Profilowanie metaboliczne w celu określenia bakteriobójczego lub bakteriostatycznego działania nowych produktów naturalnych za pomocą mikrokalorymetrii izotermicznej

Zrozumienie sposobu działania nowych związków przeciwbakteryjnych jest ważnym, ale trudnym zadaniem. Ta metoda zapewnia wgląd w takie mechanizmy i jest łatwa do wdrożenia. Technika ta pozwala na obserwację działania przeciwbakteryjnego w czasie rzeczywistym w sposób nieinwazyjny, umożliwiając dalszą analizę próbki.

Chociaż ćwiczenie z technikami mikrobiologicznymi jest warunkiem wstępnym, eksperyment jest łatwy do przeprowadzenia. Nie spiesz się z analizą danych i nie spiesz się z analizą danych, gdy wykonujesz mikrokalorymetrię po raz pierwszy. Zacznij od użycia spektrofotometru o długości fali 600 nanometrów do pomiaru gęstości optycznej nocnej hodowli.

Rozcieńczyć kulturę do 5 razy 10 do 5 jednostek tworzących kolonię na mililitr świeżego stężenia pożywki MHB i dodać 150 mikrolitrów komórek do każdej 1,5 mililitrowej probówki antybiotyku o stężeniu, które Cię interesuje. Następnie wymieszaj związek z komórkami przez wirowanie. Aby przygotować wkładki, dodaj 120 mikrolitrów każdej mieszanki antybiotyków bakteryjnych do pojedynczych plastikowych wkładek w odpowiednich dołkach 48-dołkowej płytki i użyj pęsety, aby umieścić wszystkie tytanowe fiolki w uchwytach.

Delikatnie przenieść wkładki do fiolek tytanowych w płytce uchwytu i luźno umieścić tytanowe pokrywki na wszystkich fiolkach. Po przeniesieniu wszystkich wkładek umieść uchwyt w wyznaczonym miejscu na stacji pobierania próbek i użyj klucza dynamometrycznego ustawionego na 40 centyniunometrów, aby dokręcić wszystkie pokrywki. W oprogramowaniu systemowym rozpocznij nowy eksperyment i wycofaj ramię wprowadzające próbkę z urządzenia.

Umieść uchwyt na kubek na mostku z kolumną ósmą skierowaną w stronę otworu do wkładania próbki i delikatnie wepchnij uchwyt na kubek do przyrządu w pozycji pierwszej. Odczekaj 10 minut, aż system się ustabilizuje, zanim oznaczysz dołki eksperymentalne. Następnie popchnij ramię do wkładania próbki, aż uchwyt kubka znajdzie się w pozycji drugiej.

Po ustabilizowaniu się systemu przez 20 minut, popchnij ramię wprowadzające próbkę do pozycji trzeciej i wsuń ramię do wprowadzania próbki, aż znajdzie się w pozycji roboczej. Zaznacz wszystkie dołki w oprogramowaniu i wybierz początek reakcji, a następnie uruchom eksperyment, aż odczyty emisji ciepła stabilnie powrócą do zera. Na końcu analizy wybierz opcję Zatrzymaj.

Oprogramowanie zapyta następnie, czy jesteś pewien. Wybierz pozycję tak i zapisz eksperyment do analizy danych. Następnie włóż ramię do wprowadzania próbki całkowicie do przyrządu i włącz magnesy, aby wyjąć uchwyt na kubek.

Aby przeanalizować dane, otwórz oprogramowanie i wybierz pozycję Otwórz eksperyment. W wyskakującym okienku wybierz interesujący Cię eksperyment i kliknij przycisk Otwórz. Kliknij opcję Zaznacz wszystko i zdefiniuj linię bazową, aby znormalizować dane w każdej pozycji.

W wyskakującym okienku wybierz okres czasu dłuższy niż 30 minut w fazie opóźnienia. Po dokonaniu wyboru linia bazowa pojawi się na termogramie w kolorze zielonym. Zamknij okno definiowania sekcji linii bazowej, a następnie kliknij przycisk Zapisz i zamknij oprogramowanie.

Następnie otwórz internetową aplikację do analizy kalorymetrii SymCel. Kliknij przycisk Przeglądaj, aby przesłać interesujący Cię plik, a następnie wybierz eksperyment. Parametry metaboliczne zostaną automatycznie obliczone dla 32 próbek.

Aby dopasować dane przepływu ciepła do modeli wzrostu Gompertza i/lub Richardsa, kliknij opcję Funkcja wzrostu. Modele wzrostu zostaną wyświetlone w sekcji skumulowanej w celu porównania z surowymi danymi w sekcji przepływu. Aby pobrać obliczone parametry, kliknij przycisk Pobierz miary, wybierz lokalizację pliku i kliknij przycisk Zapisz.

Plik zostanie wyeksportowany do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. Tutaj wyświetlane są termogramy uzyskane przez wystawienie A.baumannii DSM-30008 na działanie cyprofloksacyny w seryjnym rozcieńczeniu. Stężenia od 0,005 do 0,1 mikromola mają minimalny wpływ na wzrost i metabolizm A. baumannii.

Traktowanie komórek 0,5 mikromolową cyprofloksacyną prowadzi jednak do znacznego przesunięcia czasu trwania fazy opóźnienia i do niższego maksymalnego przepływu ciepła. Te dwie zmiany razem wpływają na czas do szczytu, co skutkuje wydłużeniem o około sześć godzin. Na tym rysunku skumulowane uwolnione ciepło jest wykreślane w czasie, przy czym wpływ każdego stężenia jest odzwierciedlony przez nachylenie nachylenia.

Kwantyfikacja nachylenia termogramu pozwala na obliczenie maksymalnej szybkości metabolizmu A. baumannii w obecności cyprofloksacyny przy jednoczesnym zmniejszeniu szybkości metabolizmu obserwowanym w komórkach poddanych działaniu cyprofloksacyny o stężeniu 0,5 mikromolowym. Leczenie ryfampicyną ma dramatyczny wpływ na termogramy A.baumannii DSM-30008. Obserwuje się również znaczne zmniejszenie emisji ciepła korelujące ze spadkiem aktywności metabolicznej.

Należy zwrócić uwagę na wydłużenie czasu do osiągnięcia wartości szczytowej dla wszystkich badanych stężeń oraz spadek tempa przemiany materii spowodowany spadkiem nachylenia dla wszystkich stężeń, które zwykle przypisuje się działaniu bakteriobójczemu. Aby zapewnić optymalne wyniki, należy stosować pipetowanie odwrotne i zapobiegać przedostawaniu się dodatkowego płynu po bokach wkładu podczas przenoszenia próbki, a także upewnić się, że pokrywki są prawidłowo zamknięte.