Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Nasz protokół odkrywa markery epigenetyczne rozwoju roślin sorgo i odporności na suszę. Takie zrozumienie molekularne pomoże w opracowaniu lepszych rozwiązań w celu dostosowania upraw do ekstremalnych warunków klimatycznych w przyszłości. Protokół ten generuje histony o wysokiej czystości z tkanki liści sorgo, odpowiednie do nieukierunkowanego profilowania modyfikacji potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas.

Procedurę zademonstrują Shadan Abdali i Tanya Winkler, pracownicy naukowi po licencjacie z EMSL. Na początek zmiel kilka liści sorgo ciekłym azotem i przechowuj je w 50-mililitrowej probówce wirówkowej w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Użyj około czterech gramów proszku z liści do analizy histonów w każdej próbce.

Przygotować ekstrakcyjne 1, 2A i 2B zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i dodać tabletkę inhibitora proteazy do pierwszego buforu ekstrakcyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2X. Następnie dodaj 20 mililitrów przygotowanego buforu ekstrakcyjnego do zmielonego proszku liściastego i delikatnie mieszaj lub wiruj przez 10 minut. Używając siatki 100, przepłukać przefiltrowany materiał dwukrotnie dwoma mililitrami buforu ekstrakcyjnego, po jednym za każdym razem.

Następnie odwiruj filtrat w temperaturze 3000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym, aby osadzać resztki komórek i duże organelle subkomórkowe. Jednocześnie należy przygotować bufor ekstrakcyjny 2A, dodając inhibitor proteazy do końcowego stężenia 0,4X. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.

Następnie ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach przygotowanego buforu ekstrakcyjnego 2A. Inkubować go na lodzie przez 10 minut, delikatnie mieszając. Odwirować roztwór w temperaturze 2, 100 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w obracającym się wirniku kubełkowym, aby osadzać zanieczyszczenia i jądra.

Ostrożnie zdekantować supernatant, nie naruszając osadu. Przygotować bufor ekstrakcyjny 2B, dodając inhibitory proteazy do końcowego stężenia 1X. Dodaj pięć mililitrów tego przygotowanego buforu do osadu otrzymanego po odwirowaniu.

Wirować przy 2, 100 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym w celu osadzania gruzu i jąder. Jednocześnie należy przygotować bufor do lizy jąder, dodając tabletkę z inhibitorem proteazy. Ostrożnie zdekantować supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu do lizy.

Wiruj roztwór przez 15 sekund z maksymalną prędkością, aby go homogenizować i ponownie zawiesić materiał. Następnie poddawaj go sonikacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić zamrożoną próbkę jąder i dodać 750 mikrolitrów 5% buforu guanidyny.

Następnie sonikuj go przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś próbkę do dwumililitrowej probówki i wiruj ją z prędkością 10 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jednocześnie należy przygotować kolumnę do chromatografii jonowymiennej, przepłukując ją dwoma mililitrami acetonitrylu i czterema mililitrami wody, aby zminimalizować zanieczyszczenie powierzchni.

Załaduj około 200 do 300 mikrolitrów słabej żywicy kationowymiennej na kolumnę chromatograficzną i pozwól żywicy osiąść. Umyj żywicę czterokrotnie buforem guanidyny i umieść rurkę i kolumnę na lodzie. Umieścić kolumnę na dwumililitrowej probówce zbiorczej i powoli załadować supernatant z przygotowanej próbki na złoże żywicy, nie naruszając żywicy.

Gdy roztwór przepływa, załaduj eluent z powrotem na górę kolumny sześć do ośmiu razy, aby umożliwić maksymalne wiązanie z żywicą. Następnie załaduj dwa mililitry 5% buforu guanidyny, aby zmyć białka niehistonowe z kolumny. Eluować białka histonowe jednym mililitrem 5% buforu guanidyny i zebrać eluent.

Wyczyść trzykilodaltonowy filtr wirowy z odcięciem 500 mikrolitrów rozpuszczalnika do mycia, a następnie odsolić pozostały eluent za pomocą wstępnie oczyszczonego filtra wirowego. Główne białka histonowe zaobserwowano w określonych regionach mapy cech LC-MS, co wskazuje na sukces eksperymentu. Ta reprezentatywna mapa pokazuje nienaruszone histony na całej długości w przerywanych polach.

Mapa cech LC-MS proteoform H2B i 16 kilodaltonów H2A pokazuje, że oba mają wiele homologów o podobnych sekwencjach, jak zaznaczono w unikalnych numerach sesji produktu. Można zaobserwować kolejną grupę histonów H2A bez wydłużonych ogonów. N-końcową acetylację, dodatkowe acetylacje lizyny i utlenianie metioniny w białkach histonowych H4 można zaobserwować, badając różnice mas na mapie cech LC-MS pokazanej tutaj.

Zidentyfikowano dwie sekwencje białek histonów H3, H3.3 i H3.2. Fragmentacja dysocjacji przenoszenia elektronów została wykorzystana do wygenerowania widma fragmentacji zidentyfikowanej proteoformy H3.2. Jony prekursorowe oraz poprzednie i następne widma Ms1 są pokazane tutaj z dopasowanymi pikami izotopów podświetlonymi na fioletowo.

Modyfikacje potranslacyjne można zlokalizować za pomocą mapy pokrycia sekwencji. Porównując względną liczebność proteoform, odkryto zmiany w skróconych proteoformach histonów specyficznych dla warunków próbki. C-końcowe obcięcie H4 zaobserwowano tylko w trzecim i dziewiątym tygodniu dla niektórych próbek.

W przypadku H3.2 N-końcowe skrócone proteoformy były na ogół liczniejsze w 10. tygodniu. W przeciwieństwie do tego, C-końcowe obcięte H3.2 zaobserwowano we wcześniejszych punktach czasowych. C-końcowe C-ścięte proteoformy H4 były znacznie liczniejsze w BTx642 niż w RTx430.

Próbując zastosować ten protokół, należy zwrócić szczególną uwagę na kolory supernatantu i osadu. Zmiana koloru pomaga zidentyfikować potencjalne problemy z mieleniem lub lizą chloroplastu. Mamy nadzieję, że ten solidny protokół izolacji histonów z liści sorgo umożliwi badania epigenetyczne innych podobnych roślin.