Name: Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj protokół izolacji komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrza myszy przy użyciu sortowania komórkowego FACS. Metoda zapewnia wysoką żywotność i czystość komórek do analizy RNA sekwencjonowania pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Instytutowi Cytometrii Przepływowej Mikroskopii Komórkowej Kliniki Mayo za pomoc w sortowaniu FACS.

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kliniki Mayo.
1. Przygotowanie roztworu 
<ol>
	<li>Przygotuj 2% (w/v) roztwór kolagenazy, rozpuszczając kolagenazę II 2 g w 100 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS). Podwielokrotność 200 μl dla każdego zastosowania.</li>
	<li>Przygotować pożywkę neutralizacyjną, mieszając 84 ml pożywki F-12, 15 ml surowicy końskiej i 1 ml penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Przygotować bufor do cytometrii przepływowej, rozpuszczając 500 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 400 μl 0,5 M EDTA w 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie poduszeczki tłuszczowej najądrza i dysocjacja tkanek
<ol>
	<li>Humanitarna eutanazja (izofluran/zwichnięcie szyjki macicy) jednego samca myszy. W tym protokole użyto czteromiesięcznej myszy FVB.</li>
	<li>Nałóż / spryskaj 70% etanol na brzuch i odsłoń dolną część jamy brzusznej za pomocą czystych nożyczek i kleszczy.</li>
	<li>Zlokalizuj poduszeczkę tłuszczową najądrza (proksymalną / przyczepioną do jąder). Przytrzymaj połączenie między jądrami a poduszeczką tłuszczową najądrza kleszczami i delikatnie pociągnij, aby uwolnić poduszeczkę tłuszczową najądrza.</li>
	<li>Usuń jądra przez cięcie nożyczkami i inkubuj poduszeczkę tłuszczową najądrza w 5 ml HBSS uzupełnionej 3% BSA w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Wirować przy 150 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Weź pływającą poduszeczkę tłuszczową najądrza z rurki stożkowej o pojemności 50 ml i drobno zmiel tkankę czystymi nożyczkami.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 2% roztworu kolagenazy do 3,8 ml HBSS w probówce hodowlanej o pojemności 13 ml. Dodać zmieloną tkankę i inkubować w inkubatorze obrotowym z prędkością 5 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zamiast inkubatora obrotowego, inkubator do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C może być alternatywnie używany z okazjonalnym mieszaniem.</li>
	<li>Przenieść całą zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 10 ml pożywki neutralizującej. Wymieszaj delikatnie, odwracając rurkę 2-3 razy.</li>
	<li>Przygotować kolejną stożkową probówkę o pojemności 50 ml wyposażoną w sitko o pojemności 70 μm. Przefiltruj strawioną tkankę do nowej probówki za pomocą sitka do komórek.</li>
	<li>Przenieść przepływ do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą 5 ml DPBS. Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i dodać 50 μl buforu cytometrii przepływowej. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując i utrzymuj komórki na lodzie. Ze względu na objętość osadów komórkowych i niewielką ilość resztkowego supernatantu, całkowita objętość komórek w buforze cytometrii przepływowej będzie większa niż 50 μl (około 100 μl).</li>
</ol>
3. Znakowanie przeciwciałami i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>Po dokładnym wymieszaniu komórek z delikatnym pipetowaniem przenieść 54 μl zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Dodać 6 μl odczynnika blokującego FcR i dobrze wymieszać, delikatnie pipetując. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zachowaj wszelkie pozostałe komórki po pobraniu 54 μl i trzymaj je w lodzie, aby użyć ich jako niezabarwionej kontroli w kroku 3.5 i kroku 3.6.</li>
	<li>Podczas inkubacji w kroku 3.1 należy przygotować koktajl przeciwciał, łącząc po 11 μl przeciwciał anty-Sca1-APC, anty-Ter119-FITC, anty-CD31-FITC i anty-CD45-FITC w probówce do mikrowirówki. Dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem i przechowywać na lodzie, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Po inkubacji z odczynnikiem blokującym FcR przez 10 minut, dodać 40 μl koktajlu przeciwciał i dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu cytometrii przepływowej uzupełnionego 1 μg/ml DAPI do wybarwionych komórek. Dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie i filtrowanie komórek za pomocą probówki o pojemności 5 ml z zatrzaskiem z sitkiem do komórek. Utrzymuj komórki na lodzie.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu cytometrii przepływowej do pozostałych komórek w kroku 3.1 i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie. Filtruj komórki za pomocą probówki o pojemności 5 ml z zatrzaskiem do sitka komórkowego. Trzymaj te komórki na lodzie i użyj jako niezabarwionej kontroli w następnym kroku.</li>
	<li>Zabierz wybarwione komórki i niebarwioną kontrolę do analizy FACS lub przyrządu do sortowania.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj i wyizoluj populację APC+/FITC-/DAPI- za pomocą strategii bramkowania pokazanych na Rysunek 1. Komórki te reprezentują żywotne komórki Sca1 + / Ter119 / CD31 / CD45-. Szczątki i agregaty komórkowe są wyładowywane za pomocą wykresów rozrzutu do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC). Następnie populacja DAPI- jest bramkowana, a następnie bramkowanie populacji APC+/FITC-. Niezabarwione kontrolki powinny być używane do pomocy w ustawianiu parametrów bramkowania.</li>
		<li>Zebrać komórki do 500 μl buforu cytometrii przepływowej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Idąc dalej, wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnych warunkach, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Z jednej myszy pobiera się około 50 000 – 100 000 komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby ocenić żywotność komórek. Ponieważ agregaty komórkowe mogą zakłócać dalsze analizy, ocenia się również obecność agregatów komórkowych w celu zapewnienia minimalnej obecności (<5% liczby komórek zdolnych do życia) tych agregatów.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) szybko zyskuje na popularności jako potężne narzędzie do jednoczesnego badania różnych populacji komórek na poziomie pojedynczej komórki. Ze względu na wysokie koszty związane z przygotowaniem próbki i sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości, konieczna jest optymalizacja danych wejściowych komórkowych (wysoka żywotność i czystość), aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu eksperymentu. Niektóre protokoły przygotowania komórek opierają się na usuwaniu martwych komór...

Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w metabolizmie energetycznym. Nadmiar energii jest magazynowany w postaci lipidów, a tkanka tłuszczowa jest zdolna do znacznego rozszerzania lub cofania w zależności od stanu odżywienia i zapotrzebowania energetycznego. Ekspansja tkanki tłuszczowej może wynikać ze wzrostu wielkości adipocytów (hipertrofii) i/lub ze wzrostu liczby adipocytów (hiperplazja); Ten ostatni proces jest ściśle regulowany przez proliferację i różnicowanie komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej1,2. Podczas otyłości tkanka tłuszczowa nadmiernie się rozrasta, a dysfunkcja tkanek – w tym niedotlenienie, stany zapalne i insulinooporność – często się rozwija3,4. Powikłania te są czynnikami ryzyka wielu chorób przewlekłych, w tym nadciśnienia, cukrzycy, chorób układu krążenia, udaru mózgu i raka5. W związku z tym ograniczanie niekontrolowanej ekspansji tkanki tłuszczowej i łagodzenie patologii tkanki tłuszczowej są głównymi priorytetami badań biomedycznych. Podczas ekspansji tkanki tłuszczowej rezydentne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) namnażają się i różnicują sekwencyjnie w preadipocyty (zaangażowane komórki progenitorowe), a następnie w dojrzałe adipocyty6. Ostatnie badania sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) pokazują, że te populacje komórek progenitorowych tłuszczu (APC) (ASC i preadipocyty) wykazują znaczną heterogeniczność molekularną i funkcjonalną7,8,9,10,11,12. Na przykład ASC wykazują zmniejszoną zdolność różnicowania adipogennego, a jednocześnie wykazują wyższe zdolności do proliferacji i ekspansji w porównaniu do preadipocytów7. Dalsze różnice molekularne są zgłaszane w populacjach ASC i preadipocytów, chociaż funkcjonalne znaczenie tych różnic pozostaje niejasne7. Łącznie dane te podkreślają złożoność puli komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej i podkreślają potrzebę opracowania i standaryzacji narzędzi w celu lepszego zrozumienia i manipulowania tymi krytycznymi populacjami komórek.
Ten protokół szczegółowo opisuje izolację populacji komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej Sca1+ o wysokiej żywotności z poduszeczek tłuszczowych najądrza myszy, które są odpowiednie do czułych analiz dalszych, w tym badań pojedynczych komórek (sekwencjonowanie scRNA) i hodowli komórek. Izolację i dysocjację poduszeczek tłuszczowych najądrza przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem7,13 z niewielkimi modyfikacjami, które poprawiają żywotność izolowanych APC. Krótko mówiąc, zdysocjowane komórki z poduszeczek tłuszczowych najądrza są barwione przeciwciałami przeciwko Sca1, markerowi zarówno ASC, jak i preadipocytów6,7 i innymi markerami linii (Lin): Ter119 (komórki erytroidalne), CD31 (komórki śródbłonka) i CD45 (leukocyty). Żywotne komórki Sca1 + / Ter119 / CD31 / CD45 / DAPI- są następnie sortowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Co ważne, protokół ten został potwierdzony przez udaną izolację i analizę żywotnych komórek progenitorowych tłuszczu Sca1+/Lin- zgłoszonych w niedawnym badaniu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, które zidentyfikowało funkcjonalnie heterogeniczne subpopulacje w obrębie ASC i preadipocytów7.

<table><tbody><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>13 ml probówka</td> hodowlana <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka stożkowa</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>5 ml z sitkiem do komórek zatrzask</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m sitko komórkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD31-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD45-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Sca1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ter119-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 średnia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodku propidyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Numer katalogowy: 130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Otyłość i zaburzenia metaboliczne, takie jak cukrzyca, choroby serca i rak, są związane z dramatyczną przebudową tkanki tłuszczowej. Tkankowe komórki progenitorowe tkanki tłuszczowej (APC) odgrywają kluczową rolę w homeostazie tkanki tłuszczowej i mogą przyczyniać się do patologii tkanek. Rosnące zastosowanie technologii analizy pojedynczych komórek – w tym sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i proteomiki pojedynczych komórek – przekształca pole komórek macierzystych/progenitorowych, umożliwiając bezprecedensowe rozwiązywanie zmian ekspresji poszczególnych komórek w kontekście zmian w całej populacji lub tkance. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły preparowania tkanki tłuszczowej najądrza myszy, izolowania pojedynczych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej i przeprowadzania sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu wzbogacenia żywotnych APC Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119-. Protokoły te umożliwią badaczom przygotowanie wysokiej jakości APC odpowiednich do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek.

W eksperymencie wykorzystano czteromiesięczne samce myszy FVB. Po wykluczeniu zanieczyszczeń i dubletów za pomocą wykresów FSC/SSC, wytypowano żywe komórki (populacja DAPI-), a następnie wyselekcjonowano populację APC+/FITC- (Rysunek 1). Bramki dla DAPI, APC i FITC wyznaczono na podstawie kontroli niebarwionej. Strategie bramkowania przedstawiono na Rysunku 1.
Po 1 h sortowania jakość izolacji oceniono...

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Protokół ten umożliwia wyizolowanie wysokiej jakości komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z tkanki tłuszczowej najądrza myszy w celu przeprowadzenia czułej dalszej analizy. Technika ta daje wysoce żywotne komórki progenitorowe tłuszczu i została zwalidowana w niedawnym badaniu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Po eutanazji samca myszy zlokalizuj poduszeczkę tłuszczową najądrza i delikatnie pociągnij ją kleszczami, aby to przemyśleć.Użyj nożyczek, aby usunąć jądra i inkubować poduszeczkę tłuszczową najądrza w pięciu mililitrach HBSS uzupełnionych 3% BSA w 50-mililitrowej stożkowej probówce przez 15 minut. Po inkubacji odwirować probówkę o sile 150 x g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń pływającą poduszeczkę tłuszczową najądrza ze stożkowej rurki i drobno zmiel ją czystymi nożyczkami.Dodaj 200 mililitrów 2% roztworu kolagenazy do 3,8 mililitra HBSS w 13-mililitrowej probówce hodowlanej. Następnie dodaj zmieloną tkankę i inkubuj ją w inkubatorze obrotowym z prędkością pięciu obrotów na minutę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś całą zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i dodaj 10 mililitrów pożywki neutralizującej.Wymieszaj delikatnie, odwracając probówkę dwa do trzech razy. Przygotuj kolejną stożkową probówkę o pojemności 50 mililitrów wyposażoną w sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów i przefiltruj strawioną tkankę do nowej probówki. Przenieś przepływ do 15-mililitrowej probówki i odwiruj w ilości 350 x g na 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z pięcioma mililitrami DPBS. Następnie odwiruj probówkę przez kolejne 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i dodać 50 mikrolitrów buforu cytometrii przepływowej.Wymieszaj komórki, delikatnie pipetując, i trzymaj je na lodzie. Całkowita objętość komórek w buforze cytometrii przepływowej wyniesie około 100 mikrolitrów. Po wymieszaniu komórek przenieś 54 mikrolitry zawiesiny komórek do 1,7 mililitrowej probówki wirówkowej.Dodaj sześć mikrolitrów odczynnika blokującego FCR i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Trzymaj resztki komórek na lodzie, aby użyć ich jako niezabarwionej kontroli.Podczas inkubacji należy przygotować koktajl przeciwciał, łącząc po 11 mikrolitrów przeciwciał anty-Sca1-APC, anty-Ter119-FITC, anty-CD31-FITC i anty-CD45-FITC w probówce mikrowirówkowej. Delikatnie odpipetować mieszaninę i trzymać ją na lodzie, chronić przed światłem. Po inkubacji z odczynnikiem blokującym FCR dodać 40 mikrolitrów koktajlu przeciwciał i dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem.Inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne 10 minut. Dodaj 500 mikrolitrów buforu cytometrii przepływowej uzupełnionego jednym mikrogramem na mililitr DAPI do komórek barwiących. Dobrze wymieszaj i przefiltruj komórki za pomocą pięciomililitrowej probówki z zatrzaskiem z sitkiem do komórek.Następnie utrzymuj komórki na lodzie. Dodać 500 mikrolitrów buforu cytometrii przepływowej do niebarwionych komórek i wymieszać, delikatnie pipetując. Użyj pięciomililitrowej probówki z zatrzaskiem z sitkiem do komórek, aby przefiltrować komórki i utrzymać je na lodzie.Przenieś wybarwione komórki i niebarwioną kontrolę do przyrządu do analizy lub sortowania FACS. Zidentyfikuj i wyizoluj populację APC-dodatnią, FITC-ujemną, DAPI-ujemną przy użyciu strategii bramkowania opisanych w manuskrypcie tekstu. Użyj niezabarwionych kontrolek, aby pomóc w ustawianiu parametrów bramkowania.Po wykluczeniu szczątków i dubletów przy użyciu wykresów FSC-SSC, żywotne komórki bramkowano, a następnie wybrano populację APC-dodatnią, FITC-ujemną. Bramki DAPI, APC i FITC zostały narysowane na podstawie niezabarwionej kontroli. Poniższe wyniki pokazują izolację komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej od czteromiesięcznych samców myszy FVB.Po godzinie sortowania jakość izolacji oceniono ilościowo za pomocą analizy cytometrii przepływowej, która wykazała, że komórki zachowały wysoką żywotność i czystość. Po zastosowaniu tego protokołu można przeprowadzić czułą analizę dalszą, taką jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym i cytometria przepływowa. Umożliwi to dalszą charakterystykę komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej.Komórki progenitorowe tkanki tłuszczowej to niejednorodne populacje, które wymagają dalszych badań jednokomórkowych. Metoda ta umożliwia wyizolowanie komórek nadających się do badań jednokomórkowych.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje izolację preadipocytów myszy z podskórnego tłuszczu, ich różnicowanie na dojrzałe adipocyty oraz indukcję insulinooporności. Działanie insuliny ocenia się na podstawie fosforylacji/aktywacji członków szlaku sygnałowego insuliny przez western blot. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie insulinooporności/wrażliwości w adipocytach pierwotnych.

Zróżnicowane adipocyty myszy w hodowli pierwotnej: model insulinooporności

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Poznaj protokół izolacji komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrza myszy przy użyciu sortowania komórkowego FACS. Metoda zapewnia wysoką żywotność i czystość komórek do analizy RNA sekwencjonowania pojedynczych komórek.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Przeglądaj więcej filmów