Name: Testy suchej zgnilizny korzeni ciecierzycy: szczegółowa metodologia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodykę testów suchej zgnilizny korzeni ciecierzycy wykorzystującą technikę bibulową oraz chorej doniczki do badania interakcji z Rhizoctonia bataticola. Te powtarzalne metody umożliwiają skuteczną selekcję genotypów odpornych na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekty w laboratorium M.S.K są wspierane przez główny fundusz Narodowego Instytutu Badań nad Genomem Roślinnym. VI uznaje DBT-JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Dziękujemy studentom-stażystom, pani Rishice, panu Jayachendrayanowi i pannie Durgadevi za pomoc techniczną podczas kręcenia filmu oraz panu Sandeepowi Dixitowi, pannie Anjali i dr Avanish Rai za krytyczną ocenę surowych danych i plików rękopisów. Dziękujemy Panu Rahimowi H. Tarafdarowi i Panu Sunderowi Solanki za ich pomoc w laboratorium. Dziękujemy Konsorcjum DBT-eLibrary (DeLCON) i Bibliotece NIPGR za zapewnienie dostępu do e-zasobów i NIPGR Plant Growth Facility w celu wsparcia/przestrzeni wzrostu roślin.

1. Izolacja R. bataticola i przechowywanie
<ol>
	<li>Szczegółowe informacje na temat genotypu ciecierzycy i objawów DRR
	<ol>
		<li>Używaj roślin ciecierzycy (genotyp, JG 62), które generalnie wykazują typowe objawy DRR, takie jak suchy, kruchy korzeń pierwotny bez korzeni bocznych i mikrosklerocja pod korą i wewnątrz rdzenia1,3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie i mycie
	<ol>
		<li>Wyrwij rośliny wykazujące objawy, takie jak suche, słomiane liście i kruchy korzeń pierwotny z mikrosklerocją, pod warstwą naskórka. Podczas wyrywania z korzeniami większa część korzeni pozostanie w glebie, ponieważ zainfekowane korzenie są kruche. Usuń gruboziarniste resztki gleby przyczepione do korzenia. Korzenie należy pokroić osobno i zebrać w papierowych kopertach (27,5 cm x 12 cm) z odpowiednią etykietą i umieścić w pojemniku na próbki.</li>
		<li>Po przetransportowaniu próbek do laboratorium umieść korzenie w zlewce o pojemności 200 ml i przykryj siatką (siatka nylonowa o średnicy porów 3 mm), a następnie dokładnie umyj korzenie bieżącą wodą z kranu, aby usunąć przylegające cząstki gleby.</li>
		<li>Użyj wody z odwróconej osmozy (RO), aby spłukać raz na końcu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizacja powierzchni
	<ol>
		<li>Połam korzenie na cztery części o długości 2 cm każdy za pomocą ostrza skalpela i umieść je w czystej zlewce o pojemności 200 ml.</li>
		<li>Zmontuj autoklawowaną wodę RO, 2% NaOCl, słoik do wyrzucania i autoklawowaną bibułę (5 cm2) w komorze laminarnej.</li>
		<li>Umyj korzenie trzykrotnie 50 ml autoklawizowanej wody RO, a następnie 50 ml 2% NaOCl przez 10 minut. Umyj korzenie 50 ml wody RO trzy razy, aby usunąć NaOCl.</li>
		<li>Osusz korzenie, umieszczając je na autoklawowanej bibule i pozostaw do wysuszenia korzeni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka i inkubacja
	<ol>
		<li>Usuń krawędzie korzeni za pomocą wysterylizowanego ostrza skalpela. Rozłup korzenie za pomocą ostrza i użyj wysterylizowanych kleszczy, aby umieścić je na podłożu z agatorem ziemniaczanym z dekstrozą (PDA) na podłożu Petriego zawierającym siarczan streptomycyny (50 mg L-1) i ampicylinę (50 mg L-1).</li>
		<li>Zamknąć płytkę, uszczelnić parafilmem i inkubować w inkubatorze w temperaturze 28 °C przez dwa dni w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda końcówki strzępki
	<ol>
		<li>Po dwóch dniach inkubacji przenieś płytki do komory laminarnej. Odetnij końcówkę łącznika growth8 pod mikroskopem stereoskopowym (edukacyjny mikroskop stereoskopowy Leica EZ4) i przenieś go na świeżą płytkę PDA z siarczanem streptomycyny i ampicyliną.</li>
		<li>Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 28 °C przez dziesięć dni w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie i konserwacja inokulum grzyba R. bataticola
	<ol>
		<li>Wykonaj skosy PDA w probówkach i przenieś zatyczkę agarową grzybów z dziesięciodniowej płytki hodowlanej za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli inokulacyjnej. Uszczelnij nakrętkę probówki parafilmem.</li>
		<li>Inkubować skosy w temperaturze 28 °C przez dziesięć dni w ciemności.</li>
		<li>Ponownie uszczelnić nakrętkę parafilmem i przechowywać ją w temperaturze 4 °C w lodówce do wykorzystania w przyszłości.</li>
		<li>Subkultura co sześć miesięcy w celu utrzymania grzyba.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie zjadliwości
	<ol>
		<li>Zainfekuj rośliny czystym inokulum grzybów przygotowanym zgodnie z opisem w technice chorej doniczki3. Wyizoluj ten sam grzyb od zainfekowanych roślin (postulaty Kocha)9 i użyj do dalszych eksperymentów. 
		UWAGA: W tym badaniu wykorzystano izolowany w terenie szczep grzyba (GenBank: MH509971,1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Technika bibuły
UWAGA: Technika bibuły polega na przygotowaniu płynnego inokulum grzybów, przygotowaniu sadzonek i ocenie choroby.
<ol>
	<li>Przygotowanie płynnego inokulum R. bataticola 
	UWAGA: Płynny inokulum grzybów R. bataticola zawiera zarówno grzybnię, jak i mikrosklerocję. Obie te struktury działają jak inokulum pierwotne.
	<ol>
		<li>Przygotuj 500 ml pożywki PDB w kolbie o pojemności 1,000 ml i sterylizuj w autoklawie o wadze 121 funtów przez 15 minut.</li>
		<li>Po schłodzeniu pożywki zaszczepić bulion pętlą z grzybowego korka agarowego z pochyłej kultury grzybów i inkubować w temperaturze 28 °C przez pięć dni w wytrząsarce z prędkością 180 obr./min w ciemności.</li>
		<li>Na stole zamontuj autoklawowany szklany lub plastikowy lejek (10 cm), jednolitrową kolbę stożkową i dwie warstwy siatki (rozmiar 10 cm2) (siatka nylonowa o średnicy porów 3 mm). Odfiltruj grzybnię grzybów i mikrosklerocję za pomocą siatki. Osusz grzyba w autoklawowanej bibule.</li>
		<li>Odważyć 100 g grzybni na 50% inokulum i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie rośliny ciecierzycy
	<ol>
		<li>Wybierz 50 zdrowych nasion (w tym badaniu użyto genotypu JG 62 wrażliwego na DRR), umieść je w zlewce o pojemności 100 ml i przykryj siatką.</li>
		<li>Najpierw umyj nasiona wodą z kranu, aby usunąć resztki gleby.</li>
		<li>Weź zlewkę z nasionami do komory laminarnej i umyj ją wysterylizowanymi 50 ml wody RO trzykrotnie przez 1 minutę na mycie.</li>
		<li>Sterylizuj nasiona 50 ml 2% wodnego roztworu NaOCl przez 2 minuty przy ciągłym wstrząsaniu i umyj nasiona 50 ml wysterylizowanej wody pięć razy przez 1 minutę każde.</li>
		<li>Napełnij worek polietylenowy (47,5 cm x 25 cm) soilrytem (mieszaniną ekspandowanego perlitu klasy ogrodniczej, irlandzkiego mchu torfowego i złuszczonego wermikulitu w równych proporcjach, tj. 1/3:1/3:1/3), wysterylizowanych powierzchniowo 50 nasion na głębokość dwóch cm i trzymaj w komorze wzrostowej/pomieszczeniu o temperaturze 28 °C ± 2 °C, 16 godzin fotoperiodu o natężeniu światła 150 μmol m−2 s−1i wilgotności względnej 70%. Podlewaj je wodą RO i wyrywaj rośliny z korzeniami osiem dni po siewie.</li>
		<li>Umyj korzenie w wodzie z kranu, aby usunąć cząsteczki soilrytu. Opłucz korzenie wysterylizowaną wodą RO i trzymaj je w wodzie RO w zlewce o pojemności 1000 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bibuły w tackach
	<ol>
		<li>Weź bibułę i pokrój je na kawałki (30 cm × 23 cm) w wystarczającej ilości, aby sprostać replikacjom.</li>
		<li>Zapakuj arkusze w autoklawowalną torbę polietylenową i sterylizuj je w autoklawie o wadze 121 funtów przez 15 minut i przechowuj w piekarniku z gorącym powietrzem do wysuszenia.</li>
		<li>Złóż każdy arkusz bibuły na pół.</li>
		<li>Umieść papier na czystej, wytartej spirytusem plastikowej tacy, jak pokazano na rysunku Rysunek 2i-iv.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja roślin przez zanurzanie
	<ol>
		<li>Rozpuścić 100 g inokulum grzybów w 200 ml autoklawowanej wody RO w zlewce o pojemności 200 ml, aby uzyskać 50% inokulum.</li>
		<li>Zanurz korzenie roślin w przygotowanym inokulum na 1 minutę z przerywanymi ruchami w górę iw dół, aby zapewnić równomierne przyczepienie inokulum grzybów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieszczanie roślin w bibule
	<ol>
		<li>Zwilż dolną stronę bibuły umieszczonej na tacy sterylną wodą RO. Umieść rośliny na papierze w taki sposób, aby tylko korzenie były pokryte papierem, a pędy pozostały pominięte.</li>
		<li>Zamknij go, składając górną stronę bibuły i zwilż cały papier, aby zapewnić wystarczającą ilość wody do podtrzymania wzrostu roślin.</li>
		<li>Podlewaj tacę raz dziennie i utrzymuj ją w temperaturze 28 °C. Codziennie obserwuj objawy, takie jak martwica, zgnilizna korzeni i żółknięcie liści.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Technika chorego garnka
UWAGA: Technika chorego garnka polega na przygotowaniu zjadliwego inokulum i chorego doniczka, utrzymaniu poziomu wilgotności i ocenie objawów choroby.
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża
	<ol>
		<li>Weź jeden kg wszelkich dostępnych w handlu nasion ciecierzycy. Usuń zainfekowane nasiona (nasiona z naroślami grzybów, plamami infekcji i uszkodzeniami owadów). Umieść je w plastikowej zlewce o pojemności 5 l i dokładnie umyj wodą z kranu 3–4 razy, aby usunąć główne zanieczyszczenia.</li>
		<li>Umyj nasiona trzykrotnie 2 l wody RO i namocz 1 kg nasion w zlewce o pojemności 5 l z trzykrotnie większą ilością wody przez pięć godzin.</li>
		<li>Gdy nasiona wchłoną wodę, umyj je trzykrotnie wodą RO, aby usunąć wysięk z nasion.</li>
		<li>Całkowicie usuń wodę i zapakuj nasiona do butelek z dżemem (300 ml, 12 cm wysokości, 6 cm średnicy i 155 g wagi) do około 1/4 pojemności (100 g na butelkę dżemu) i zamknij butelki nakrętkami. Zapakuj dziesięć butelek dżemu w plastikową torbę do sterylizacji w autoklawie (48 cm x 30 cm), autoklaw dwa razy po 121 funtów przez 15 minut bez przerwy.</li>
		<li>Wysuszyć nasiona w temperaturze 40 °C w piekarniku przez noc, aby usunąć kropelki wody z butelki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie chorej kultury
	<ol>
		<li>Włącz komorę przepływu laminarnego poziomu BSL-2. Dokładnie przetrzyj podłogę 70% etanolem i włącz UV na 15 minut. Następnie trzymaj nasiona w komorze z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Weźmy 10-dniową, świeżo wyizolowaną kulturę R. bataticola (część 1). Następnie za pomocą sterylnej końcówki do pipet lub świdra korkowego należy pobrać trzy zatyczki agarowe z grzybami (o średnicy 4 mm) i aseptycznie włożyć je do butelek z dżemem. Przykryj butelki nakrętkami i zamknij parafilmem.</li>
		<li>Wstrząśnij butelkami, aby równomiernie wymieszać krążek grzybów z nasionami ciecierzycy.</li>
		<li>Inkubować butelki w temperaturze 30 °C przez 15 dni w ciemności.</li>
		<li>Weź butelki z dżemem z czarnym wzrostem grzybów (<silna klasa="xfig">Rysunek 4iii) i przenieś chorą kulturę (nasiona z mikrosklerocją) z butelek po dżemie na szklaną płytkę Petriego za pomocą sterylnych kleszczy. Suszyć je w temperaturze pokojowej przez dwa dni na szklanej szalce Petriego.</li>
		<li>Sproszkować masę grzybową za pomocą moździerza i tłuczka, a następnie przechowywać proszek w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Autoklaw Soilrite dwa razy przy 121 funtach przez 15 min.</li>
		<li>Wysuszyć autoklawowaną mieszankę Soilrite pod parasolem przeciwsłonecznym.</li>
		<li>Wymieszaj proszek grzybowy z soilrytem w stężeniu 50% w/w, napełnij doniczki mieszanką i trzymaj je w temperaturze pokojowej przez jeden dzień.</li>
		<li>Wysiewaj wysterylizowane powierzchniowo nasiona ciecierzycy podatne na DRR w doniczce (okrągłe doniczki 10 cm) (tabela materiałów) i utrzymuj wilgotność na poziomie 80% pojemności pola (FC).</li>
		<li>Obserwuj objawy, takie jak nekroza i zgnilizna korzeni, wyrywając rośliny po wykiełkowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena wydajności chorego doniczka 
	UWAGA: Rośliny wykazują objawy żółtych liści, gdy korzenie są całkowicie zgniłe.
	<ol>
		<li>Opracuj ocenę choroby na podstawie liczby zmian (martwiczych plam) (rysunek uzupełniający 2C) i nasilenia zgnilizny korzeni. Chore doniczki wykazujące 90% śmierci roślin mogą być używane dalej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania przesiewowe genotypu
	<ol>
		<li>Przygotuj chorą kulturę w dużych ilościach i wymieszaj ją ze sterylizowanym soilrytem lub ziemią polową (5% w/w) w doniczkach o wysokości 30 cm. Podlewaj doniczki, aby zwilżyć powierzchnię i pozostaw je w spokoju przez siedem dni.</li>
		<li>Wysiewaj jedno wysterylizowane powierzchniowo nasiona na okrągłą doniczkę o średnicy 10 cm i trzy nasiona na okrągłe doniczki o średnicy 30 cm i odpowiednio je podlej.</li>
		<li>Obserwuj objawy żółtej zgnilizny liści i korzeni</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Połączona susza i zakażenie R. bataticola
	<ol>
		<li>Nałóż stres związany z suszą, postępując zgodnie z protokołami wymienionymi w Sinha i in. (2019).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
<li>Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135">http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135</a> (2016).</li>
<li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chickpea+diseases%3A+resistance+screening+techniques%2C+information+bulletins+No.+10.+Patancheru%5BTitle%5D)+AND+%22Information+Bulletin+No.+10.+Patancheru%2C+A.P.%2C+India%3A+International+CroDS+Research+Institute+for+the+Semi-Arid+Tropics%22%5BJournal%5D)">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li>
<li>Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sources+of+multiple+disease+resistance+in+mini-core+collection+of+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea.</a> Plant Disease. , (2006).</li>
<li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologies+of+Crop+Improvement%2C+Volume+3%3A+Genomic+Approaches%22%5BJournal%5D)">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li>
<li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li>
<li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+G+%22Plant+Pathology%3A+Fifth+Edition%22">Plant Pathology: Fifth Edition</a>. , 9780080473(2004).</li>
<li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li>
<li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagamma%2C+G+%22Screening+of+chickpea+genotypes+against+dry+root+rot+caused+by+Macrophomina+phaseolina+%28tassi%29+goid%22">Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid</a>. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li>
<li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li>
<li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423(2020).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia

Technika bibuły zapewnia proste podejście do badania genotypów ciecierzycy w warunkach laboratoryjnych. Inokulacja zanurzeniowa umożliwia badanie interakcji w czasie z łatwą kontrolą obciążenia inokulum (rysunek uzupełniający 1) i ułatwia badania przesiewowe in vitro. Co więcej, można użyć nawet młodych sadzonek. Pięciodniowa kultura grzybów (ryc. 1B) może dać wystarczającą ilość inokulum, aby zainfekować rośliny. Płynne inokulum zawiera zarówno grzybnię, jak i mikrosklerocj...

Sucha zgnilizna korzeni (DRR) jest jedną z ekonomicznie istotnych chorób ciecierzycy1,2. Jest to choroba specyficzna dla korzeni wywoływana przez Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Macrophomina phaseolina). Zainfekowane rośliny nie mają korzeni bocznych i mają kruche korzenie palowe oraz żółte liście1,3. Doniesiono, że DRR w warunkach stresu związanego z suszą stanowi nowe zagrożenie dla uprawy ciecierzycy1,2,3. Co więcej, częstość występowania DRR nasila się pod wpływem stresu suszy w warunkach polowych1,2,3. DRR jest bardziej rozpowszechniony na obszarach deszczowych niż na nawadnianych polach4. Wykorzystanie odpornych odmian jest sposobem na pokonanie choroby i obejście stosowania fungicydów1,13. Ponieważ plazma zarodkowa ciecierzycy dostępna na całym świecie zawiera zmienność genetyczną dla cechy 5, badania przesiewowe i identyfikacja odpornych/podatnych genotypów mają kluczowe znaczenie dla hodowli molekularnej w celu poprawy upraw.
Solidne, łatwe i opłacalne testy chorób są niezbędne do zbadania wzorców infekcji R. bataticola u ciecierzycy. Podstawowym testem choroby stosowanym do obserwacji odpowiedzi genotypów ciecierzycy na zakażenie R. bataticola jest technika bibuły1,4. Jest to prosta technika i może być wykonana przy użyciu płynnego inokulum grzybów, sadzonek z korzeniami i sterylnej bibuły. Jednak technika ta nie została wykorzystana w maksymalnym stopniu, ponieważ w literaturze nie jest dostępny żaden protokół krok po kroku.
Tymczasem, technika chorego garnka polega na przygotowaniu potencjalnej choroby i nałożeniu stresu związanego z suszą. Biorąc pod uwagę, że stres związany z suszą nasila występowanie choroby DRR3, konieczne jest zbadanie interakcji roślina-patogen w warunkach stresu związanego z suszą6,7. Technika chorej doniczki stanowi platformę dla takich jednoczesnych badań, promując lepsze możliwości badań przesiewowych plazmy zarodkowej i zrozumienia mechanistycznych podstaw interakcji. Zmiany patomorfologiczne, takie jak zwiększenie długości korzenia i zmniejszenie liczby korzeni bocznych - nieodłącznie związane z chorobą DRR - można rozwiązać za pomocą techniki chorego garnka1,3,7.
Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół dla technik bibuły i garnków do bibuły, który może być wykorzystany do badania interakcji między ciecierzycą a R. bataticola i plazmą zarodkową ciecierzycy. Szczegółowe informacje na temat materiałów wykorzystanych w badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

<table><tbody><tr><td>Grzyb- Rhizoctonia bataticola</td><td>Pathogen inoculum</td><td>Indian Type Culture Collection No. 8365</td><td>GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&amp; id=1251&Itemid=1370)</td></tr><tr><td>Mieszanka soilrytu</td><td>Pożywka glebowa w laboratorium</td><td>Keltech Energies Limited, Bangalore, Indie</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Bibuła wspomagająca wzrost roślin</td><td>Doniczka Himedia</td><td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td></tr><tr><td></td><td>Uprawa roślin</td> w <td>doniczkach o rozmiarach 10 i 30 cm</td><td>Rutynowo używane doniczki szkółkarskie, na przykład https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td></tr><tr><td>Agar / bulion z dekstrozy ziemniaczanej</td><td>Hodowla i utrzymanie grzyba Kot</td><td># 213400, DifcoTM, MD, USA</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Hodowla grzyba</td><td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, inkubator i wytrząsarka</td><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td><td>Uprawa roślin w kontrolowanych warunkach</td><td>Model nr A1000, Conviron, Kanada</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>Laminarny przepływ powietrza</td><td>Przeprowadzanie ćwiczeń aseptycznych</td><td>Telstar, Bio II advance, Szafa klasy II, EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Filtrowanie grzybni</td><td>Nylonowa moskitiera</td><td>Mesh o średnicy porów 0,6-1 mm</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Pożywki do autoklawowania i nasiona ciecierzycy</td><td>Autoklaw</td><td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td></tr><tr><td>Mikroskopy</td><td>Wizualizacja infekcji i grzybni</td><td>SMZ25 / SMZ18, Stereoskopy badawcze, Edukacyjny mikroskop stereoskopowy</td> <td>Leica EZ4https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>Waga</td><td>Ważenie grzybów i chemikaliów</td><td>Elektroniczna waga wagowa Sartorius, BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Barwienie grzybów</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN</td></tr><tr><td>Błękit anilinowy</td><td>Barwienie grzybów</td><td>Himedia</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

testy suchej zgnilizny korzeni ciecierzycy: szczegółowa metodologia

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Choroba suchej zgnilizny korzeni (DRR) jest nowym zagrożeniem dla uprawy ciecierzycy na całym świecie. Jest wywoływana przez patogen grzybowy przenoszony przez glebę, Rhizoctonia bataticola. W literaturze brakuje kompleksowych i szczegółowych protokołów krok po kroku dotyczących testów choroby. Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat kroków związanych z konfiguracją techniki bibuły do szybkiego badania genotypów pod kątem oporności na DRR. Technika bibuły jest łatwa i tańsza. Inna metoda, oparta na podejściu chorej doniczki, jest naśladowaniem naturalnej infekcji i może być stosowana do badania oddziałujących na siebie składników – rośliny, patogenu i środowiska – zaangażowanych w trójkąt chorobowy.
Ponadto, w naturze, DRR występuje głównie na obszarach uprawy ciecierzycy karmionych deszczem, gdzie wilgotność gleby spada wraz z postępem upraw. Wiadomo, że stres związany z suszą predysponuje rośliny ciecierzycy do choroby DRR. Patomorfologiczne i molekularne zrozumienie interakcji między roślinami a patogenami w warunkach stresu związanego z suszą może utorować drogę do identyfikacji elitarnych odmian odpornych na DRR z puli plazmy zarodkowej ciecierzycy. W tym artykule przedstawiono metodologię etapową przygotowania chorego garnka i późniejszego testu choroby. Ogólnie rzecz biorąc, informacje przedstawione w niniejszym dokumencie pomogą naukowcom przygotować inokulum grzyba R. bataticola, utrzymać ten patogen, skonfigurować technikę bibuły, przygotować chorą kulturę i chorą doniczkę oraz ocenić infekcję patogenami w roślinach ciecierzycy.

Celem niniejszego badania było zaprezentowanie technik, takich jak metoda papieru filtracyjnego oraz technika doniczki do roślin chorych, w celu ułatwienia patomorfologicznego i molekularnego zrozumienia interakcji między rośliną a patogenem w warunkach stresu suszowego. W tym celu z pola ciecierzycy pobrano rośliny wykazujące objawy DRR1,3,4, a grzyba wyizolowano metodą wierzchołka strzępki8. Kultura grz...

To badanie przedstawia metodologie badania patomorfologicznych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw interakcji ciecierzyca – Rhizoctonia bataticola. Metoda bibuły jest przydatna do szybkiego badania reakcji genotypu ciecierzycy, podczas gdy metoda oparta na chorej doniczce może być stosowana do jednoczesnego nakładania suszy i infekcji R. bataticola oraz badania przesiewowego pod kątem tolerancyjnych genotypów.

Testy suchej zgnilizny korzeni ciecierzycy: szczegółowa metodologia

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Głównym celem tego badania jest zademonstrowanie szczegółowej metodologii testów na suchą chorobę zgnilizny korzeni, takich jak technika bibuły i technika chorej doniczki. Techniki te będą pomocne w badaniu interakcji między ciecierzycą a Rhizoctonia bataticola. Zrozumienie interakcji ciecierzycy z patogenem grzybowym Rhizoctonia bataticola jest ważne z rolniczego punktu widzenia.W tym celu potrzebne są wszechstronne i wysoce powtarzalne testy. Tutaj zademonstrowane są dwa testy, które są szeroko stosowane w naszym laboratorium. Jeden z nich jest oparty na bibule, a drugi to test na bazie chorego garnka.Aby wykonać test bibuły, należy przygotować inokulum grzyba Rhizoctonia bataticola, skalując w górę z hodowli skośnej na płytkę Petriego, a następnie do kultury płynnej. Przygotuj szkółkę ciecierzycy, wysiewając nasiona do dużej doniczki. Wyrwij je z korzeniami, umieść w płynnym inokulum i umieść na bibułce.Obserwuj objawy choroby, a mianowicie martwicę korzeni, zgniliznę korzeni i żółknięcie liści osiem dni po inokulacji. Pokazane tutaj jest w skrócie, kroki w technice bibuły. Aby wykonać test chorego garnka, zaszczep mączkę z ciecierzycy grzybem.Po inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 dni uzyskuje się chorą kulturę. Następnie sproszkowaj je i wymieszaj z mieszanką garnkową. Wysiewaj nasiona do doniczki kontrolnej i doniczki chorej.W kolejnych dniach obserwuj objawy, a mianowicie martwicę korzeni, zgniliznę korzeni i żółknięcie liści na zainfekowanych roślinach, 10 dni po siewie. Chora doniczka może być skalowana i może być używana do badań przesiewowych na dużą skalę. Pokazane tutaj jest w skrócie kroki w technice chorego garnka.Rhizoctonia bataticola jest rozwijającym się patogenem. Grzyb ten wytwarza strzępki i mikrosklerocję, które działają jako pierwotny inuclum podczas infekcji rośliny. Do testów stosuje się czystą kulturę aplikowaną metodą izolacyjną.Kluczowym punktem dla tych udanych testów jest optymalne obciążenie inokulum. Demonstracja techniki bibuły zaczyna się tutaj. Aby przygotować płynny inokulum Rhizoctonia bataticola, należy zaszczepić 500 ml bulionu zatyczką agarową z trzydniowej świeżej kultury płytkowej i inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć dni.Odfiltruj ciemnoszarą grzybnię grzybów za pomocą mikrosklerocji. Zawiesić w autoklawizowanej wodzie i usunąć pożywkę. Ponownie, odfiltruj grzybnię i usuń wilgoć poprzez suszenie grzybni przez kilka minut.Zawieś 100 gramów inokulum grzybów w 200 ml autoklawowanej wody w butelce z dżemem i odpowiednio wymieszaj. Rozwiń szkółkę ciecierzycy, wysiewając nasiona sterylizowane powierzchniowo w solerancie. Wyrwij rośliny z korzeniami osiem dni po siewie, umyj je i spłucz autoklawizowaną RO. Weź bibułę i złóż ją raz, a następnie połóż połowę na tacy.Zwilż go wodą z autoklawy. Weź rośliny i zanurz je w inokulum na 30 sekund z przerywanymi ruchami w górę iw dół. Umieść rośliny w taki sposób, aby korzenie były pokryte wewnątrz arkusza, a folia pozostała na zewnątrz.Złóż drugą połowę i zegnij papier. W celu kontroli zanurz rośliny w autoklalawowanej wodzie, trzymaj tace w komorze wzrostowej przez osiem dni. Wyniki. Obserwuj objawy, takie jak żółknięcie liści, zgnilizna korzeni, nekroza korzeni i zmniejszenie liczby korzeni bocznych.Demonstracja techniki chorego garnka zaczyna się tutaj. Weź jeden kilogram komercyjnych nasion ciecierzycy. Umyj nasiona wodą z kranu i ponownie umyj wodą RO.Moczyć nasiona przez pięć godzin. Ponownie umyj nasiona wodą RO, dodaj 300 gramów do butelki z dżemem. Autoklawuj je w 121 LVS przez 15 minut dwa razy w ciągu.Po ostygnięciu przelać butelkę przez przepływ laminarny. Zaszczep butelki trzema grzybami agarowymi o rozmiarach około czterech milimetrów kwadratowych i dobrze wstrząsnij, aby odpowiednio wymieszać. Zawiń butelki i inkubuj je w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 dni.Obserwuj butelki z ciemnym wzrostem grzybni wokół nasion ciecierzycy i usuń nasiona. Wysuszyć je w temperaturze pokojowej i sproszkować. Wymieszaj proszek Rhizoctonia bataticola z solorytem i przechowuj je w temperaturze pokojowej przez pięć dni.Wysterylizuj powierzchniowo nasiona GT62 i wysiewaj je na głębokość dwóch centymetrów. Wyniki. Obserwuj 90% śmiertelności w chorym garnku. 10 dni po wysiewie obserwuj objawy, takie jak martwica korzeni i zmniejszenie liczby korzeni bocznych oraz żółknięcie liści w kolejnych dniach.Chorą doniczkę można również przygotować w glebie polowej. Susza i zakażenie Rhizoctonia bataticola. Nałóż stres suszy do chorej doniczki, wstrzymując wodę.Pokazano tutaj rośliny poddane zwalczaniu, suszy, patogenom oraz jednoczesnemu stresowi suszy i patogenów. Obserwuj objawy, a mianowicie większą martwicę, zgniliznę korzeni oraz zmniejszenie liczby korzeni bocznych i długości korzeni w skojarzonym leczeniu stresu w porównaniu z leczeniem tylko patogenów. Wnioski. Technikę bibuły można przeprowadzić w warunkach in vitro.Technika chorej doniczki może być wykonywana w warunkach In Vivo. W chorym porcie stres abiotyczny, czyli stres związany z suszą, może być narzucony wraz z infekcją patogenem. Korzystając z tych technik, można badać wzorzec infekcji patogenem.Większość zmian fizjologicznych zachodzi podczas interakcji ciecierzyca z Rhizoctonia bataticola, a także bada genotypy ciecierzycy pod kątem odporności. Test bibuły jest bardzo przydatny do generowania wysokiej jakości próbek do badań mikroskopowych i biologii molekularnej. Test chorej doniczki, który naśladuje naturalne warunki infekcji, ma zastosowanie do badań przesiewowych plazmy zarodkowej ciecierzycy.

dry-root-rot-disease-assays-in-chickpea-a-detailed-methodology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Prezentowany jest protokół testu konkurencji płytkowej w celu określenia, czy dany kompost może zawierać bakterie i grzyby, które hamują wzrost Rhizoctonia solani.

Test konkurencji płytkowej jako szybka wstępna ocena supresji choroby

Opanowanie więdnięcia arbuza przez Fusarium wymaga wiedzy na temat obecnych ras patogenów. Tutaj opisujemy metody zanurzania korzeni, poinfestowanego wysiewu ziaren i zmodyfikowanego zaszczepiania tacowego, aby wykazać ich skuteczność w typowaniu rasowym chorobotwórczego grzyba Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Kontrast trzech technik inokulacji stosowanych do określenia rasy nieznanego Fusarium oxysporum f.sp. niveum powiedział: Izolatów

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Używamy prostych narzędzi laboratoryjnych do badania architektury systemu korzeniowego (RSA) Arabidopsis i Medicago. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie na siatce i rozprowadzane za pomocą pędzla artystycznego, aby odsłonić RSA. Obrazy są wykonywane za pomocą skanowania lub kamery o wysokiej rozdzielczości, a następnie analizowane za pomocą ImageJ w celu zmapowania cech.

Prosty protokół mapowania cech architektury systemu korzeniowego roślin

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za odporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym nosicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.

Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

Poznaj metodykę testów suchej zgnilizny korzeni ciecierzycy wykorzystującą technikę bibulową oraz chorej doniczki do badania interakcji z Rhizoctonia bataticola. Te powtarzalne metody umożliwiają skuteczną selekcję genotypów odpornych na stres.

Testy suchej zgnilizny korzeni ciecierzycy: szczegółowa metodologia

Przeglądaj więcej filmów