Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Istnieją różne podejścia do krystalizacji w celu uzyskania dużych i wysokiej jakości kryształów zarówno do krystalografii rentgenowskiej, jak i neutronowej. Jednym z takich podejść jest zastosowanie metody dializy. W tej technice roztwór białka jest oddzielany od roztworu strącającego za pomocą półprzepuszczalnej membrany.

Cząsteczki strącające dyfundują przez błonę do komory białkowej. Gdy zostanie osiągnięte prawidłowe przesycenie dla spontanicznego zarodkowania, pojawią się pierwsze jądra. Tutaj zademonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys, w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium, które wykorzystuje krystalizację dializy w kontrolowanej temperaturze, oraz nasze przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów do naturalnej krystalografii makromolekularnej w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

W przypadku przycisku do mikrodializy o określonej objętości mikrolitrów należy pobrać pipetę z 35 mikrolitrów roztworu lizozymu do komory dializowej. Ta dodatkowa objętość tworzy lekko kopulasty kształt na górze komory dializy i zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Weź aplikator i umieść gumkę lub pierścień na jego końcu.

Umieść membranę na górze komory i zamocuj ją, przenosząc gumkę lub pierścień z aplikatora do rowka przycisku do dializy. Przenieś przycisk do studzienki zawierającej roztwór krystalizacyjny. Przykryj studnię szklanym szkiełkiem nakrywkowym lub kawałkiem taśmy.

Utrzymuj próbkę w temperaturze 293 kelwinów w inkubatorze z regulatorem termicznym bez wibracji. Wiedząc, że krystalizacja dializ oferuje korzyści z punktu widzenia wzrostu kryształów, stanowisko do krystalizacji, tak zwane OptiCrys, zostało zaprojektowane i opracowane w naszym laboratorium, aby zaoferować w pełni zautomatyzowaną, połączoną kontrolę temperatury i składu chemicznego eksperymentu krystalizacji biomolekularnej. Optymalizacja wzrostu kryształów przez OptiCrys opiera się na wykresach fazowych stężenia strącacza temperatury.

Zarodkowanie zachodzi w strefie zarodkowania w pobliżu strefy metastabilnej, a wzrost kryształów odbywa się następnie w strefie metastabilnej po schemacie fazowym, aż stężenie białka osiągnie krzywą rozpuszczalności reprezentującą równowagę termodynamiczną między roztworem a kryształami. Poprzez obniżenie temperatury w przypadku białka o bezpośredniej rozpuszczalności lub poprzez zwiększenie stężenia środka strącającego w przypadku wysolenia na zewnątrz, roztwór krystalizacyjny pozostaje w strefie metastabilnej i nie zachodzi zarodkowanie. Kryształy rosną do momentu osiągnięcia równowagi drugiego roztworu krystalicznego, a następnie nie obserwuje się dalszego wzrostu wielkości kryształów.

Obniżanie temperatury lub zwiększanie stężenia strącacza powtarza się kilka razy, aż kryształy osiągną pożądany rozmiar. Dodać roztwór białkowy do komory dializacyjnej w układzie przepływowym o kontrolowanej temperaturze, przykryć górną komorę membraną dializacyjną i przymocować membranę za pomocą gumki lub pierścienia. Odwróć komorę nadstawkową i umieść ją na komorze dializy.

Naciśnij go delikatnie i powoli, aby usunąć całe powietrze uwięzione między dwoma częściami, zamocuj zbiornik w jego pozycji, delikatnie przykręcając go do górnej części komory. Dodaj roztwór krystalizacyjny do komory zbiornika i przykryj go hermetyczną nakrętką. Przenieś ten zestaw i włóż go do podparcia piersi w stole do krystalizacji OptiCrys Crystal growth to oprogramowanie nadzorujące pracę w OptiCrys.

Zawiera cztery różne interfejsy graficzne lub widoki. Widok główny zawiera przyciski umożliwiające przechodzenie do innych widoków. Celem interfejsu konfiguracji jest zdefiniowanie scenariusza eksperymentu, który może być uruchamiany automatycznie w widoku testowym.

Ostatni widok to widok konserwacji. Aby wznowić eksperyment, musi być otwarty widok konserwacji, w którym znajdują się wszystkie parametry niezbędne do płynnego przebiegu eksperymentów krystalizacji. Zwiększ jasność z sekcji światła, światło może wzrosnąć od zera, brak światła do 100 maksymalnej jasności.

Do kontroli i monitorowania temperatury służy sekcja regulatora temperatury. Kliknij przycisk, aby go włączyć. Ustaw temperaturę w sekcji wartości zadanej i naciśnij enter.

Pod tym przyciskiem znajdują się dwa wykresy. Czerwony pokazuje temperaturę końcową, zamówienia, a żółty wykres pokazuje aktualną temperaturę. Mieszanie roztworów podstawowych, wtryskiwanie roztworu krystalizacyjnego do komory zbiornika jest kontrolowane przez sekcję Palm.

W pierwszym etapie dodać stężenie roztworu podstawowego. Następnie znajdź końcowe stężenie każdego nowego roztworu granika i dodaj je do sekcji końcowego stężenia. Po naciśnięciu przycisku obliczania, dowiedz się, jaka objętość roztworu podstawowego zostanie obliczona i dodana w panelu objętości przed każdym panelem stężeń.

Naciśnij przycisk przygotowania do uruchomienia i poczekaj, aż nowe rozwiązanie premier będzie gotowe. Aby wymienić roztwór krystalizacyjny, kliknij przycisk Wprowadzanie roztworu. Aby zatrzymać proces, naciśnij przycisk Zatrzymaj dystrybucję.

Po prawej stronie sekcji mikroskopu znajduje się kilka paneli do rejestrowania ważnych informacji z każdego eksperymentu wzrostu kryształów. Dodaj odpowiednią nazwę białka, masę cząsteczkową i stan krystalizacji w tej sekcji. Zdefiniuj nazwę eksperymentów, po prostu wpisując ją w nazwie folderu.

W sekcji nb images wybierz liczbę zdjęć, które mają zostać wykonane podczas eksperymentu. Dodaj liczbę obrazów i z panelu po prawej stronie wybierz skalę timera. Kliknij przycisk folderu, aby otworzyć folder.

W tym folderze znajduje się plik tekstowy zawierający wszystkie informacje zdefiniowane wcześniej dla eksperymentu. W tym folderze zapisywane są również obrazy gotowe do dalszej obróbki. Powiększenie mikroskopu można również zmieniać automatycznie.

Zmienia powiększenie za pomocą przycisków plus i minus w górnej części mikroskopu, aby odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć powiększenie. Istnieją trzy różne sposoby pomiaru wielkości kryształu. Do mierzenia długości lub szerokości należy użyć wektora szerokości.

W zależności od kształtu kryształu można wybrać konkretne narzędzia z lewej części sekcji mikroskopu. Na przykład prostokątny lub wielokątny. Wartości pojawią się w sekcji miary.

W pierwszym zestawie eksperymentów guziki do mikrodializy zanurzono w roztworach krystalizacyjnych o różnych stężeniach soli. W tym prostym eksperymencie z siatką krystalizacji jedyną zmienną jest stężenie strącacza. podczas gdy temperatura jest utrzymywana na stałym poziomie.

Niewielkie zmiany stężenia soli pozwalają na badanie diagramu faz krystalizacji poprzez zwiększenie stężenia soli od 0,7 do 1,2 molowego przesycenia wzrasta, a roztwór w strefie zarodkowania oddala się od strefy metastabilnej. W związku z tym obserwuje się zmianę wielkości i liczby kryształów wraz ze wzrostem liczby kryształów i zmniejszaniem się ich rozmiaru. W pierwszym eksperymencie z użyciem OptiCrys w danych warunkach eksperymentalnych, po osiągnięciu równowagi w komorze dializycznej, roztwór krystalizacyjny znajduje się w strefie zarodkowania w pobliżu strefy metastabilnej schematu faz krystalizacji.

W efekcie w pierwszym etapie eksperymentu powstaje zaledwie kilka jąder. W celu utrzymania wzrostu kryształów w strefie metastabilnej i kontrolowania procesu wzrostu kryształów, temperatura była zmieniana w różnych odstępach czasu. Za każdym razem, gdy równowaga roztworu krystalicznego była zakończona, temperatura ulegała zmianie.

W związku z tym temperatura spadła do 291 kelwinów, 288 kelwinów i ostatecznie 275 kelwinów, aby utrzymać wzrost wybranego kryształu w strefie metastabilnej. Wynikiem tego eksperymentu jest pojedynczy duży kryształ o objętości wymaganej do naturalnej krystalografii makromolekularnej. Kolejne dwa eksperymenty demonstrują odwracalność eksperymentów dializy z kontrolowaną temperaturą w celu zarodkowania, wzrostu kryształów, rozpuszczania i ponownego wzrostu.

W drugim eksperymencie z użyciem OptiCrys skład chemiczny roztworu krystalizacyjnego był utrzymywany na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu, a temperatura ulegała zmianom. Początkowa temperatura została ustalona na 291 kelwinów. Z powodu dużego przesycenia w komorze krystalizacyjnej pojawiła się duża liczba małych kryształów.

Zgodnie z koncepcją bezpośredniej rozpuszczalności białek, poprzez stopniowe zwiększanie temperatury do 313 kelwinów wszystkie kryształy miały się rozpuścić. W końcu, poprzez obniżenie temperatury do 295 kelwinów, drugie zarodkowanie zainicjowało się w pobliżu strefy metastabilnej i pozwoliło kontrolować proces zarodkowania, co skutkowało powstawaniem mniejszej liczby jąder. Dalszy wzrost kryształów pozwolił na wygenerowanie jednolitej populacji większych kryształów.

W tym eksperymencie zmiana składu chemicznego roztworu krystalizacyjnego w stałej temperaturze prowadzi do uzyskania jednolitej populacji większych kryształów. Warunek krystalizacji był podobny do poprzedniego eksperymentu. Rozpuszczanie kryształów osiągnięto poprzez stopniowe obniżanie stężenia NaCl z 0,9 mola do zera.

Zmniejszenie stężenia soli utrzymuje roztwór w nienasyconej strefie diagramu fazowego, co prowadzi do rozpuszczenia kryształów. Następnie do komory zbiornika wstrzyknięto nowy roztwór krystalizacyjny o niższej sile jonowej niż poprzednio. Przy tym stężeniu strącania pojawia się mniejsza liczba kryształów, a kryształy osiągają większą objętość niż wcześniej.

W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółowy protokół opisujący przygotowanie próbki i dostosowanie oprogramowania sterującego do hodowli dużych i wysokiej jakości kryształów do naturalnej krystalografii makromolekularnej przy użyciu w pełni zautomatyzowanego instrumentu opracowanego w naszym laboratorium. Ta procedura krok po kroku została zaprojektowana i korzysta ze znajomości diagramu faz krystalizacji w celu oddzielenia zarodkowania i wzrostu kryształów. Co więcej, przedstawiono również protokół hodowli kryształów z wzorcami mikrocytozy przy użyciu przycisków makrocytozy jako alternatywę, gdy OptiCrys nie jest dostępny.

Oprócz strategii, o których wspomniałem dla OptiCrys, zmiana składu chemicznego roztworu krystalizacyjnego i temperatury oraz wykonywanie zdjęć powinno odbywać się ręcznie. Wymagane jest wykorzystanie wibracji regulowanych termicznie w inkubatorze w celu utrzymania stałej temperatury, co jest krytycznym krokiem w zademonstrowanej metodologii.