zawiesiny bakteryjnej do 100 ml pożywki YEB (Tabela 1) z tymi samymi selektywnymi antybiotykami w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml i wstrząsać na wytrząsarce orbitalnej o sile 250 x g, w temperaturze 28 °C przez 4 godziny.</li>
		<li>Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu zebrania bakterii. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad bakteryjny za pomocą pożywki AAM-AS (Tabela 1) i rozcieńczyć zawiesinę do OD600 = 0,4, 
		UWAGA: Idealny OD zawiesiny bakteryjnej ma kluczowe znaczenie dla efektywnej transformacji. Pomaga w eliminowaniu nadmiernego wzrostu bakterii na modzeniu.</li>
		<li>Zebrać około 150 zdrowych, rosnących, jasnożółtych, kruchych zarodkowych kalii z kroku 2.1.3 do sterylnej kolby o pojemności 150 ml. Dodaj 50-75 ml zawiesiny komórek bakteryjnych z kroku 2.2.6 do sterylnej kolby, a następnie dodaj trochę 10-25 ml świeżej pożywki AAM-AS, aby zanurzyć kalusy na 10-20 minut, od czasu do czasu wstrząsając.</li>
		<li>Ostrożnie wylać zawiesinę bakteryjną z kolby i osuszyć nadmiar zawiesiny bakteryjnej z modzela za pomocą sterylnej bibuły filtracyjnej #1 lub bibuły. Następnie umieść je na szalce Petriego z pożywką NBD-AS (Tabela 1) pokrytą sterylną bibułą filtracyjną #1. Inkubować w temperaturze 25–28 °C w ciemności przez 3 dni i sprawdzić, czy nie ma przerostu bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja pod kątem modzela odpornego
	<ol>
		<li>Po 3 dniach wspólnej uprawy przenieś kalie na sterylną szalkę Petriego ze sterylną bibułą filtracyjną.</li>
		<li>Susz kalię na powietrzu przez 2 godziny na czystej ławce. Upewnij się, że modzel nie przylega do bibuły filtracyjnej.</li>
		<li>Przenieść kalusy równomiernie za pomocą sterylnej pęsety na pożywkę pierwszorzędową NBD2 (z 40 mg/l higromycyny i 250 mg/l timentyny) (Tabela 1). Hodowla kalii przez 2 tygodnie w temperaturze 25–28 °C w ciemności.</li>
		<li>Po 2 tygodniach przenieść kalie równomiernie na nową płytkę zawierającą świeżą pożywkę selekcyjną NBD2 (z 40 mg/l higromycyny i 250 mg/l timentyną) (Tabela 1). Hodować kalus przez kolejne 2 tygodnie w temperaturze 25–28 °C w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie kalusa
	<ol>
		<li>Przenieść kalus na świeże podłoże MS (z 25 mg/l higromycyny i 150 mg/l timentyny) (Tabela 1). Hodowlę w świetle w temperaturze 25–28 °C przez około 2 tygodnie.</li>
		<li>Powtórz krok 2.4.1 jeszcze raz.</li>
		<li>Przenieś pąki pędów na nową pożywkę MS (z 10 mg/l higromycyny), aby rozmnożyć więcej pędów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja korzeni
	<ol>
		<li>Przenieść nowe pędy na pożywkę 1/2 MS (tabela 1). Hodowla w świetle w temperaturze 25 °C - 28 °C. Przekształcone rośliny wytwarzają korzenie w ciągu 2 tygodni.</li>
		<li>Po 1 tygodniu przenieś rośliny do czystych doniczek przykrywających roślinę, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Identyfikacja genotypu
<ol>
	<li>Zbierz młode liście z nowo wytworzonych roślin w celu całkowitej ekstrakcji DNA przy użyciu metody bromku cetylotrimetyloamoniowego (CTAB)31.</li>
	<li>Używając genomowego DNA jako matrycy, wybierz startery (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' i Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' znajdujące się w regionie higromycyny) do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu walidacji integracji i częstotliwości transgenu (<silna klasa = "xfig">Figura 4). Następujące warunki PCR: 94 °C przez 5 min; 36 cykli (94 °C przez 30 s; 56 °C przez 30 s; 72 °C przez 1 min); 72 °C przez 7 min. Udane reakcje PCR dają amplikon 604 pz.</li>
	<li>Wykonaj kolejny PCR w celu amplifikacji regionu genomowego otaczającego miejsca docelowe CRISPR przy użyciu specyficznych starterów (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3' i OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAAACATTGCTAT 3') w celu identyfikacji genotypu transformantów. Warunki PCR są takie same jak w kroku 3.2.</li>
	<li>Użyj fragmentów PCR z kroku 3.3 bezpośrednio do sekwencjonowania Sangera w celu identyfikacji mutacji.</li>
</ol>
4. Obserwuj podstawowy fenotyp mutanta
<ol>
	<li>Przygotować roztwór I2-KI: rozpuścić 2 g KI (jodku potasu) w 10 ml wody destylowanej, a następnie dodać do niego 0,2 g I2 (jodu sublimowanego). Po wymieszaniu doprowadzić całkowitą objętość do 100 ml wodą destylowaną.</li>
	<li>Przygotuj roztwór FAA (63% bezwodnego etanolu, 5% lodowatego kwasu octowego, 5% formaldehydu i 27% wody) i wymieszaj przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować 0,5% roztwór do barwienia błękitem toluidynowym: rozpuścić 0,5 g błękitu toluidynowego w 100 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Przeprowadź wegetatywną obserwację fenotypową, obrazując całe rośliny za pomocą aparatu cyfrowego.</li>
	<li>Wykonaj obserwację fenotypu reprodukcyjnego, usuń palea i lemma z różyczki. Rób zdjęcia całych pylników pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Obserwuj żywotność pyłku przez barwienie jodem.
	<ol>
		<li>Zbierz dojrzałe kłoski ryżowe przed kwiatem, usuń paleę i lemę, aby uwolnić pylniki.</li>
		<li>Weź 6 pylników i umieść je na szklanym szkiełku. Dodaj 1 kroplę wody destylowanej, dobrze rozdrobnij pylnik pęsetą, aby uwolnić ziarna pyłku, a następnie dodaj 2-3 krople roztworu I2-KI. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Obserwuj pod mikroskopem o małym powiększeniu. Ziarna pyłku barwione na czarno wykazują bardziej żywotną żywotność, brak koloru lub barwione na żółto-brązowo są skarłowaciałe lub zdegenerowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj półcienki fragment pylnika ryżowego
	<ol>
		<li>Umieść kwiaty ryżu z różnych etapów rozwoju w roztworze FAA. Odkurzyć materiały w temperaturze 4 °C (zwykle 15 minut), aby utrwalacz mógł wniknąć w tkanki, aż materiał opadnie na dno butelki zbiorczej.</li>
		<li>Wymień na nowe rozwiązanie FAA następnego dnia. Gdy materiał opadnie na dno, zastąp go 70% etanolem i przechowuj w temperaturze 4 °C do długotrwałego użytkowania.</li>
		<li>Odwodnić materiały o różnych gradientach etanolu (70%, 80%, 95% za każdym razem przez 30 minut, 100% etanolu przez 2 godziny, 100% etanolu zawierającego niewielką ilość barwnika Safranina przez 2 godziny). 
		UWAGA: Dodaj trochę barwnika Safranin do drugiego 100% etanolu, aby zabarwić pylniki, aby ułatwić późniejsze cięcie.</li>
		<li>Osadzanie należy wykonywać zgodnie z instrukcją producenta (Tabela materiałów). Następnie piec w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 48 godzin przed pokrojeniem.</li>
		<li>Przeciąć próbkę do grubości 2 μm za pomocą mikrotomu. Dodaj kroplę wody na szklane szkiełko. Następnie podnieś cienkie odcinki zawierające bloki pylników za pomocą kleszczy i połóż je na powierzchni kropli wody na szkiełkach.</li>
		<li>Umieść szkiełka na łaźni wodnej w temperaturze 50 °C, aby całkowicie rozłożyć sekcje i pozwolić im mocno przylegać do szkiełka.</li>
		<li>Użyj 0,5% roztworu błękitu toluidynowego, zabarwiaj szkiełka przez 30 minut. Następnie spłucz wodą i wysusz w dygestorium. Uszczelnij neutralnym klejem do drzew. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i wysusz w dygestorium.</li>
		<li>Obserwuj i sfotografuj próbkę pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf">http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf</a> (2013).</li>
<li>FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf">http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf</a> 109551-109555 (2017).</li>
<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Becoming+a+model+plant%3A+The+importance+of+rice+to+plant+science%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li>
<li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li>
<li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+breeding+in+wheat%3A+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li>
<li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosis%3A+revisiting+the+magic%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li>
<li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+food+security%3A+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li>
<li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782(2020).</li>
<li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473(2013).</li>
<li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants%3A+biology+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+in+the+genomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li>
<li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824(2008).</li>
<li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+rice+%28Oryza+sativa+L.%29+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li>
<li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li>
<li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796(2006).</li>
<li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+japonica+rice+%28Oryza+sativa%29+cultivar%2C+Taichung+65%2C+by+the+Agrobacterium-mediated+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li>
<li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+%28Oryza+sativa+L.%29+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li>
<li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li>
<li>Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li>
<li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li>
<li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li>
<li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49(2011).</li>
<li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li>
<li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li>
<li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415(2016).</li>
<li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein%2C+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li>
<li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li>
<li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+plant+development%3A+from+zygote+to+spikelet%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li>
<li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li>
<li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis%3A+resources+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Rice%22%5BJournal%5D)">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39(2013).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229(2013).</li>
</ol>

Sztuczne genowe męskie, sterylne mutanty są tradycyjnie generowane przez losową mutagenezę fizyczną, chemiczną lub biologiczną. Chociaż są to potężne techniki, ich przypadkowa natura nie jest w stanie wykorzystać ogromnej ilości nowoczesnej wiedzy genomicznej, która ma potencjał, aby zapewnić dostosowane do potrzeb ulepszenia w hodowli molekularnej32. System CRISPR-Cas9 jest szeroko stosowany w roślinach ze względu na proste i niedrogie sposoby manipulowania i edycji DNA29,33</su...

Ryż jest najważniejszą rośliną uprawną, szczególnie w krajach rozwijających się, i stanowi podstawowe pożywienie dla ponad połowy światowej populacji. Ogólnie rzecz biorąc, popyt na ziarno ryżu rośnie i przewiduje się, że wzrośnie o 50% do 2030 r. i o 100% do 2050 r1,2. Przyszła poprawa plonów ryżu będzie musiała wykorzystać różnorodne zasoby molekularne i genetyczne, które sprawiają, że ryż jest doskonałym modelem do badań nad roślinami jednoliściennymi. Należą do nich wydajny system transformacji, zaawansowana mapa molekularna i publicznie dostępna baza danych wyrażonych znaczników sekwencji, które były generowane przez wiele lat3,4. Jedną ze strategii mających na celu poprawę plonów jest produkcja nasion hybrydowych5, której centralnym elementem jest możliwość manipulowania męską płodnością. Zrozumienie molekularnej kontroli płodności samców w uprawach zbóż może pomóc w przełożeniu kluczowej wiedzy na praktyczne techniki usprawniające produkcję nasion hybrydowych i zwiększające produktywność upraw6,7.
Transformacja genetyczna jest kluczowym narzędziem dla badań podstawowych i rolnictwa komercyjnego, ponieważ umożliwia wprowadzanie obcych genów lub manipulowanie endogennymi genami w roślinach uprawnych, a także prowadzi do powstania genetycznie modyfikowanych linii. Odpowiedni protokół transformacji może pomóc w przyspieszeniu badań nad biologią genetyczną i molekularną w celu uzyskania podstawowego zrozumienia regulacji genów8. U bakterii transformacja genetyczna zachodzi naturalnie; Jednak u roślin jest to wykonywane sztucznie przy użyciu technik biologii molekularnej9,10. Agrobacterium tumefaciens to przenoszona przez glebę bakteria Gram-ujemna, która powoduje chorobę żółciową korony roślin poprzez przenoszenie T-DNA, regionu plazmidu Ti, do komórki roślinnej za pośrednictwem systemu wydzielania typu IV11,12. U roślin transformacja za pośrednictwem A. tumefaciens jest uważana za szeroko rozpowszechnioną metodę modyfikacji genów, ponieważ prowadzi do stabilnej i niskiej liczby kopii integracji T-DNA z genomem gospodarza13. Ryż transgeniczny został po raz pierwszy wygenerowany w wyniku transformacji genów za pośrednictwem Agrobacterium w połowie lat 90. XX wieku w odmianie japonica14. Korzystając z tego protokołu, w ciągu 4 miesięcy uzyskano kilka linii transgenicznych o wydajności transformacji 10%–30%. Badanie wykazało, że istnieją dwa kluczowe etapy udanej transformacji: jednym z nich jest indukcja embrionalnego kalusa z dojrzałych nasion, a drugim jest dodanie acetosyringonu, związku fenolowego, do kultury bakteryjnej podczas wspólnej hodowli, co pozwala na wyższą wydajność transformacji w roślinach14,15. Protokół ten był szeroko stosowany z niewielkimi zmianami w japonica16,17,18,19, a także w innych odmianach, takich jak indica20,21,22,23 i tropikalny japonica24,25. Rzeczywiście, ponad 80% artykułów opisujących transformację ryżu wykorzystuje transformację genów za pośrednictwem Agrobacterium jako narzędzie13. Do tej pory opracowano kilka protokołów transformacji genetycznej przy użyciu nasion ryżu jako materiału wyjściowego do indukcji kalusa16,17,18,19. Jednak bardzo niewiele wiadomo o młodych kwiatostanach jako eksplantatach do produkcji kalusa. Ogólnie rzecz biorąc, ważne jest ustanowienie szybkiego, powtarzalnego i wydajnego protokołu transformacji i regeneracji genów na potrzeby genomiki funkcjonalnej i badań nad ulepszaniem upraw.
W ostatnich latach postęp technologii CRISPR-Cas9 zaowocował precyzyjnym mechanizmem edycji genomu, który pozwala zrozumieć funkcję genów i dostarczyć agronomiczne ulepszenia dla hodowli roślin26,27. CRISPR jest również bardzo obiecujący w zakresie manipulacji rozwojem rozrodczym mężczyzn i produkcją hybryd. W tym badaniu wykorzystaliśmy system nokautu genów przy użyciu technologii CRISPR-Cas9 i połączyliśmy go z wydajnym protokołem transformacji genów ryżu przy użyciu młodych kwiatostanów jako eksplantatów, tworząc w ten sposób stabilne męskie sterylne linie do badania rozwoju reprodukcyjnego.

<table><tbody><tr><td>Kwas 1-naftalenooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td></td></tr><tr><td>2, Kwas 4-dichlorofenoksyoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-benzyloaminopuryna (6-BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000561</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10002918</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek aneuryny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Pepton bakteriologiczny</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100636</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z wołowiny</td><td>Sangon Biotech A600114</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004808</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Hydrolizat kwasu kazeinowego</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek kobaltu(II)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>Penwodzian siarczanu miedzi(II)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glukoza bezwodna</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63011037</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa, dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EOS Cyfrowe lustrzanki jednoobiektywowe i kompaktowe aparaty systemowe</td><td>Canon</td><td>EOS 700D</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>W pełni zautomatyzowany mikrotom obrotowy</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica RM 2265</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62011516</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>H370</td><td></td></tr><tr><td>Inozytol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63007738</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011517</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza(II) siedmiowodny</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012116</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0753</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62004034</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62004736</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>G229</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat siarczanu manganu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy</td><td>NIKON</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0765</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>jodek potasu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>Azotan potasu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>1001721933</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek pirydoksyny (B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47862</td><td></td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Pekin XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>R501</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny molibdenian sodu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019816</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy stereoskopowe</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica M205 A</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy do zatapiania Technovit 7100</td><td>Heraeus Teknovi, Niemcy</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna do sekcji parafinowych</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sangon Biotech</td><td>A515245</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10024018</td><td></td></tr></tbody></table>

transformacja genetyczna za pośrednictwem agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie w badaniach nad rozwojem rozrodczym mężczyzn w ryżu

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Męska bezpłodność jest ważną cechą agronomiczną dla produkcji nasion hybrydowych, która zwykle charakteryzuje się funkcjonalnymi wadami męskich organów rozrodczych/gamet. Najnowsze postępy w technologii edycji genomu CRISPR-Cas9 pozwalają na wysoką skuteczność edycji i oszczędność czasu w mutacjach nokautujących endogennych genów kandydujących w określonych miejscach. Ponadto transformacja genetyczna ryżu za pośrednictwem Agrobacterium jest również kluczową metodą modyfikacji genów, która została szeroko przyjęta przez wiele publicznych i prywatnych laboratoriów. W tym badaniu zastosowaliśmy narzędzia do edycji genomu CRISPR-Cas9 i z powodzeniem wygenerowaliśmy trzy męskie sterylne zmutowane linie poprzez ukierunkowaną edycję genomu OsABCG15 w odmianie japonica. Zastosowaliśmy zmodyfikowaną metodę transformacji ryżu za pośrednictwem Agrobacterium, która może zapewnić doskonały sposób na genetyczną kastrację w produkcji nasion hybrydowych ryżu. Rośliny transgeniczne można uzyskać w ciągu 2–3 miesięcy, a homozygotyczne transformanty poddano badaniom przesiewowym poprzez genotypowanie przy użyciu amplifikacji PCR i sekwencjonowania Sangera. Podstawową charakterystykę fenotypową męskiej sterylnej linii homozygotycznej przeprowadzono poprzez obserwację mikroskopową męskich narządów rozrodczych ryżu, analizę żywotności pyłku za pomocą barwienia jodkiem potasu (I2-KI) półcienkiego przekroju poprzecznego rozwijających się pylników.

Przedstawiono tutaj zastosowanie technologii edycji genów w celu stworzenia linii męsko sterylnej do przyszłych badań poprzez transformację genetyczną ryżu za pośrednictwem Agrobacterium. Aby stworzyć linię męsko sterylną osabcg15, do konstrukcji wektora binarnego wykorzystano mutogenezę za pośrednictwem CRISPR-Cas9. sgRNA było sterowane przez promotor OsU3, natomiast kaseta ekspresyjna hSpCas9 była sterowana przez podwójny promotor 35S, a wektor pośredni został złożony w pojedynczym wektorze binarnym <...

Ta praca opisuje użycie technologii edycji genomu CRISPR-Cas9 do wyeliminowania endogennego genu OsABCG15, a następnie zmodyfikowanego protokołu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium w celu wytworzenia stabilnej męsko-sterylnej linii w ryżu.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie w badaniach nad rozwojem rozrodczym mężczyzn w ryżu

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Młode kwiatostany jako eksplant do produkcji kalusa są ważne dla ustanowienia szybkiej i wydajnej transformacji genów oraz metody regeneracji w celu ujawnienia funkcji genów, a także dla poprawy plonów. Młode kwiatostany jako eksplant do produkcji kalusa są ważne dla ustanowienia szybkiej i wydajnej transformacji genów oraz metody regeneracji w celu ujawnienia funkcji genów. Demonstracja wideo tej techniki pomoże widzowi zrozumieć proces konserwacji materiałów w celu wytworzenia pożądanego transgenicznego wyrównania bez marnowania czasu i wysiłku.Zacznij od zebrania młodych kwiatostanów ryżu z pola ryżowego lub szklarni na etapie mejozy, upewniając się, że są one pokryte pochwą liściową. Przetrzyj każdy kwiatostan wacikiem nasączonym 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia przed ścięciem. Przynieś kwiatostan na sterylną ławkę laboratoryjną i pokrój go na małe kawałki wysterylizowanymi nożyczkami, a następnie przenieś sadzonki na płytkę Petriego zawierającą pożywkę NBD2.Inkubuj płytkę w ciemności w temperaturze 26 stopni Celsjusza przez 10 do 14 dni, aby wywołać kalus. Aby przeprowadzić transformację, przenieś pojedynczą kolonię z białej płytki EB z selektywnymi antybiotykami do pięciu mililitrów płynnej pożywki YEB zawierającej te same antybiotyki w stożkowej sterylnej probówce o pojemności 50 mililitrów. Potrząśnij probówką na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 250 razy g i 25 do 28 stopni Celsjusza, aż bakterie osiągną OD 600 0,5.Dodaj jeden mililitr zawiesiny bakteryjnej do 100 mililitrów pożywki YEB z tymi samymi selektywnymi antybiotykami w stożkowej kolbie o pojemności 250 mililitrów i potrząsaj kolbą na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 250 razy g i 28 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Odwirować kulturę przy 4 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu zebrania bakterii. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z podłożem AAM AS, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do OD 600 0,4.Po inkubacji zebrać około 150 zdrowych, jasnożółtych zarodkowych kalii do sterylnej kolby o pojemności 150 mililitrów. Dodaj 50 do 75 mililitrów zawiesiny komórek bakteryjnych do kolby, a następnie dodaj 10 do 25 mililitrów świeżej pożywki AAM AS, aby zanurzyć kalię na 10 do 20 minut, od czasu do czasu wstrząsając. Ostrożnie wylać zawiesinę bakteryjną z kolby i osuszyć kalusy sterylną bibułą filtracyjną, następnie umieścić je na szalce Petriego z pożywką NBD AS i przykryć bibułą filtracyjną.Inkubuj kaliby w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza w ciemności przez trzy dni, sprawdzając je pod kątem przerostu bakterii. Po trzech dniach wspólnej uprawy przenieś kalia na sterylną szalkę Petriego za pomocą bibuły filtracyjnej, a następnie wysusz je na powietrzu przez dwie godziny na czystej ławce. Upewnij się, że kalusy nie przylegają do bibuły filtracyjnej i przenieś je do głównego podłoża selekcyjnego NBD2.Po dwóch tygodniach przenieś kalie równomiernie na nową płytkę zawierającą świeżą pożywkę selekcyjną, a następnie przenieś kalię na świeżą pożywkę MS w celu różnicowania, a pąki pędów na pożywkę MS z 10 miligramami na litr higromycyny, aby rozmnożyć więcej pędów. Przenieś nowe pędy na połową pożywki MS w celu indukcji korzeni i hoduj je pod światłem w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza. Przekształcone rośliny powinny wytworzyć korzenie w ciągu dwóch tygodni.Aby przeprowadzić obserwację fenotypu reprodukcyjnego, usuń palea i lemma z kwiatu i zobrazuj całe pylniki pod mikroskopem stereoskopowym. Aby zaobserwować żywotność pyłku, zbierz dojrzałe kłoski ryżu przed kwitnieniem i usuń palea i lemę, aby uwolnić pylniki. Weź sześć pylników i umieść je na szklanym szkiełku.Dodaj jedną kroplę wody destylowanej, zmiażdż pylnik pęsetą, aby uwolnić ziarna pyłku, a następnie dodaj dwie do trzech kropli roztworu jodu i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj szkiełko pod mikroskopem o małym powiększeniu. Ziarna pyłku barwione na czarno wykazują bardziej żywotną żywotność, podczas gdy ziarna bez koloru lub te zabarwione na żółtobrązowo są skarłowaciałe lub zdegenerowane.Aby wykonać mikroskopię przekroju poprzecznego, użyj 0,5% roztworu błękitu toluidynowego do barwienia szkiełek przez 30 minut, a następnie spłucz je wodą i wysusz w dygestorium. Po wyschnięciu uszczelnij szkiełka neutralnym klejem do drzew, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i wysusz je w dygestorium, a następnie zobrazuj próbkę pod mikroskopem. Protokół ten został wykorzystany do stworzenia męskiej sterylnej linii przez transformację genetyczną w ryżu za pośrednictwem Agrobacterium.Zarodkowe kaliusy były bezpośrednio wykorzystywane do transformacji lub subkulturowane w celu proliferacji, aby uzyskać więcej kalii do dalszej infekcji. Po wspólnej hodowli przez 48 godzin, kalusy zostały przeniesione do drugiej rundy pożywki selekcyjnej. Po 10 do 14 dniach przekształcone kalia wykazywały nowo utworzone mikrokalie, podczas gdy nieprzekształcone kali brązowieją i umierają.Później zdrowe i kremowe kalie zostały przeniesione do podłoża regeneracyjnego. Na przekształconych kaliach stopniowo pojawiały się zielone plamy. Te zielone plamki hodowano w pożywce regeneracyjnej, aby umożliwić wzrost pędów, a następnie przeniesiono do pożywki połówkowej MS w celu wywołania korzeni.Później zebrano zdrowe i energicznie rosnące pędy z dobrze rozwiniętymi korzeniami. Łącznie uzyskano 21 zregenerowanych sadzonek. Amplifikacja PCR dla regionu higromycyny wykazała, że częstotliwość transformacji wynosiła około 85,71%Transformanty zostały zgenotypowane w celu identyfikacji mutacji w miejscach docelowych sgRNA.Spośród 18 roślin transgenicznych, osiem linii heterozygotycznych i trzy linie homozygotyczne były CRISPR CAS9 dodatnie. Homozygotyczne mutanty nokautujące zostały zweryfikowane przez podstawową obserwację męskich narządów rozrodczych. Pylniki osabcg15 były mniejsze i jaśniejsze niż u typu dzikiego i nie miały dojrzałych ziaren pyłku.Przeprowadzono mikroskopię przekroju poprzecznego w celu zbadania defektów morfologicznych pylników w osabcg15. W stadium 10 mikrospory typu dzikiego stały się okrągłe i wakuolizowane ciemnoniebieską zabarwioną egzyną. W przeciwieństwie do tego, mikrospory osabcg15 zapadły się i uległy degradacji.Podczas prób zastosowania tego protokołu ważne jest, aby upewnić się, że pobrany materiał jest w fazie mejozy i kontrolować czas schnięcia kalii.

agrobacterium-mediated-genetic-transformation-transgenic-production

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Beernink, B. M. i in. Bezpośrednia agroinokulacja sadzonek kukurydzy poprzez wstrzyknięcie klonów zakaźnych wirusa mozaiki lisogona oraz wirusa mozaiki trzciny cukrowej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem Agrobacterium do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów. Opisuje proces zakażenia Agrobacterium , systemowe rozprzestrzenianie się wirusa oraz zmiany fenotypowe wywołane interferencją RNA.

Dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem agrobakterii do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów

W tym filmie pokazujemy genetyczną transformację genomu ryżu za pomocą wektora binarnego Agrobacterium tumefaciens. Bakteria ta ułatwia przenoszenie obcego plazmidu DNA za pomocą białek wirulencji Agrobacterium.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium: metoda genetycznej transformacji genomu ryżu za pomocą genetycznie modyfikowanych Agrobacterium tumefaciens

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Ze względu na jej wszechstronne zastosowanie jako gatunku modelowego w różnych dziedzinach nauki, istnieje potrzeba stworzenia zestawu narzędzi do transformacji genetycznej u babki lancetowatej (Plantago lanceolata). Tutaj, przy użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, przedstawiono protokół, w wyniku którego powstają stabilne linie transgeniczne o wydajności transformacji wynoszącej 20%.

Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Protokół opisuje hodowlę odpornych odmian ryżu skrobiowego za pomocą technologii edycji genomu w precyzyjny, wydajny i technicznie prosty sposób.

Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

Przedstawiamy wydajny, zoptymalizowany protokół transformacji apłciowej obojburzliwej odmiany Brassicaceae, Rorippa aquatica, wywoływanej przez Agrobacterium, bez wymagających zasobów procedur hodowli tkanek sterylnych. Wykorzystanie markera transformacji wizualnej i pipeline'u regeneracji pędów skutecznie wygenerowało transformanty bliskie klonalne, co przyczyniło się do dalszych badań nad adaptacją roślin do środowiska podwodnego.

Efektywna transformacja agrobakterii oparta na regeneracji bezpłciowego gatunku z rodziny kapustnych, Rorippa aquatica

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Poznaj metodę transformacji Agrobacterium w ryżu do edycji genu OsABCG15 za pomocą CRISPR-Cas9. Technika ta umożliwia tworzenie linii męskiej sterylności z częstotliwością transformacji około 85,71%.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie w badaniach nad rozwojem rozrodczym mężczyzn w ryżu (Wideo) | JoVE Journal

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie w badaniach nad rozwojem rozrodczym mężczyzn w ryżu

Przeglądaj więcej filmów