Name: Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Naucz się izolować histony z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji epigenetycznych metodą spektrometrii mas. Ta metoda umożliwia badanie markerów odporności na suszę w roślinach uprawnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ronaldowi Moore'owi i Thomasowi Fillmore'owi za pomoc w eksperymentach ze spektrometrią mas, a Matthew Monroe za deponowanie danych. Badania te zostały sfinansowane z grantów Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) ds. Badań Biologicznych i Środowiskowych w ramach projektu Epigenetic Control of Drought Response in Sorgo (EPICON) w ramach nagrody o numerze DE-SC0014081, przyznawanej przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D) oraz za pośrednictwem Joint BioEnergy Institute (JBEI), obiektu sponsorowanego przez DOE (kontrakt DE-AC02-05CH11231) między Lawrence Berkeley National Laboratory a DOE. Badania przeprowadzono przy użyciu Laboratorium Środowiskowych Nauk Molekularnych (EMSL) (grid.436923.9), Biura Użytkowników Nauki DOE sponsorowanego przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych.

<ol><li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+drought+stress%3A+Effects%2C+mechanisms+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li>
<li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+under+global+warming%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Climate+Change%22%5BJournal%5D)">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li>
<li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+sorghum+as+a+dedicated+bioenergy+feedstock%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%2C+Bioproducts+and+Biorefining%22%5BJournal%5D)">Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock.</a> Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).</li>
<li>Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorghum+bicolor+-+an+important+species+for+comparative+grass+genomics+and+a+source+of+beneficial+genes+for+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+delays+development+of+the+sorghum+root+microbiome+and+enriches+for+monoderm+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).</li>
<li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+succession+in+arbuscular+mycorrhizal+fungal+communities%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities.</a> ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).</li>
<li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+community+assembly+in+drought-stressed+sorghum+shows+stochasticity%2C+selection%2C+and+universal+ecological+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+histone+modifications+in+plant+abiotic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of histone modifications.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li>
<li>Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top-down%2C+middle-down%2C+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li>
<li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+individual+histone+posttranslational+modifications+and+their+combinatorial+patterns+by+mass+spectrometry-based+proteomics+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).</li>
<li>Maile, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+quantification+of+histone+post-translational+modifications+by+a+hybrid+chemical+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).</li>
<li>Dang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+pilot+project+of+the+consortium+for+top-down+proteomics%3A+a+status+report%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report.</a> Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).</li>
<li>Schaffer, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+proteoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry.</a> Proteomics. 19 (10), 1800361(2019).</li>
<li>Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative top-down proteomics.</a> Molecular Omics. , (2020).</li>
<li>Varoquaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+field-droughted+sorghum+from+seedling+to+maturity+reveals+biotic+and+metabolic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124(2019).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+changes+in+histone+post-translational+modifications+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).</li>
<li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li>
<li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopPIC%3A+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Ocford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informed-Proteomics%3A+open-source+software+package+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li>
<li>LeDuc, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-Score%3A+a+bayesian+framework+to+sharply+improve+proteoform+scoring+in+high-throughput+top+down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).</li>
<li>Fornelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+top-down+analysis+of+the+human+proteome+using+a+benchtop+quadrupole-orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).</li>
<li>Sun, R. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pTop+1.0%3A+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li>
<li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASH+Suite+Pro%3A+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , San Diego, Calif. (2019).</li>
<li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET%2FNSD2+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li>
<li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li>
<li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li>
<li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li>
<li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li>
<li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li>
</ol>

Prezentowany protokół opisuje sposób ekstrakcji histonów z próbek liści sorgo (lub ogólniej liści roślin). Oczekuje się, że średni plon histonów wyniesie 2–20 μg na 4–5 g materiału z liści sorgo. Materiały są wystarczająco czyste do dalszej analizy histonów za pomocą LC-MS (głównie histonów z ~20% zanieczyszczeniem białkami rybosomalnymi). Niższą wydajność można uzyskać ze względu na różnice w próbce lub potencjalne niewłaściwe obchodzenie się/awarie w całym protokole. Utrzymanie integralności jąder przed etapem lizy jąd...

Oczekuje się, że rosnąca dotkliwość i częstotliwość suszy wpłynie na produktywność upraw zbóż1,2. Sorgo to roślina zbożowa i energetyczna, znana ze swojej wyjątkowej odporności na warunki ograniczające ilość wody3,4. Staramy się uzyskać mechanistyczne zrozumienie wzajemnych zależności między stresem związanym z suszą, rozwojem roślin i epigenetyką roślin sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench]. Nasze poprzednie prace wykazały silne powiązania między mikrobiomem roślin i ryzosfery w aklimatyzacji i reakcjach na suszę na poziomie molekularnym5,6,7. Badania te utorują drogę do wykorzystania inżynierii epigenetycznej w adaptacji upraw do przyszłych scenariuszy klimatycznych. W ramach wysiłków na rzecz zrozumienia epigenetyki zamierzamy zbadać markery białkowe, które wpływają na ekspresję genów w organizmie rośliny.
Histony należą do wysoce konserwatywnej rodziny białek u eukariontów, które pakują DNA do nukleosomów jako podstawowe jednostki chromatyny. Modyfikacje potranslacyjne (PTM) histonów są regulowane dynamicznie w celu kontrolowania struktury chromatyny i wpływania na ekspresję genów. Podobnie jak inne czynniki epigenetyczne, w tym metylacja DNA, histony PTM odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych8,9. Testy oparte na przeciwciałach, takie jak western blot, są szeroko stosowane do identyfikacji i ilościowego określania histonów PTM. Ponadto interakcja histonów PTM i DNA może być skutecznie badana przez immunoprecypitację chromatyny – sekwencjonowanie (ChIP-seq)10. W ChIP-seq chromatyna ze specyficznym ukierunkowanym histonem PTM jest wzbogacona o przeciwciała przeciwko temu specyficznemu PTM. Następnie fragmenty DNA mogą zostać uwolnione ze wzbogaconej chromatyny i zsekwencjonowane. Ujawniane są regiony genów, które oddziałują z docelowym histonem PTM. Jednak wszystkie te eksperymenty w dużym stopniu opierają się na wysokiej jakości przeciwciałach. W przypadku niektórych wariantów/homologów histonów lub kombinacji PTM opracowanie silnych przeciwciał może być niezwykle trudne (szczególnie w przypadku wielu PTM). Ponadto przeciwciała można wytworzyć tylko wtedy, gdy znany jest docelowy histon PTM. 11 Dlatego konieczne są alternatywne metody nieukierunkowanego, globalnego profilowania histonów PTM.
Spektrometria mas (MS) jest komplementarną metodą charakteryzowania histonów PTM, w tym nieznanych PTM, dla których przeciwciała nie są dostępne11,12. Dobrze znany "oddolny" przepływ pracy w SM wykorzystuje proteazy do trawienia białek na małe peptydy przed separacją metodą chromatografii cieczowej (LC) i wykryciem SM. Ponieważ histony mają dużą liczbę reszt zasadowych (lizyny i argininy), trawienie trypsyny (proteazy specyficznej dla lizyny i argininy) w standardowym przepływie pracy od dołu do góry tnie białka na bardzo krótkie peptydy. Krótkie peptydy są technicznie trudne do analizy przez standardowy LC-MS i nie zachowują informacji o łączności i stechiometrii wielu PTM. Użycie innych enzymów lub znakowania chemicznego do blokowania lizyn generuje dłuższe peptydy, które są bardziej odpowiednie do charakterystyki histonów PTMs13,14.
Alternatywnie, etap trawienia można całkowicie pominąć. W tym podejściu "odgórnym" nienaruszone jony białkowe są wprowadzane do MS przez jonizację elektronrozpylania (ESI) po separacji LC online, dając jony nienaruszonych proteoform histonowych. Ponadto jony (tj. proteoformy) będące przedmiotem zainteresowania mogą być izolowane i fragmentowane w spektrometrze mas w celu uzyskania jonów sekwencji do identyfikacji i lokalizacji PTM. W związku z tym MS z góry na dół ma tę przewagę, że zachowuje informacje na poziomie proteoform i przechwytuje łączność wielu PTM i obcięć końcowych na tym samym proteoform15,16. Eksperymenty odgórne mogą również dostarczyć informacji ilościowych i zaoferować wgląd w biomarkery na nienaruszonym poziomie białka17. W tym miejscu opisujemy protokół ekstrakcji histonu z liścia sorgo i analizy nienaruszonych histonów za pomocą odgórnego LC-MS.
Przykładowe dane pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2 pochodzą z liści sorgo zebranych w 2 tygodniu po posadzeniu. Chociaż spodziewane są różnice w wydajności, protokół ten jest na ogół niezależny od określonych warunków próbki. Ten sam protokół został z powodzeniem zastosowany w przypadku tkanki liści rośliny sorgo pobranej z 2, 3, 5, 8, 9 i 10 tygodni po posadzeniu.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4L</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, roztwór 500mM, pH 8,0</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>324504-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Sigma</td><td>G3272-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>P3786-100G</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy, tabletki cOmcomplete</td><td></td> Roche <td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma</td><td>303410-5G</td><td>Stosowany do inhibitora deacetylazy histonowej</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Sód Fluorek</td><td>Sigma</td><td>S7020-100G</td><td>Używany do inhibitora fosfatazy</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma</td><td>450243-10G</td><td>Używany do inhibitora fosfatazy</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Słaba żywica kationowymienna, siatka 100-200 analityczna (BioRex70)</td><td>Bio-Rad</td><td>142-5842</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna (Bio-Spin)</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Tkanina filtracyjna Mesh 100</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY1H09000</td><td>Jest to część zestawu Sigma (katalog # CELLYTPN1) do ekstrakcji jąder roślinnych. Można stosować podobne filtry o tym samym rozmiarze oczek.</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet (P20, P200, P1000)</td>Probówka <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 50mL/15mL, Wirówka, Stożkowa</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>Probówka, Mikrowirówka, 1.5/2 mL</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-912-401</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki ( 50 ml &ndash; 2L)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-006</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka wahadłowa z chłodzeniem</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli wodnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-336-120</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histony należą do rodziny wysoce konserwatywnych białek u eukariontów. Pakują DNA do nukleosomów jako jednostki funkcjonalne chromatyny. Modyfikacje potranslacyjne (PTM) histonów, które są bardzo dynamiczne i mogą być dodawane lub usuwane przez enzymy, odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. U roślin czynniki epigenetyczne, w tym histony PTM, są związane z ich reakcjami adaptacyjnymi na środowisko. Zrozumienie molekularnych mechanizmów kontroli epigenetycznej może przynieść bezprecedensowe możliwości dla innowacyjnych rozwiązań bioinżynieryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji jąder i oczyszczania histonów z tkanki liści sorgo. Wyekstrahowane histony można analizować w ich nienaruszonych formach za pomocą spektrometrii mas odgórnie (MS) w połączeniu z chromatografią cieczową (LC) w trybie online z odwróconymi fazami (RP). Kombinacje i stechiometria wielu PTM na tej samej proteoformie histonowej mogą być łatwo zidentyfikowane. Ponadto, obcinanie ogona histonowego można wykryć za pomocą przepływu pracy LC-MS od góry do dołu, uzyskując w ten sposób globalny profil PTM histonów rdzenia (H4, H2A, H2B, H3). Zastosowaliśmy ten protokół wcześniej do profilowania histonów PTM z tkanki liści sorgo pobranej z zakrojonego na szeroką skalę badania terenowego, mającego na celu identyfikację epigenetycznych markerów odporności na suszę. Protokół może potencjalnie zostać zaadaptowany i zoptymalizowany pod kątem sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq) lub do badania histonów PTM w podobnych roślinach.

Zgodnie z protokołem, histony mogą być wyizolowane i identyfikowane przy użyciu analizy LC-MS. Surowe dane i przetworzone wyniki są dostępne w MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) pod numerem dostępu: MSV000085770. Na podstawie wyników TopPIC z reprezentatywnego próbki (dostępnych również z MassIVE) zidentyfikowano 303 proteoformy histonowe (106 proteoform H2A, 72 proteoform H2B, 103 proteoform H3 oraz 22 proteoform H4). Wykryto również współoczyszczane proteoformy rybosomalne, które zazwyczaj eluują wcześnie w trakcie LC...

Protokół został opracowany w celu skutecznego wydobywania nienaruszonych histonów z materiałów z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji histonów po translacji, które mogą służyć jako potencjalne markery epigenetyczne do pomocy w inżynierii upraw odpornych na suszę.

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Nasz protokół odkrywa markery epigenetyczne rozwoju roślin sorgo i odporności na suszę. Takie zrozumienie molekularne pomoże w opracowaniu lepszych rozwiązań w celu dostosowania upraw do ekstremalnych warunków klimatycznych w przyszłości. Protokół ten generuje histony o wysokiej czystości z tkanki liści sorgo, odpowiednie do nieukierunkowanego profilowania modyfikacji potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas.Procedurę zademonstrują Shadan Abdali i Tanya Winkler, pracownicy naukowi po licencjacie z EMSL. Na początek zmiel kilka liści sorgo ciekłym azotem i przechowuj je w 50-mililitrowej probówce wirówkowej w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Użyj około czterech gramów proszku z liści do analizy histonów w każdej próbce.Przygotować ekstrakcyjne 1, 2A i 2B zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i dodać tabletkę inhibitora proteazy do pierwszego buforu ekstrakcyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2X. Następnie dodaj 20 mililitrów przygotowanego buforu ekstrakcyjnego do zmielonego proszku liściastego i delikatnie mieszaj lub wiruj przez 10 minut. Używając siatki 100, przepłukać przefiltrowany materiał dwukrotnie dwoma mililitrami buforu ekstrakcyjnego, po jednym za każdym razem.Następnie odwiruj filtrat w temperaturze 3000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym, aby osadzać resztki komórek i duże organelle subkomórkowe. Jednocześnie należy przygotować bufor ekstrakcyjny 2A, dodając inhibitor proteazy do końcowego stężenia 0,4X. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.Następnie ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach przygotowanego buforu ekstrakcyjnego 2A. Inkubować go na lodzie przez 10 minut, delikatnie mieszając. Odwirować roztwór w temperaturze 2, 100 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w obracającym się wirniku kubełkowym, aby osadzać zanieczyszczenia i jądra.Ostrożnie zdekantować supernatant, nie naruszając osadu. Przygotować bufor ekstrakcyjny 2B, dodając inhibitory proteazy do końcowego stężenia 1X. Dodaj pięć mililitrów tego przygotowanego buforu do osadu otrzymanego po odwirowaniu.Wirować przy 2, 100 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym w celu osadzania gruzu i jąder. Jednocześnie należy przygotować bufor do lizy jąder, dodając tabletkę z inhibitorem proteazy. Ostrożnie zdekantować supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu do lizy.Wiruj roztwór przez 15 sekund z maksymalną prędkością, aby go homogenizować i ponownie zawiesić materiał. Następnie poddawaj go sonikacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić zamrożoną próbkę jąder i dodać 750 mikrolitrów 5% buforu guanidyny.Następnie sonikuj go przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś próbkę do dwumililitrowej probówki i wiruj ją z prędkością 10 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jednocześnie należy przygotować kolumnę do chromatografii jonowymiennej, przepłukując ją dwoma mililitrami acetonitrylu i czterema mililitrami wody, aby zminimalizować zanieczyszczenie powierzchni.Załaduj około 200 do 300 mikrolitrów słabej żywicy kationowymiennej na kolumnę chromatograficzną i pozwól żywicy osiąść. Umyj żywicę czterokrotnie buforem guanidyny i umieść rurkę i kolumnę na lodzie. Umieścić kolumnę na dwumililitrowej probówce zbiorczej i powoli załadować supernatant z przygotowanej próbki na złoże żywicy, nie naruszając żywicy.Gdy roztwór przepływa, załaduj eluent z powrotem na górę kolumny sześć do ośmiu razy, aby umożliwić maksymalne wiązanie z żywicą. Następnie załaduj dwa mililitry 5% buforu guanidyny, aby zmyć białka niehistonowe z kolumny. Eluować białka histonowe jednym mililitrem 5% buforu guanidyny i zebrać eluent.Wyczyść trzykilodaltonowy filtr wirowy z odcięciem 500 mikrolitrów rozpuszczalnika do mycia, a następnie odsolić pozostały eluent za pomocą wstępnie oczyszczonego filtra wirowego. Główne białka histonowe zaobserwowano w określonych regionach mapy cech LC-MS, co wskazuje na sukces eksperymentu. Ta reprezentatywna mapa pokazuje nienaruszone histony na całej długości w przerywanych polach.Mapa cech LC-MS proteoform H2B i 16 kilodaltonów H2A pokazuje, że oba mają wiele homologów o podobnych sekwencjach, jak zaznaczono w unikalnych numerach sesji produktu. Można zaobserwować kolejną grupę histonów H2A bez wydłużonych ogonów. N-końcową acetylację, dodatkowe acetylacje lizyny i utlenianie metioniny w białkach histonowych H4 można zaobserwować, badając różnice mas na mapie cech LC-MS pokazanej tutaj.Zidentyfikowano dwie sekwencje białek histonów H3, H3.3 i H3.2. Fragmentacja dysocjacji przenoszenia elektronów została wykorzystana do wygenerowania widma fragmentacji zidentyfikowanej proteoformy H3.2. Jony prekursorowe oraz poprzednie i następne widma Ms1 są pokazane tutaj z dopasowanymi pikami izotopów podświetlonymi na fioletowo.Modyfikacje potranslacyjne można zlokalizować za pomocą mapy pokrycia sekwencji. Porównując względną liczebność proteoform, odkryto zmiany w skróconych proteoformach histonów specyficznych dla warunków próbki. C-końcowe obcięcie H4 zaobserwowano tylko w trzecim i dziewiątym tygodniu dla niektórych próbek.W przypadku H3.2 N-końcowe skrócone proteoformy były na ogół liczniejsze w 10. tygodniu. W przeciwieństwie do tego, C-końcowe obcięte H3.2 zaobserwowano we wcześniejszych punktach czasowych. C-końcowe C-ścięte proteoformy H4 były znacznie liczniejsze w BTx642 niż w RTx430.Próbując zastosować ten protokół, należy zwrócić szczególną uwagę na kolory supernatantu i osadu. Zmiana koloru pomaga zidentyfikować potencjalne problemy z mieleniem lub lizą chloroplastu. Mamy nadzieję, że ten solidny protokół izolacji histonów z liści sorgo umożliwi badania epigenetyczne innych podobnych roślin.

isolation-histone-from-sorghum-leaf-tissue-for-top-down-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Tutaj prezentujemy protokół do analizy rozkładu modyfikacji histonów w całym genomie, który może zidentyfikować nowe geny docelowe w patogenezie M. oryzae i innych grzybów strzępkowych.

Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae

Szczepienie pod celami i tagmentacją (CUT&amp;Tag) to skuteczna strategia profilowania epigenomicznego chromatyny. Protokół ten przedstawia udoskonaloną strategię CUT&amp;Tag do profilowania modyfikacji histonów w roślinach.

Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Naucz się izolować histony z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji epigenetycznych metodą spektrometrii mas. Ta metoda umożliwia badanie markerów odporności na suszę w roślinach uprawnych.

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Przeglądaj więcej filmów