Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Tkanki biologiczne rosną w trójwymiarowym miękkim środowisku, w którym komórki są narażone na różne sygnały mechaniczne. Nasza metoda pozwala na rozciąganie hydrożeli w sposób trójwymiarowy w celu zbadania reakcji biomechanicznych. Technika ta umożliwia równomierne rozciąganie hydrożeli wzdłuż ich grubości podczas wykonywania obrazowania na żywo.

Dodatkowo geometria hydrożelu może być modyfikowana do dowolnego rozmiaru i kształtu. Wiedza o tym, jak komórki i macierz zewnątrzkomórkowa reagują na siły, jest ważna dla ujawnienia, w jaki sposób rozwijają się tkanki i postępują choroby. Może to prowadzić do potencjalnego rozwoju terapii przeciwnowotworowych i modeli inżynierii tkankowej.

Zacznij od użycia wycinarki laserowej lub ręcznej, aby stworzyć gumowy pasek z otworem pośrodku. Wytnij prostokąt folii hydrofobowej tak, aby był szerszy niż paski silikonowe i umyj plastikowe naczynie 70% etanolem. Po wysuszeniu niestrzępiącymi się chusteczkami umieść folię uszczelniającą w naczyniu i umieść jeden silikonowy pasek z plastikową folią usuniętą z jednej strony na środku każdego kawałka folii uszczelniającej.

W celu utworzenia żelu fibrynowego należy równomiernie dostarczyć 2,5 mikrolitra fibrynogenu znakowanego na zimno do silikonowego wycięcia każdego paska, tak aby cały obwód każdego wycięcia stykał się z fibrynogenem, uważając, aby w żadnym miejscu roztworów nie tworzyły się kieszenie powietrzne ani pęcherzyki. Natychmiast dodaj 2,5 mikrolitra schłodzonej trombiny bezpośrednio do każdego roztworu fibrynogenu i szybko wymieszaj roztwory, ostrożnie pipetując, przesuwając końcówkę po całej mieszaninie, aby uzyskać jak najbardziej jednorodny roztwór. Po wymieszaniu umieść przykryte naczynie w inkubatorze na 30 minut w celu polimeryzacji żelu.

Pod koniec inkubacji dodaj do naczynia wystarczającą ilość PBS, aby zanurzyć żelowe konstrukcje silikonowe i ostrożnie wyjmij każdą próbkę z naczynia, upewniając się, że warstwa folii uszczelniającej pozostaje przyklejona do paska. Powoli odklejając się od jednego końca silikonu do drugiego, ostrożnie odłącz folię uszczelniającą od każdego kawałka silikonu, a następnie umieść pasek z powrotem w naczyniu i umieść naczynie na stoliku mikroskopu świetlnego, aby ocenić stan próbki. Aby załadować próbkę do urządzenia rozciągającego, napełnij wannę PBS i umieść silikonowy pasek zawierający żel do próbki w poprzek górnej części wanny, tak aby końce paska znajdowały się po obu stronach wanny.

Umieść zaciski i paski tkaniny, a następnie dokręć tak, aby wszystkie elementy były połączone, tworząc jeden prosty pasek z wycięciem pośrodku. Umieść materiał na studni i zabezpiecz szkiełko nakrywkowe na dnie studni, a następnie umieść aluminiową ciecz w urządzeniu do rozciągania. Napełnij studzienkę jednym do dwóch mililitrów pożywki komórkowej PBS i umieść w urządzeniu żelową konstrukcję z tkaniny paskowej.

Clamp pasek tkaniny we wsporniku tak, aby wycięcie żelu znajdowało się pośrodku, zanim ostrożnie umieścisz i zablokujesz wkładkę z kołkiem na miejscu w urządzeniu. Umieść i zablokuj drugą stronę tkaniny we wrzecionie i umieść urządzenie rozciągające wraz z dołączoną próbką na stoliku mikroskopu konfokalnego. Użyj USB, aby podłączyć mikrokontroler do komputera i podłącz serwomotor do mikrokontrolera.

Następnie otwórz moduł sterujący urządzenia rozciągającego na komputerze, aby zobrazować próbkę. Aby określić, czy próbka jest odpowiednia do eksperymentu, użyj obrazowania na żywo w niskiej rozdzielczości, aby zeskanować cały żel i określić najniższą pozycję Z, w której widoczna jest pełna przyczepność do wewnętrznych ścianek wycięcia, bez rozdarć i pęcherzyków. Po zanotowaniu położenia Z mikroskopu, zeskanuj interfejs etykiety fluorescencyjnej żelu i paska silikonowego, aby określić pełną przyczepność żelu do silikonu na całym jego obwodzie.

Po zeskanowaniu przesuń stolik w kierunku Z, aż nie będzie już ciągłości w żelu i zanotuj górną granicę pozycji Z. Następnie odejmij górną granicę kierunku Z od dolnej granicy, aby obliczyć grubość próbki. Aby określić pozycję wstępnego rozciągania próbki, kliknij Go to Zero Servo POS w oprogramowaniu modułu, aby upewnić się, że serwomotor znajduje się w pozycji zerowej i przymocuj serwomotor do urządzenia rozciągającego, uważając, aby nie obciążać próbki.

Podczas obrazowania kliknij przycisk plus jeden, aby przesunąć silnik o jeden stopień na raz w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Gdy prawa strona wycięcia przesunie się, kliknij przycisk minus jeden, aby odwrócić próbkę do przedostatniej pozycji, aby utrzymać próbkę pod minimalnym napięciem. Kliknij przycisk Set Min Servo Position, aby ustawić pozycję odniesienia i uchwycić obraz z pojedynczym kawałkiem żelu w powiększeniu 40 razy i wysokiej rozdzielczości przedstawiający cały obszar żelu jako punkt odniesienia dla analizy końcowej.

Po uzyskaniu wszystkich obrazów przesuwaj serwomotor o jeden stopień na sekundę, aż do osiągnięcia żądanej wielkości rozciągnięcia. Przy każdej wielkości rozciągnięcia, dla której pożądana jest analiza, sprawdź, czy żel nie oderwał się od silikonu w żadnym punkcie na swoim obwodzie, skanując interfejs między żelem a silikonem, a następnie uchwyć zestaw obrazów stosu kafelków Z o wysokiej rozdzielczości całego obszaru żelu do analizy końcowej. Powiększanie i ręczne śledzenie agregatów ściegów podczas rozciągania żelu umożliwia obliczenie lokalnych odkształceń żelu w kierunku osiowym i prostopadłym.

Zazwyczaj pasma osiowe rozchodzą się stosunkowo liniowo od silikonowej krawędzi wycięcia do środka żelu i są większe niż ściskające prostopadłe odkształcenia. Tutaj pokazane są obrazy w dużym powiększeniu typowego nierozciągniętego i stosunkowo izotropowego hydrożelu oraz wodoru pod wysokim 80% odkształceniem przedstawiającym wysoce wyrównane włókna w kierunku rozciągania. Analiza reorientacji włókien ujawniła w przybliżeniu liniową zależność między wyrównaniem włókien a zewnętrznym naprężeniem na wycięciu do 40% z umiarkowanym nasyceniem przy naprężeniach powyżej 40%Jak pokazano w tej analizie wyrównania włókien, wraz ze wzrostem zewnętrznego naprężenia na wycięciu, wyrównanie włókien wzrasta, zgodnie z ogólną krzywą nieliniową.

Należy zauważyć, że reakcja żelu na rozciąganie jest stosunkowo jednolita wzdłuż jego grubości Z. Jak pokazano w tej wstępnej symulacji elementów skończonych przeprowadzonej na ciągłym materiale 2D, mata barwna waha się od 38 do 42%, co wskazuje, że szczepy żelu są stosunkowo jednorodne w całym okrągłym obszarze żelu. Ważne jest, aby hydrożel całkowicie przylegał do wewnętrznych ścianek wycięcia geometrycznego, ponieważ przyczepność i ciągłość mają kluczowe znaczenie dla niezawodnego rozciągania próbek.

Modyfikując geometrię silikonowego wycięcia, możemy zaprogramować gradienty w wyrównaniu odkształceń i włókien, dzięki czemu podczas osadzania komórek możemy analizować reakcję na te gradienty.