Name: Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Poznaj metodę automatycznej krystalizacji dializowej z wykorzystaniem urządzenia OptiCrys do uzyskiwania dużych, wysokiej jakości kryształów białek. Protokół opiera się na diagramach fazowych krystalizacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MBS dziękuje za wsparcie ze strony LABEX VALO GRAL w ramach umowy z 2015 roku. NJ przyjmuje do wiadomości Międzynarodowy Program Badań Doktoranckich CEA (Irtelis) w celu uzyskania stypendium doktoranckiego. Autorzy potwierdzają finansowanie z Programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o grant Marii Skłodowskiej-Curie nr 722687. Autorzy są również wdzięczni dr Esko Oksanenowi (ESS, Lund) i dr Jean-Luc Ferrerowi (IBS, Grenoble) za pomocne rozmowy i spostrzeżenia. IBS potwierdza integrację z Interdyscyplinarnym Instytutem Badawczym w Grenoble (IRIG, CEA).

<ol><li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+crystallography%3A+opportunities%2C+challenges%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li>
<li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction%3A+D-xylose+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li>
<li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3AStructural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li>
<li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+protein+crystallography%3A+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li>
<li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonneté, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li>
<li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li>
<li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22REVIEW+Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , doi: 10.1107/S0907444997005374 (1998).</li>
<li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li>
<li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li>
<li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization%3A+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li>
<li>Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li>
<li>Garciá-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li>
<li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li>
<li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li>
<li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+and+phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li>
<li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+temperature+to+crystallize+proteins%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+and+Design%22%5BJournal%5D)">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li>
<li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase%2C+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme%2C+complexed+with+8-azaxanthin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li>
<li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li>
<li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li>
<li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3AStructural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Różne zmienne fizyczne, chemiczne i biologiczne wpływają na krystalizację białek, wpływając na rozpuszczalność białek21. Wśród tych zmiennych, temperatura i skład chemiczny roztworu krystalizacyjnego są tutaj wykorzystywane w połączeniu z techniką dializy w celu ulepszenia i wyhodowania dużych, wysokiej jakości kryształów biomakrocząsteczek do badań dyfrakcji neutronów. Wykorzystując wiedzę na temat diagramów fazowych, krystalizacja jest bardziej przewidywalna. Chociaż możliwe jest również badanie przesiewowe różnych warunków krystalizacji w podejściu szeregowym, głównym celem zastosowania przedstawionych racjonalnych podejść jest oddzielenie i kontrola kinetyki zarodkowania i wzrostu kryształów.
Podobnie jak w przypadku wszystkich badań krystalizacji, wysokiej jakości czyste i jednorodne próbki białek oraz bezpyłowe roztwory krystalizacyjne zwiększają wskaźnik powodzenia eksperymentu. Filtracja i odwirowanie roztworów są niezbędnymi krokami w opisanych protokołach. Znajomość właściwości fizykochemicznych badanych białek, takich jak masa cząsteczkowa (w celu wyboru odpowiedniej membrany do dializy), punkt izoelektryczny i rozpuszczalność białek, ma kluczowe znaczenie dla zaprojektowania eksperymentu optymalnego wzrostu kryształów. Należy również wziąć pod uwagę stabilność białek w różnych temperaturach lub przy użyciu różnych substancji chemicznych, aby zapobiec utracie próbki i zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu. Biorąc pod uwagę zakres temperatur OptiCrys (233,0–353,0 ± 0,1 K), za jego pomocą można krystalizować szeroki zakres białek. Warto jednak podkreślić, że białka, które są przede wszystkim termostabilne, takie jak białka ze źródeł ciepłolubnych, odniosłyby największe korzyści w kontrolowanych temperaturowo eksperymentach z wielkoobjętościowym wzrostem kryształów oferowanych przez ten instrument.
Korzystając z komory dializacyjnej o małej objętości (w przypadku korzystania z OptiCrys) lub przycisków do mikrodializy oraz monitorując kilka temperatur i warunków krystalizacji (np. siatki stężenia strącania lub pH), możliwe jest uzyskanie informacji na temat lokalizacji granicy strefy metastabilnej (równowaga kinetyczna między strefami zarodkowania i metastabilnymi). Jest to nieocenione przy projektowaniu udanego eksperymentu z hodowlą kryształów, zwłaszcza w przypadku nowych kandydatów na białka w krystalizacji. Bez tych informacji eksperymenty mogą rozpocząć się od obszaru diagramu fazowego o wysokim przesyceniu, zbyt daleko od granicy strefy metastabilnej, aby łatwo kontrolować zarodkowanie kryształów. Chociaż można podjąć próbę rozpuszczenia osadu białkowego, na przykład poprzez zwiększenie temperatury w przypadku rozpuszczalności bezpośredniej, w przypadku białek o zmniejszonej termostabilności, utrzymywanie próbki w wysokiej temperaturze przez dłuższy okres czasu może sprawić, że wytrącanie się białka stanie się nieodwracalne. Tak więc najlepsza strategia polega na zastosowaniu warunków początkowych z niższym przesyceniem zlokalizowanych w pobliżu granicy metastabilności, gdzie można kontrolować zarodkowanie i uniknąć wytrącania białek. W związku z tym wstępne badanie przesiewowe krystalizacji zmniejsza ryzyko wytrącenia się białka w komorze dializacyjnej i zwiększa wskaźnik powodzenia eksperymentu.
Po zaprojektowaniu eksperymentu kolejnym ważnym krokiem jest przygotowanie komór dializacyjnych (OptiCrys) lub przycisków do mikrodializy. Zapobieganie tworzeniu się pęcherzyków powietrza w komorze dializowej/przycisku dializacyjnym zwiększa szansę na pomyślną krystalizację, zwłaszcza w przypadku stosowania małych objętości. Obecność pęcherzyków powietrza w komorze dializacyjnej może również zmienić kinetykę procesu krystalizacji i zmniejszyć odtwarzalność eksperymentu (ponieważ powierzchnia kontaktu białka z roztworem została zmodyfikowana). Nie tylko białko, ale także roztwór krystalizacyjny może mieć wpływ na powodzenie eksperymentu. Używanie nowych probówek o pojemności 50 ml w systemie pompowania za każdym razem, gdy chce się rozpocząć nowy eksperyment i mycie rurek po każdym eksperymencie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i pozwala uniknąć tworzenia się kryształów soli w aparacie.
Stosowanie przycisków do mikrodializy jest alternatywą, gdy OptiCrys nie jest dostępny. Strategie optymalizacji krystalizacji i monitorowania wzrostu kryształów, o których mowa powyżej, muszą być realizowane ręcznie. Zazwyczaj wymaga to przebywania poza inkubatorem termoregulowanym, co może być problematyczne, gdy regulacja temperatury jest krytycznym krokiem w opisanej metodologii. Nie ułatwia to zmiany składu chemicznego roztworów krystalizacyjnych, ani monitorowania wzrostu kryształów za pomocą obrazowania, więc proces wzrostu kryształów nie może być kontrolowany w czasie rzeczywistym.
Znajomość diagramu fazowego jest podstawą korzystania ze stanowiska do krystalizacji OptiCris do systematycznego hodowania dużych, wysokiej jakości kryształów w sposób zautomatyzowany. Kontrola parametrów fizykochemicznych, takich jak temperatura, stężenie środka strącającego i pH podczas krystalizacji, przesuwa równowagę białko-roztwór po dobrze zdefiniowanej trajektorii kinetycznej na diagramie fazowym. Uzupełnieniem jest zastosowanie membrany dializacyjnej w celu dostosowania transportu masy i stworzenia kontrolowanego gradientu w komorze krystalizacyjnej, który wpływa na wielkość i jakość kryształów. Dlatego wykorzystanie zarówno danych termodynamicznych, jak i trajektorii kinetycznych jest niezbędne do kontrolowania procesu krystalizacji w celu wyhodowania kryształów wysokiej jakości. Dzięki OptiCris systematyczne diagramy fazowe w przestrzeni wielowymiarowej mogą być badane przy użyciu podejścia szeregowego przy użyciu znacznie mniejszej ilości materiału niż dotychczas. Aby zademonstrować tę metodologię, przedstawiamy tutaj studium przypadku z modelowym białkiem, lizozymem białka jaja kurzego. Stosując i opanowując przedstawiony tutaj protokół, można go dostosować do rzeczywistych systemów białkowych 5,14,17,18.

Zrozumienie zależności między strukturą a funkcją białek i mechanizmu szlaków fizjologicznych często opiera się na znajomości pozycji atomów wodoru (H) i sposobu przenoszenia ładunku w obrębie białka1,2. Ponieważ atomy wodoru słabo rozpraszają promieniowanie rentgenowskie, ich położenie można określić tylko za pomocą danych dyfrakcji rentgenowskiej o bardzo wysokiej rozdzielczości (>1 A)3,4. I odwrotnie, krystalografia neutronów może być wykorzystana do uzyskania dokładnego położenia atomów wodoru w makrocząsteczkach biologicznych, ponieważ atomy wodoru i deuteru (H2, izotop wodoru) mają długości rozpraszania mniej więcej równe wielkości tlenu, azotu i węgla5. Jednak strumień neutronów z dostępnych źródeł neutronów jest słabszy niż z wiązek promieniowania rentgenowskiego, więc często musi być kompensowany dla2,3. Można to osiągnąć poprzez wymianę H naH2 i/lub zwiększenie objętości kryształów w celu zmniejszenia niespójnego rozpraszania wodorów i zwiększenia stosunku sygnału do szumu obrazów dyfrakcyjnych.
Istnieją różne podejścia do krystalizacji (odpowiedni schematyczny diagram fazowy jest pokazany w Rysunek 1) do uzyskiwania dużych i wysokiej jakości kryształów zarówno dla rentgenowskiej, jak i neutronowej krystalografii bio-makromolekularnej6. W dyfuzji pary kropelka przygotowana z mieszaniny białka i roztworu krystalizacyjnego jest równoważona w czasie, poprzez odparowanie wody lub innych lotnych substancji, w zbiorniku zawierającym wyższe stężenie środka strącającego tego samego roztworu krystalizacyjnego. Wzrost stężenia białka i środka strącającego w kropelce prowadzi do przesycenia wymaganego do spontanicznego zarodkowania, po którym następuje wzrost kryształów w tych jądrach6,7. Chociaż dyfuzja pary wodnej jest najczęściej stosowaną techniką hodowli kryształów4, procesu krystalizacji nie można precyzyjnie kontrolować8. W metodzie dyfuzji swobodnej granicy faz roztwór krystalizacyjny dyfunduje do stężonego roztworu białkowego, bardzo powoli kierując układ w kierunku przesycenia. Tę metodę można uznać za metodę wsadową z powolnym tempem mieszania6,9,10,11,12. W metodzie wsadowej białko jest szybko mieszane z roztworem krystalizacyjnym, co prowadzi do szybkiego przesycenia, a co za tym idzie równomiernego zarodkowania z wieloma kryształami3,7. Metoda ta stanowi około jednej trzeciej wszystkich struktur zdeponowanych obecnie w Banku Danych o Białkach. Metoda dializy jest również stosowana do hodowli wysokiej jakości i dobrze dyfrakcyjnych kryształów białkowych. W metodzie dializy cząsteczki środka strącającego dyfundują ze zbiornika przez półprzepuszczalną membranę do oddzielnej komory z roztworem białka. Kinetyka równowagi zależy od różnych czynników, takich jak temperatura, wielkość porów błony oraz objętość i stężenie próbek białek i czynników krystalizacji6.
Diagramy faz krystalizacji mogą być używane do opisywania różnych stanów białka w funkcji różnych zmiennych fizycznych lub chemicznych3. Jak pokazano na rysunku Rysunek 1, każdą technikę krystalizacji można zobrazować jako wykorzystującą inną trajektorię kinetyczną, aby dotrzeć do stref zarodkowania i metastabilności takiego diagramu6,10,13. Dostarcza to informacji o rozpuszczalności białek i stężeniu białka, przy którym obserwuje się równowagę termodynamiczną między kryształem a roztworem, znajdując w ten sposób optymalne warunki do zarodkowania i wzrostu3,14. Na dwuwymiarowym diagramie fazowym stężenie białka jest wykreślane jako funkcja jednej zmiennej, a pozostałe zmienne są utrzymywane na stałym poziomie15. Na takim diagramie fazowym, gdy stężenie białka jest poniżej krzywej rozpuszczalności, roztwór znajduje się w obszarze nienasyconym i nie zachodzi zarodkowanie ani wzrost kryształów. Powyżej tej krzywej znajduje się strefa przesycenia, w której stężenie białka jest wyższe niż granica rozpuszczalności3,14. Jest ona dalej podzielona na trzy regiony: strefę metastabilną, strefę spontanicznego zarodkowania i strefę opadów. W strefie metastabilnej przesycenie nie jest wystarczające, aby zarodkowanie nastąpiło w rozsądnym czasie, ale może nastąpić wzrost zaszczepionych kryształów. Agregacja i opady są preferowane w strefie opadów, gdzie przesycenie jest zbyt wysokie14,15.
Gdy zostanie osiągnięte wystarczające przesycenie do spontanicznego zarodkowania, pojawią się pierwsze jądra10. Wzrost kryształów prowadzi do zmniejszenia stężenia białka aż do osiągnięcia granicy rozpuszczalności. Dopóki przesycenie pozostaje w pobliżu krzywej rozpuszczalności, nie będzie znaczącej zmiany wielkości kryształów. Wykazano jednak, że zmiany temperatury i składu chemicznego roztworu krystalizacyjnego (na przykład stężenie środka strącającego) wpływają na rozpuszczalność białek i mogą prowadzić do zainicjowania dalszego wzrostu kryształów8,13,16.
Ponieważ dializa jest korzystna dla wzrostu kryształów dobrej jakości, stanowisko do krystalizacji OptiCrys zilustrowane w Rysunek 2, zostało zaprojektowane i opracowane w naszym laboratorium w celu kontrolowania krystalizacji w sposób w pełni zautomatyzowany8. W tym celu zostało napisane oprogramowanie z LabVIEW, które umożliwia kontrolę i monitorowanie temperatury zestawu do dializy w zbiorniku przepływowym w kontakcie z elementami Peltiera, za pośrednictwem sterownika elektronicznego i agregatu chłodniczego. To samo oprogramowanie automatycznie reguluje również skład chemiczny roztworu krystalizacyjnego (na przykład wymianę środków krystalizacyjnych) za pomocą wielokanałowego systemu fluidycznego. Dodatkowo kamera cyfrowa i mikroskop odwrócony służą do wizualizacji i rejestracji procesu krystalizacji. Dostępne są dwie komory krystaliczne o objętości 15 μl i 250 μl do hodowli kryształów do różnych celów. Ponieważ proces krystalizacji jest odwracalny, badanie przesiewowe pod kątem różnych warunków jest możliwe przy użyciu zaledwie kilku mikrolitrów roztworu białkowego, o ile próbka nie jest uszkodzona8. W rezultacie, zastosowanie tej metody minimalizuje ilość użytego materiału białkowego.
Z poprzednich prac8, jest oczywiste, że podczas procesu wzrostu kryształów, obserwacje in situ muszą być przeprowadzane w regularnych odstępach czasu. Mogą one trwać od kilku sekund do kilku dni, w zależności od obserwowanego zdarzenia (opady, zarodkowanie lub wzrost kryształów).
Optymalizacja wzrostu kryształów za pomocą OptiCrys opiera się na wykresach fazowych stężenia temperatury-strącacza. W przypadku białek, których rozpuszczalność jest bezpośrednią funkcją temperatury, możliwe jest zastosowanie reżimu wysalania18. W tym miejscu zwiększenie siły jonowej roztworu, którą można uwidocznić za pomocą diagramów faz strącających białko, zmniejsza rozpuszczalność białka. Podobnie, białka o odwrotnej rozpuszczalności mogą korzystać z reżimu solenia18. Zarodkowanie zachodzi w strefie zarodkowania, w pobliżu strefy metastabilnej, a wzrost kryształów odbywa się następnie w strefie metastabilnej diagramu fazowego, aż stężenie białka osiągnie granicę rozpuszczalności. Jak pokazano na Rysunek 3A, przy stałym składzie chemicznym temperatura może zostać obniżona, aby utrzymać roztwór krystalizacyjny w strefie metastabilnej, aby zapobiec nowemu zarodkowaniu. Kryształy rosną do momentu osiągnięcia drugiej równowagi kryształ/roztwór, a następnie nie obserwuje się dalszego wzrostu wielkości kryształów. Temperaturę obniża się kilkakrotnie, aż kryształy osiągną pożądany rozmiar. W <silnej klasie="xfig">Rysunek 3B, przy stałej temperaturze, zwiększanie stężenia środka strącającego utrzymuje roztwór w strefie metastabilnej. Proces ten można następnie powtórzyć kilka razy, aby uzyskać duże kryształy. Zmiana temperatury i manipulowanie warunkami roztworu krystalizacyjnego, poprzez kontrolowanie poziomów przesycenia, to dwa potężne narzędzia do rozdzielania zarodkowania i wzrostu kryształów, które są precyzyjnie i automatycznie kontrolowane przez OptiCrys5,8,14.
Przykłady kryształów białek wyhodowanych przez kontrolowaną temperaturę lub kontrolowaną temperaturę i stężenie opadów krystalizacji, jak również uzyskane dane dotyczące dyfrakcji względnej są dostępne w literaturze i PDB. Wśród nich są ludzka γ-krystalina E, PA-IIL lektyna, drożdżowa nieorganiczna pirofosfataza, oksydaza moczanowa, ludzka anhydraza węglanowa II, kinaza YchB i dehydrogenaza mleczanowa5,14,17,18.
Chociaż OptiCrys został skomercjalizowany przez NatX-ray, istnieje wiele laboratoriów, które nie mają dostępu do tego instrumentu ani do oferowanego przez niego podejścia seryjnego. Alternatywą dla tej techniki jest użycie dostępnych na rynku plastikowych przycisków do mikrodializy o różnych pojemnościach. Za ich pomocą można ręcznie regulować i zmieniać temperaturę i skład chemiczny. Kontrola przycisków do mikrodializy nie może być wykonana in situ i musi być wykonana ręcznie za pomocą mikroskopu optycznego. Kontrolę temperatury można osiągnąć, przechowując próbkę w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą bez wibracji. Niezbędne jest utrzymanie stałej temperatury, aby zapewnić powtarzalność eksperymentów z krystalizacją. Znaczne wahania temperatury mogą również prowadzić do uszkodzenia lub zniszczenia kryształów5.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół opisujący przygotowanie próbki i użycie oprogramowania kontrolnego do wzrostu dużych, wysokiej jakości kryształów odpowiednich do krystalografii białek neutronowych. Ta procedura krok po kroku została zaprojektowana tak, aby wykorzystać diagram faz krystalizacji w celu wybrania pozycji wyjściowej i ścieżki kinetycznej w celu kontrolowania wielkości i jakości generowanych kryształów. Dodatkowo przedstawiono szczegółowy protokół hodowli kryształów za pomocą przycisków do mikrodializy, który wykorzystuje te same przesłanki do uzyskania dużych, wysokiej jakości kryształów.

<table><tbody><tr><td>200 i mikro; l Przycisk do dializy</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-330</td><td>Przycisk do dializy</td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Jena Bioscience</td><td>CPL-132</td><td>Płytka krystalizacyjna</td></tr><tr><td>2-przełącznik</td><td>FLUIGENT</td><td>2SW001</td><td>Przełącznik</td></tr><tr><td>30 &mu; l Przycisk do dializy</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-324</td><td>Przycisk do dializy</td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828-500EA</td><td>Probówki wirówkowe</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>lizozym białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Liofilizowane białko w proszku</td></tr><tr><td>Dyski membranowe do dializy 6-8 kDa</td><td>MWCO Spectrum</td><td>132478</td><td>Membrana do dializy</td></tr><tr><td>Rurka membranowa do dializy 6-8 kDa MWCO</td><td>Spectrum</td><td>132650T</td><td>Membrana do dializy</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>Minispin</td><td>Wirówka stołowa</td></tr><tr><td>Jednostka przepływowa</td><td>FLUIGENT</td><td>FLU-XL</td><td>Przepływomierz</td></tr><tr><td>Flowboard</td><td>FLUIGENT</td><td>FLB</td><td>Flowboard</td></tr><tr><td>Mikroprzepływowy system kontroli przepływu EZ</td><td>FLUIGENT</td><td>EZ-01000002</td><td>Regulator ciśnienia/podciśnienia</td></tr><tr><td>MilliporeSigma 0,22 &micro; m strzykawka Filtry</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>0,22 &mu; m Filtr wielkości porów</td></tr><tr><td>M-Switch</td><td>FLUIGENT</td><td>MSW002</td><td>Zawór obrotowy</td></tr><tr><td>Opticrys</td><td>NatX-ray</td><td>PRT008</td><td>Ławka do krystalizacji</td></tr><tr><td>Silikonowane prowadnice okrągłe</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td>Szkiełka</td></tr><tr><td>szklane Chlorek sodu &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>Tablica rozdzielcza chemiczna</td></tr><tr><td></td><td>FLUIGENT</td><td>SWB002</td><td>Centrala</td></tr><tr><td>Inkubator termoregulowany</td><td>Memmert</td><td>IPP30</td><td>Inkubator termoregulowany</td></tr></tbody></table>

optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Zastosowanie krystalografii makromolekularnej neutronów (NMX) szybko się rozwija, a większość struktur została określona w ciągu ostatniej dekady, dzięki nowym liniom badawczym NMX, które zostały zbudowane, oraz zwiększonej dostępności oprogramowania do udoskonalania struktur. Jednak źródła neutronów dostępne obecnie dla NMX są znacznie słabsze niż równoważne źródła krystalografii rentgenowskiej. Pomimo postępów w tej dziedzinie, do badań dyfrakcji neutronów zawsze będą potrzebne znacznie większe kryształy, szczególnie z tendencją do badania coraz większych makrocząsteczek i kompleksów. Dalsze ulepszenia metod i oprzyrządowania dostosowanego do hodowli większych kryształów są zatem konieczne, aby zastosowanie NMX mogło się rozwijać.
W tej pracy wprowadzamy racjonalne strategie i stół do wzrostu kryształów (OptiCrys) opracowany w naszym laboratorium, który łączy obserwację w czasie rzeczywistym za pomocą kamery wideo zamontowanej pod mikroskopem z precyzyjną automatyczną kontrolą roztworów krystalizacyjnych (np. stężenie strącacza, pH, dodatek, temperatura). Następnie pokazujemy, w jaki sposób ta kontrola temperatury i składu chemicznego ułatwia poszukiwanie optymalnych warunków krystalizacji przy użyciu modelowych białek rozpuszczalnych. Dokładna znajomość diagramu faz krystalizacji ma kluczowe znaczenie dla wyboru pozycji wyjściowej i ścieżki kinetycznej dla każdego eksperymentu krystalizacji. Pokazujemy, w jaki sposób racjonalne podejście może kontrolować wielkość i liczbę generowanych kryształów w oparciu o znajomość wielowymiarowych diagramów fazowych.

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Istnieją różne podejścia do krystalizacji w celu uzyskania dużych i wysokiej jakości kryształów zarówno do krystalografii rentgenowskiej, jak i neutronowej. Jednym z takich podejść jest zastosowanie metody dializy. W tej technice roztwór białka jest oddzielany od roztworu strącającego za pomocą półprzepuszczalnej membrany.Cząsteczki strącające dyfundują przez błonę do komory białkowej. Gdy zostanie osiągnięte prawidłowe przesycenie dla spontanicznego zarodkowania, pojawią się pierwsze jądra. Tutaj zademonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys, w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium, które wykorzystuje krystalizację dializy w kontrolowanej temperaturze, oraz nasze przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów do naturalnej krystalografii makromolekularnej w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.W przypadku przycisku do mikrodializy o określonej objętości mikrolitrów należy pobrać pipetę z 35 mikrolitrów roztworu lizozymu do komory dializowej. Ta dodatkowa objętość tworzy lekko kopulasty kształt na górze komory dializy i zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Weź aplikator i umieść gumkę lub pierścień na jego końcu.Umieść membranę na górze komory i zamocuj ją, przenosząc gumkę lub pierścień z aplikatora do rowka przycisku do dializy. Przenieś przycisk do studzienki zawierającej roztwór krystalizacyjny. Przykryj studnię szklanym szkiełkiem nakrywkowym lub kawałkiem taśmy.Utrzymuj próbkę w temperaturze 293 kelwinów w inkubatorze z regulatorem termicznym bez wibracji. Wiedząc, że krystalizacja dializ oferuje korzyści z punktu widzenia wzrostu kryształów, stanowisko do krystalizacji, tak zwane OptiCrys, zostało zaprojektowane i opracowane w naszym laboratorium, aby zaoferować w pełni zautomatyzowaną, połączoną kontrolę temperatury i składu chemicznego eksperymentu krystalizacji biomolekularnej. Optymalizacja wzrostu kryształów przez OptiCrys opiera się na wykresach fazowych stężenia strącacza temperatury.Zarodkowanie zachodzi w strefie zarodkowania w pobliżu strefy metastabilnej, a wzrost kryształów odbywa się następnie w strefie metastabilnej po schemacie fazowym, aż stężenie białka osiągnie krzywą rozpuszczalności reprezentującą równowagę termodynamiczną między roztworem a kryształami. Poprzez obniżenie temperatury w przypadku białka o bezpośredniej rozpuszczalności lub poprzez zwiększenie stężenia środka strącającego w przypadku wysolenia na zewnątrz, roztwór krystalizacyjny pozostaje w strefie metastabilnej i nie zachodzi zarodkowanie. Kryształy rosną do momentu osiągnięcia równowagi drugiego roztworu krystalicznego, a następnie nie obserwuje się dalszego wzrostu wielkości kryształów.Obniżanie temperatury lub zwiększanie stężenia strącacza powtarza się kilka razy, aż kryształy osiągną pożądany rozmiar. Dodać roztwór białkowy do komory dializacyjnej w układzie przepływowym o kontrolowanej temperaturze, przykryć górną komorę membraną dializacyjną i przymocować membranę za pomocą gumki lub pierścienia. Odwróć komorę nadstawkową i umieść ją na komorze dializy.Naciśnij go delikatnie i powoli, aby usunąć całe powietrze uwięzione między dwoma częściami, zamocuj zbiornik w jego pozycji, delikatnie przykręcając go do górnej części komory. Dodaj roztwór krystalizacyjny do komory zbiornika i przykryj go hermetyczną nakrętką. Przenieś ten zestaw i włóż go do podparcia piersi w stole do krystalizacji OptiCrys Crystal growth to oprogramowanie nadzorujące pracę w OptiCrys.Zawiera cztery różne interfejsy graficzne lub widoki. Widok główny zawiera przyciski umożliwiające przechodzenie do innych widoków. Celem interfejsu konfiguracji jest zdefiniowanie scenariusza eksperymentu, który może być uruchamiany automatycznie w widoku testowym.Ostatni widok to widok konserwacji. Aby wznowić eksperyment, musi być otwarty widok konserwacji, w którym znajdują się wszystkie parametry niezbędne do płynnego przebiegu eksperymentów krystalizacji. Zwiększ jasność z sekcji światła, światło może wzrosnąć od zera, brak światła do 100 maksymalnej jasności.Do kontroli i monitorowania temperatury służy sekcja regulatora temperatury. Kliknij przycisk, aby go włączyć. Ustaw temperaturę w sekcji wartości zadanej i naciśnij enter.Pod tym przyciskiem znajdują się dwa wykresy. Czerwony pokazuje temperaturę końcową, zamówienia, a żółty wykres pokazuje aktualną temperaturę. Mieszanie roztworów podstawowych, wtryskiwanie roztworu krystalizacyjnego do komory zbiornika jest kontrolowane przez sekcję Palm.W pierwszym etapie dodać stężenie roztworu podstawowego. Następnie znajdź końcowe stężenie każdego nowego roztworu granika i dodaj je do sekcji końcowego stężenia. Po naciśnięciu przycisku obliczania, dowiedz się, jaka objętość roztworu podstawowego zostanie obliczona i dodana w panelu objętości przed każdym panelem stężeń.Naciśnij przycisk przygotowania do uruchomienia i poczekaj, aż nowe rozwiązanie premier będzie gotowe. Aby wymienić roztwór krystalizacyjny, kliknij przycisk Wprowadzanie roztworu. Aby zatrzymać proces, naciśnij przycisk Zatrzymaj dystrybucję.Po prawej stronie sekcji mikroskopu znajduje się kilka paneli do rejestrowania ważnych informacji z każdego eksperymentu wzrostu kryształów. Dodaj odpowiednią nazwę białka, masę cząsteczkową i stan krystalizacji w tej sekcji. Zdefiniuj nazwę eksperymentów, po prostu wpisując ją w nazwie folderu.W sekcji nb images wybierz liczbę zdjęć, które mają zostać wykonane podczas eksperymentu. Dodaj liczbę obrazów i z panelu po prawej stronie wybierz skalę timera. Kliknij przycisk folderu, aby otworzyć folder.W tym folderze znajduje się plik tekstowy zawierający wszystkie informacje zdefiniowane wcześniej dla eksperymentu. W tym folderze zapisywane są również obrazy gotowe do dalszej obróbki. Powiększenie mikroskopu można również zmieniać automatycznie.Zmienia powiększenie za pomocą przycisków plus i minus w górnej części mikroskopu, aby odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć powiększenie. Istnieją trzy różne sposoby pomiaru wielkości kryształu. Do mierzenia długości lub szerokości należy użyć wektora szerokości.W zależności od kształtu kryształu można wybrać konkretne narzędzia z lewej części sekcji mikroskopu. Na przykład prostokątny lub wielokątny. Wartości pojawią się w sekcji miary.W pierwszym zestawie eksperymentów guziki do mikrodializy zanurzono w roztworach krystalizacyjnych o różnych stężeniach soli. W tym prostym eksperymencie z siatką krystalizacji jedyną zmienną jest stężenie strącacza. podczas gdy temperatura jest utrzymywana na stałym poziomie.Niewielkie zmiany stężenia soli pozwalają na badanie diagramu faz krystalizacji poprzez zwiększenie stężenia soli od 0,7 do 1,2 molowego przesycenia wzrasta, a roztwór w strefie zarodkowania oddala się od strefy metastabilnej. W związku z tym obserwuje się zmianę wielkości i liczby kryształów wraz ze wzrostem liczby kryształów i zmniejszaniem się ich rozmiaru. W pierwszym eksperymencie z użyciem OptiCrys w danych warunkach eksperymentalnych, po osiągnięciu równowagi w komorze dializycznej, roztwór krystalizacyjny znajduje się w strefie zarodkowania w pobliżu strefy metastabilnej schematu faz krystalizacji.W efekcie w pierwszym etapie eksperymentu powstaje zaledwie kilka jąder. W celu utrzymania wzrostu kryształów w strefie metastabilnej i kontrolowania procesu wzrostu kryształów, temperatura była zmieniana w różnych odstępach czasu. Za każdym razem, gdy równowaga roztworu krystalicznego była zakończona, temperatura ulegała zmianie.W związku z tym temperatura spadła do 291 kelwinów, 288 kelwinów i ostatecznie 275 kelwinów, aby utrzymać wzrost wybranego kryształu w strefie metastabilnej. Wynikiem tego eksperymentu jest pojedynczy duży kryształ o objętości wymaganej do naturalnej krystalografii makromolekularnej. Kolejne dwa eksperymenty demonstrują odwracalność eksperymentów dializy z kontrolowaną temperaturą w celu zarodkowania, wzrostu kryształów, rozpuszczania i ponownego wzrostu.W drugim eksperymencie z użyciem OptiCrys skład chemiczny roztworu krystalizacyjnego był utrzymywany na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu, a temperatura ulegała zmianom. Początkowa temperatura została ustalona na 291 kelwinów. Z powodu dużego przesycenia w komorze krystalizacyjnej pojawiła się duża liczba małych kryształów.Zgodnie z koncepcją bezpośredniej rozpuszczalności białek, poprzez stopniowe zwiększanie temperatury do 313 kelwinów wszystkie kryształy miały się rozpuścić. W końcu, poprzez obniżenie temperatury do 295 kelwinów, drugie zarodkowanie zainicjowało się w pobliżu strefy metastabilnej i pozwoliło kontrolować proces zarodkowania, co skutkowało powstawaniem mniejszej liczby jąder. Dalszy wzrost kryształów pozwolił na wygenerowanie jednolitej populacji większych kryształów.W tym eksperymencie zmiana składu chemicznego roztworu krystalizacyjnego w stałej temperaturze prowadzi do uzyskania jednolitej populacji większych kryształów. Warunek krystalizacji był podobny do poprzedniego eksperymentu. Rozpuszczanie kryształów osiągnięto poprzez stopniowe obniżanie stężenia NaCl z 0,9 mola do zera.Zmniejszenie stężenia soli utrzymuje roztwór w nienasyconej strefie diagramu fazowego, co prowadzi do rozpuszczenia kryształów. Następnie do komory zbiornika wstrzyknięto nowy roztwór krystalizacyjny o niższej sile jonowej niż poprzednio. Przy tym stężeniu strącania pojawia się mniejsza liczba kryształów, a kryształy osiągają większą objętość niż wcześniej.W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółowy protokół opisujący przygotowanie próbki i dostosowanie oprogramowania sterującego do hodowli dużych i wysokiej jakości kryształów do naturalnej krystalografii makromolekularnej przy użyciu w pełni zautomatyzowanego instrumentu opracowanego w naszym laboratorium. Ta procedura krok po kroku została zaprojektowana i korzysta ze znajomości diagramu faz krystalizacji w celu oddzielenia zarodkowania i wzrostu kryształów. Co więcej, przedstawiono również protokół hodowli kryształów z wzorcami mikrocytozy przy użyciu przycisków makrocytozy jako alternatywę, gdy OptiCrys nie jest dostępny.Oprócz strategii, o których wspomniałem dla OptiCrys, zmiana składu chemicznego roztworu krystalizacyjnego i temperatury oraz wykonywanie zdjęć powinno odbywać się ręcznie. Wymagane jest wykorzystanie wibracji regulowanych termicznie w inkubatorze w celu utrzymania stałej temperatury, co jest krytycznym krokiem w zademonstrowanej metodologii.

optimization-crystal-growth-for-neutron-macromolecular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Tutaj prezentujemy protokół kontrolowanej produkcji mikrokryształów białka. W procesie wykorzystuje się zautomatyzowane urządzenie pozwalające na kontrolowaną manipulację kilkoma parametrami krystalizacji. Krystalizacja białka odbywa się poprzez kontrolowane i zautomatyzowane dodawanie roztworów krystalizacyjnych przy jednoczesnym monitorowaniu i badaniu rozkładu promienia cząstek w kropli krystalizacji.

Hodowla kryształów białkowych o różnych wymiarach przy użyciu automatycznej krystalizacji połączonej z dynamicznym rozpraszaniem światła in situ

Przedstawiono nowatorski uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej wraz z odpowiednim protokołem postępowania. System umożliwia wzrost kryształów, wygrzewanie kryształów i gromadzenie danych dyfrakcyjnych in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji kryształami lub montażu.

Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Krystalografia białek neutronowych to technika strukturalna, która pozwala na lokalizację atomów wodoru, dostarczając tym samym ważnych szczegółów mechanistycznych funkcji białek. Przedstawiamy tutaj przebieg pracy montażu kryształu białka, zbieranie danych dyfrakcji neutronów, udoskonalanie struktury i analizę map gęstości długości rozpraszania neutronów.

Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

Opisano wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia krystalizację enzymu za pomocą metody przeciwdyfuzyjnej, wprowadzenie substratu do kryształów poprzez moczenie, oraz określenie struktury 3D kompleksu enzym:substrat poprzez seryjną analizę kryształów wewnątrz chipa w temperaturze pokojowej.

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Poznaj metodę automatycznej krystalizacji dializowej z wykorzystaniem urządzenia OptiCrys do uzyskiwania dużych, wysokiej jakości kryształów białek. Protokół opiera się na diagramach fazowych krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Przeglądaj więcej filmów