Name: Przyrostowe zmiany temperatury dla maksymalnej hodowli i tarła w Astyanax mexicanus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj protokół przyrostowych zmian temperatury w celu stymulacji maksymalnego tarła u Astyanax mexicanus. Metoda ta umożliwia uzyskanie dużej liczby przezroczystych zarodków do badań genetycznych i rozwojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Davidowi Martasianowi, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craigowi Foote'owi i Mandy Ng za cenny wkład w ośrodek hodowli A. mexicanus w laboratorium Jeffery'ego. Badania w laboratorium Jeffery'ego są obecnie wspierane przez grant NIH EY024941.

Procedura ta została zatwierdzona zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Instytucjonalnej Komisji Etyki Badań na Zwierzętach Uniwersytetu Maryland w College Park (obecnie IACUC 469 #R-NOV-18-59; projekt 1241065-1).
<img alt="Harmonogram konserwacji akwarium ryb w okresie rozrodczym i nierozrodczym z zadaniami codziennymi i ustawieniami temperatury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61708/61708fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Kalendarze podczas tygodnia rozrodczego i tygodnia nierozrodczego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61708/61708fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
1. Poniedziałek
<ol>
	<li>Między godziną 9:00 a 10:00 przeprowadź testy wody oraz kroki 1.1.1-4 opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Zapisz temperaturę w pomieszczeniu, w zbiorniku i w rezerwuarze za pomocą termometru.</li>
		<li>Zapisz poziomy amoniaku, azotynów i azotanów za pomocą kolorymetrycznego zestawu testowego.</li>
		<li>Zapisz wartość pH odczytaną z systemu monitorującego oraz z kolorymetrycznego zestawu testowego.</li>
		<li>Zapisz przewodność odczytaną z monitora gąsiora oraz z głównego monitora systemu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Od godziny 10:00 nakarm wszystkie ryby.
	<ol>
		<li>Nakarm wszystkie ryby w systemie dla osobników dorosłych płatkami tetra, krusząc płatki w zbiornikach z młodymi rybami. Podawaj tylko tyle płatków, ile ryby w zbiorniku są w stanie całkowicie spożyć w ciągu 3-5 minut, czyli około „szczypty”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź inkubator służący do przechowywania naczyń z rozwijającymi się embrionami i w razie potrzeby wymień wodę.
	<ol>
		<li>Otwórz inkubator embrionów i sprawdź poziom wody we wszystkich rezerwuarach. Jeśli poziom wody jest niski, dolej wody systemowej. Sprawdź ustawienia temperatury inkubatora. Hoduj embriony w temperaturze 73-77 °F (23-25 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść żywy pokarm.
	<ol>
		<li>Aby oczyścić pierwianki, wyjmij z lodówki z żywym pokarmem niezakryte pojemniki Tupperware zawierające ich kultury i odlej nadmiar wody znajdującej się nad skupiskami pierwianków do zlewu. Używając wody destylowanej, zawieszaj i płucz pierwianki wielokrotnie, aż odlewana woda będzie przejrzysta.</li>
		<li>Dolej tyle czystej wody, aby skupiska pierwianków były przykryte mniej więcej do połowy. Włóż pozostałe pierwianki z powrotem do lodówki z żywym pokarmem, bez przykrycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakarm ryby.
	<ol>
		<li>Co najmniej 30 min po pierwszym karmieniu, nakarm ryby w zbiornikach, w których pożądany jest rozród, płatkami z żółtka jaja, pierwiankami lub obiema tymi rzeczami. Dodaj „szczyptę” płatków z żółtka na zbiornik. Dodaj tyle skupisk pierwianków, aby każda ryba w zbiorniku mogła spożyć około 5-10 pierwianków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Między godziną 10:00 a 13:00 ustaw temperaturę wody na 74 °F.</li>
	<li>W razie potrzeby wyszoruj zbiorniki hodowlane i ustaw sieci tarłowe.</li>
	<li>Wyczyść zbiorniki i umieść w nich sieci co najmniej godzinę po ostatnim karmieniu. Wcześniej wyczyść wszystkie zbiorniki, w których mają zostać umieszczone sieci. Ustaw sieci tarłowe ostrożnie, aby nie zakłócać dopływu powietrza do zbiornika.</li>
</ol>
2. Wtorek
<ol>
	<li>Zbierz zarodki i umyj wszystkie siatki do tarła.
	<ol>
		<li>Między godziną 9:00 a 10:00 wyjmij siatki do tarła z dna zbiorników systemu dla osobników dorosłych. Delikatnie wypłucz zarodki do siatki ręcznej, używając węża podłączonego do baniaka, a następnie odwróć siatkę ręczną nad miseczką z czystą wodą systemową, aby usunąć zarodki.</li>
		<li>Zbierz i umyj każdą partię zarodków, a następnie umieść je w miseczce z czystą wodą systemową zawierającą 0,00003% błękitu metylenowego (niebieska woda). Jeśli z jednego zbiornika pochodzi wyjątkowo duża liczba zarodków, rozdziel je do wielu miseczek. Stężenie żywych zarodków powinno wynosić około 100 na 200 mL niebieskiej wody w każdej miseczce.</li>
		<li>Oszacuj czas zapłodnienia, określając stadium rozwoju zarodków pod mikroskopem zgodnie z opublikowaną tabelą czasu rozwoju A. mexicanus17.</li>
		<li>Często monitoruj miseczki z zarodkami. Usuwaj martwe lub zdeformowane zarodki oraz zanieczyszczenia, takie jak niezjedzony pokarm lub odchody, za pomocą pipety Pasteura. Często wymieniaj niebieską wodę w miseczkach.</li>
		<li>Umieść miseczki w inkubatorze na 5-7 dni. W tym czasie żółtko zostaje zużyte i niezbędne dla dalszego rozwoju jest karmienie hodowli żywymi skorupiakami z rodzaju Artemia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz dane z tarła.
	<ol>
		<li>Dla każdego zbiornika, w którym pojawiły się zarodki, zapisz następujące informacje.
		<ol>
			<li>Zapisz datę i numer zbiornika.</li>
			<li>Zapisz przybliżoną liczbę złożonych zarodków (Rycina 2): 
			Wysoka (500+) 
			Średnia (200-500) 
			Niska (&lt;200)</li>
			<li>Zapisz jakość złożonych zarodków (Rycina 2): 
			Wysoka (&gt;75% żywych) 
			Średnia (25-50% żywych) 
			Niska (&lt;25% żywych)</li>
			<li>Oszacuj pierwotny czas tarła, korzystając z tabeli stadiów rozwoju Astyanax mexicanus17.</li>
			<li>Zapisz temperaturę, na jaką ustawiony był system w momencie tarła ryb.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakarm wszystkie ryby.</li>
	<li>Ustaw temperaturę wody na 76 °F.</li>
	<li>Przygotuj żywy pokarm.</li>
	<li>Nakarm ryby #2.</li>
	<li>Usuń nadmiar pokarmu i zanieczyszczenia ze zbiorników i wyszoruj je przed ponownym założeniem siatek.</li>
</ol>
3. Środa
<ol>
	<li>Powtórz kroki 2.1-2.2. Zbierz zarodki i umyj wszystkie siatki tarłowe.</li>
	<li>Zanotuj dane dotyczące tarła tak jak poprzednio.</li>
	<li>Wykonaj badania wody tak jak poprzednio.</li>
	<li>Nakarm wszystkie ryby.</li>
	<li>Ustaw temperaturę wody na 78 °F.</li>
	<li>Przygotuj żywy pokarm.</li>
	<li>Sprawdź stan zarodków w inkubatorze.
	<ol>
		<li>Wyczyść i wymień wodę zarodkom w naczyniach (fingerbowls), które w przyszłości posłużą do uzupełnienia ogólnej populacji osobników dorosłych w hodowli. Użyj wody systemowej z dodatkiem błękitu metylenowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakarm ryby ponownie.</li>
	<li>Wyczyść zbiorniki w razie potrzeby i ponownie rozstaw siatki.</li>
</ol>
4. Czwartek
<ol>
	<li>Powtórz kroki 2.1-2.2. Zbierz embriony, a następnie umyj i przechowaj siatki hodowlane.</li>
	<li>Zanotuj dane dotyczące tarła, tak jak wcześniej.</li>
	<li>Ustaw temperaturę wody na 76°F.</li>
	<li>Oczyść żywy pokarm.</li>
	<li>Wyczyść wszystkie poszczególne zbiorniki.</li>
	<li>Sprawdź stan embrionów w inkubatorze.</li>
	<li>Nakarm ryby #2.</li>
</ol>
5. Piątek
<ol>
	<li>Nakarm wszystkie ryby.</li>
	<li>Ustaw temperaturę wody na 74 °F.</li>
	<li>Wyczyść żywy pokarm.</li>
	<li>Sprawdź embriony w inkubatorze.</li>
</ol>
6. Sobota
<ol>
	<li>Karm ryby.</li>
</ol>
7. Niedziela
<ol>
	<li>Nakarm ryby.</li>
</ol>

<ol><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavefish+as+a+model+system+in+evolutionary+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology.</a> Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+model+systems+in+evo-devo%3A+cavefish+and+mechanisms+of+microevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution.</a> Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+in+the+cavefish+Astyanax%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and development in the cavefish Astyanax.</a> Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).</li>
<li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).</li>
<li>Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regressive+evolution+in+the+Mexican+cave+tetra%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus.</a> Current Biology. 17, 452-454 (2007).</li>
<li>O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+retinal+degeneration+in+the+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish.</a> PLoS ONE. 8 (2), 57281(2013).</li>
<li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13, 15(2015).</li>
<li>Elliot, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Astyanax+caves+of+Mexico.+Cavefishes+of+Tamaulipas%2C+San+Luis+Potosi%2C+and+Guerrero%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Mexican+Cave+Studies+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero.</a> Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1(2018).</li>
<li>Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+hardness+and+calcium%3Amagnesium+ratio+of+water+during+early+stages+of+rare+minnows+%28Gobiocypris+rarus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus).</a> Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).</li>
<li>Balasch, J. C., Tort, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+the+stress+responses+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Netting the stress responses in fish.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 62(2019).</li>
<li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorowsky%2C+R+%22Determining+the+sex+of+adult+Astyanax+mexicanus%22">Determining the sex of adult Astyanax mexicanus</a>. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).</li>
<li>Paschos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks%2C+feeding+time%2C+and+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 112(2015).</li>
<li>Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).</li>
<li>Williams, M. B., Watts, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+basis+and+future+directions+of+zebrafish+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics.</a> Genes & Nutrition. 14, 34(2009).</li>
<li>Harper, C., Wolf, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+effects+of+the+stress+response+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Morphologic effects of the stress response in fish.</a> ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).</li>
<li>Neubauer, P., Andersen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+performance+in+fish+is+explained+by+an+interplay+between+physiology%2C+behavior+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology.</a> Conservation Physiology. 7 (1), 025(2019).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Developmental staging table for Astyanax mexicanus.</a> Zebrafish. 8 (4), (2011).</li>
<li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorowsky%2C+R+%22In+vitro+fertilization+of+Astyanax+mexicanus%22">In vitro fertilization of Astyanax mexicanus</a>. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).</li>
<li>Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+behavior+in+the+blind+Mexican+cavefish+and+its+river-dwelling+conspecific%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific.</a> PLoS One. 14 (2), 0212591(2019).</li>
<li>Harvey, B. J., Carolsfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Breeding+in+Tropical+Fish+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Development+Research+Centre%22%5BJournal%5D)">Induced Breeding in Tropical Fish Culture.</a> International Development Research Centre. , (1993).</li>
<li>Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+a+lens+survival+pathway+including+sox2+and+aA-crystallin+in+the+evolution+of+cavefish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration.</a> EvoDevo. 5, 28(2014).</li>
<li>Krishnan, J., Rohner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavefish+and+the+basis+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cavefish and the basis for eye loss.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487(2017).</li>
<li>Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+changes+controlled+by+catecholaminergic+systems+explain+recurrent+loss+of+pigmentation+in+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish.</a> Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).</li>
<li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish.</a> PLoS ONE. 1093, 0119370(2015).</li>
<li>Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+mutagenesis+confirms+the+role+of+oca2+in+melanin+pigmentation+in+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Astyanax mexicanus to nowy model biologiczny, który często składa ikrę i może być łatwo rozmnażany w laboratorium 1,2. Ponieważ interesują nas mechanizmy rozwojowe, które leżą u podstaw zmian ewolucyjnych u ryb jaskiniowych A. mexicanus, produkcja i wykorzystanie zarodków ma kluczowe znaczenie dla naszych celów badawczych. Podstawowym celem utrzymania dorosłego stada ryb jest produkcja zarodków i młodego narybku do wykorzystania w doświadczeniac...

Teleost Astyanax mexicanus ma formę ryby zamieszkującej powierzchnię (ryby powierzchniowe) i wiele różnych form ślepych zamieszkujących jaskinie (ryby jaskiniowe)1,2. Ryby jaskiniowe ewoluowały w wiecznej ciemności i pod ograniczeniami żywieniowymi, co spowodowało pojawienie się nowych cech konstruktywnych i regresywnych3. Cechy konstruktywne obejmują wzrost kubków smakowych i wielkości szczęki, narządów zmysłów linii bocznej i rezerw tłuszczu. Cechy regresywne obejmują utratę lub zmniejszenie pigmentacji melaniny, oczu i zachowań, takich jak sen, nauka i agresja. Cechą systemu Astyanax jest całkowita płodność między tymi dwiema formami, co pozwala na wykorzystanie mapowania loci cech ilościowych (QTL) w celu określenia regionów genomowych związanych z konstruktywną i regresywną ewolucją4,5,6,7. A. mexicanus oferuje korzystny system do badania rozwoju, ponieważ można go skłonić do częstego tarła w laboratorium. Zarodki A. mexicanus są półprzezroczyste, nieco większe niż u danio pręgowanego, produkowane w dużych ilościach i rozwijają się w dojrzałe płciowo dorosłe osobniki w ciągu około 8-12 miesięcy. Ich okres maksymalnej zdolności tarłowej wynosi około 5 lat. Protokół ten opisuje przebieg pracy potrzebny w ośrodku hodowli A. mexicanus podczas typowego tygodnia hodowlanego i zawiera szczegóły dotyczące konserwacji systemu ryb oraz reżimu kontroli temperatury w celu maksymalnego tarła.
A. mexicanus to tropikalna ryba, która żyje w rzekach pochodzących z wapiennych płaskowyżów (ryby powierzchniowe) oraz w basenach w wapiennych jaskiniach (ryby jaskiniowe)8. Wapień rozpuszcza się, tworząc twardą wodę, a A. mexicanus rozwija się w twardej wodzie. Ryby przystosowane do warunków twardej wody mogą tolerować szereg słonych warunków, ale generalnie rozmnażają się w określonych warunkach9. Indukcja zachowań tarłowych odbywa się poprzez kombinację czynników. Ponieważ ryby są zmiennocieplne i polegają na swoim środowisku w celu utrzymania homeostazy, ich metabolizm jest wrażliwy na zmiany środowiskowe i szybciej reagują na stresory10. A. mexicanus powinien być hodowany w systemach wodnych w starannie regulowanych warunkach przepływu wody, pH, przewodności, ciśnienia osmotycznego, oświetlenia i temperatury wody.
W laboratorium Jeffery'ego, ryby są utrzymywane w dwóch systemach bieżącej wody: (1) "systemie niemowlęcym" dla młodych dorosłych ryb przed osiągnięciem dojrzałości płciowej i (2) systemie dla dorosłych (lub głównych) dla dojrzałych płciowo, rozmnażających się dorosłych. "System baby" składa się ze zbiorników o pojemności 8 l i 15 litrów zasilanych bieżącą wodą. "System niemowlęcy" jest wysiewany przez narybek i młode przeobrażone osobniki młodociane wyhodowane z larw w mniejszych (1-10 L) zbiornikach, w których woda jest wymieniana co tydzień. Larwy, narybek i młode osobniki są niezwykle zależne od pokarmu i muszą być karmione żywym pokarmem (krewetkami solankowymi) raz dziennie, aby zapewnić wysoki wskaźnik przeżycia. Młode osobniki młodociane z "systemu niemowlęcego" umieszcza się w systemie dorosłym po około 1-1,5 roku. Początkowo karmione są sproszkowanymi płatkami tetra, a po dalszym wzroście przenoszone są do regularnego reżimu żywienia dorosłych. Dojrzałość płciową można ocenić na podstawie objętości brzucha u samic, a metody określania płci zostały opisane11. W systemie dla dorosłych woda jest wymieniana automatycznie w zbiornikach o pojemności 42 litrów 3 razy w ciągu 24 godzin. System dla dorosłych jest codziennie monitorowany poprzez kontrolę wzrokową i automatyczne odczyty temperatury, pH i przewodności z sond. Optymalne pH wynosi około 7,4 i może wynosić od 6,8 do 7,5, temperatura podstawowa systemu wynosi 72/73 °F, a idealna przewodność mieści się w zakresie 600-800 mS. Automatyczne odczyty są wyświetlane na ekranie sterownika, a wizualne kontrole ciśnienia wody są odczytywane na przepływomierzach rozmieszczonych w całym systemie. Niezależne kontrole jakości wody są przeprowadzane co tydzień, badając temperaturę i mierząc parametry jakości wody pod kątem pH, amoniaku i azotanów za pomocą testu kolorymetrycznego. Poziomy amoniaku i azotanów są utrzymywane na poziomie zerowym lub bliskim zeru poprzez dodanie do systemu pożytecznych bakterii (np. Nutafin Cycle). Oświetlenie pomieszczenia sterowane jest za pomocą timera dostosowanego do 14-godzinnych okresów światła i 10-godzinnej ciemności. Oprócz wymienionych powyżej ogólnych parametrów jakości wody, podczas tygodnia lęgowego należy zwrócić szczególną uwagę na następujące kwestie.
Pierwszą kwestią jest fotoperiod, ponieważ ryby (nawet jaskiniowe w laboratorium) polegają na cyklach światła, aby ustawić swój zegar dobowy. Rytmy okołodobowe mogą wpływać na wszystko, od hodowli i żywienia po zdrowie układu odpornościowego12,13 i muszą być spójne, aby uzyskać maksymalne korzyści zdrowotne. Ryby są utrzymywane w systemie bieżącej wody w 14-godzinnym świetle i 10-godzinnym ciemnym fotoperiodzie. Ryby powierzchniowe zazwyczaj rozpoczynają tarło godzinę po zaciemnieniu systemu, a światło wprowadzone w tym okresie może zakłócać i przerywać tarło. Tarło ślepych ryb jaskiniowych jest mniej zakłócane przez światło. W porównaniu z tarłem ryb powierzchniowych, tarło ryb jaskiniowych jest opóźnione, zwykle rozpoczyna się od czterech do pięciu godzin po zaciemnieniu systemu.
Drugą kwestią jest odżywianie. Dorosłe ryby są zwykle karmione dietą składającą się z płatków tetra raz dziennie. Przed tarłem ryby są karmione dietą bogatą w białko, uzupełnioną dodatkowymi ilościami płatków tetra i innym pokarmem: płatkami żółtek jaj i czasami żywymi czarnymi robakami kalifornijskimi (Lumbriculus variegatus), aby zrekompensować utratę białka spowodowaną produkcją jaj podczas poprzedniego cyklu tarłowego. W tygodniu lęgowym ryby są karmione dwa razy dziennie, raz rano i ponownie po południu/wieczorem. Należy unikać karmienia ryb tylko raz dziennie, ale z jedną bardzo dużą porcją pokarmu, ponieważ może to spowodować niedożywienie14.
Trzecią kwestią jest przestrzeń. Wymagania przestrzenne opierają się na średniej masie ciała osoby dorosłej, a także na względach behawioralnych, takich jak to, czy ryby zachowują się ławicy, czy agresywnie. Zbyt duże lub zbyt małe zatłoczenie zbiorników może prowadzić do zwiększonej agresji i ciągłego stresu, sprawiając, że ryby są podatne na obrażenia od swoich kolegów z akwarium i niechętnie uczestniczą w tarle15. Zazwyczaj trzymamy 10-20 ryb w zbiorniku o pojemności 42 litrów.
Czwartą kwestią jest temperatura. Jak wspomniano powyżej, ryby są zwierzętami zmiennocieplnymi i polegają na środowisku w celu utrzymania temperatury ciała. Ponieważ temperatura ma bezpośredni wpływ na procesy metaboliczne, zmiany temperatury mogą powodować zmiany w zachowaniu ryb16. Ten program hodowlany składa się z dwutygodniowych cykli temperatury: w pierwszym tygodniu następuje skok temperatury do 78 °F, a w następnym tygodniu utrzymuje się statyczna temperatura 72 °F. W pierwszym tygodniu (lęgowym) każdego wieczoru na dnie zbiorników umieszczane są siatki hodowlane z plastikowymi brzegami. Sieci hodowlane służą jako bariera między rybami w zbiornikach a ikrą tarłową, która w przeciwnym razie zostałaby skonsumowana. Temperatura wzrasta o 2 °F dziennie do maksimum 78 °F w połowie tygodnia, a tarło jest indukowane zgodnie z cyklem świetlnym w pierwszych 2-3 wieczorach tego tygodnia. Temperatura jest następnie obniżana o 2 °F do 72 °F w pozostałe dni tygodnia, a temperatura bazowa jest utrzymywana do początku następnego tygodnia lęgowego. Hodowla jest zwykle stymulowana nie częściej niż dwa razy w miesiącu, aby dać rybom czas na regenerację.
Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda pozwala na rozmnażanie dużych ilości embrionów najwyższej jakości przez dłuższy okres czasu.

<table><tbody><tr><td>Blackworms</td><td>Eastern Aquatics, Lancaster, PA</td><td>Brak</td><td></td></tr><tr><td>Siatki hodowlane</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jaja krewetek solankowych</td><td>AquaCave Lake Forest, IL.</td><td>Brak</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów kolorymetrycznych</td><td>Petco</td><td>SKU:11916</td><td>API Zestaw do badania pH słodkowodnego</td></tr><tr><td>Płatki żółtka jaja</td><td>Pentair, Minneapolis, MN</td><td>Brak</td><td></td></tr><tr><td>Miseczki na palce</td><td>Carolina Zaopatrzenie biologiczne</td><td>741004</td><td>Naczynia hodowlane, 4,5 cala, 250 ml</td></tr><tr><td>Siatki ręczne</td><td>Dowolny sklep</td><td></td><td></td>zoologiczny</tr><tr><td>Inkubator dla zarodków</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-029-321HPM</td><td>405 L</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sole morskie</td><td>Spectrum Brands, Blacksburg, VA</td><td>Brak</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20</td><td>5.75 in.</td></tr><tr><td>Roztwór do namaczania siatki</td><td>Dowolny sklep</td><td></td><td></td>zoologiczny</tr><tr><td>Cykl Nutrafin</td><td>Amazon</td><td>Brak</td><td>Wzmocnienie bakteryjne</td></tr><tr><td>Lodówka do karmienia na żywo</td><td>Dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termometr</td><td>Dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetra Tropical Crisps</td><td>Spectrum Brands, Blacksburg, VA</td><td>Brak</td><td></td></tr></tbody></table>

przyrostowe zmiany temperatury dla maksymalnej hodowli i tarła w astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Meksykańska tetra, Astyanax mexicanus, jest nowym modelowym systemem do badań nad rozwojem i ewolucją. Istnienie u tego gatunku morfów powierzchniowych (ryb powierzchniowych) i ślepych jaskiń (ryb jaskiniowych) stwarza okazję do zbadania mechanizmów leżących u podstaw ewolucji morfologicznej i behawioralnej. Ryby jaskiniowe wykształciły nowe cechy konstrukcyjne i regresywne. Konstruktywne zmiany obejmują wzrost kubków smakowych i szczęk, narządów zmysłów linii bocznej i tkanki tłuszczowej. Zmiany regresywne obejmują utratę lub zmniejszenie wzroku. pigmentacja melaniny, zachowania szkolne, agresja i sen. Aby eksperymentalnie zbadać te zmiany, kluczowe jest uzyskanie dużej liczby zarodków, z których powstało ikrę. Odkąd pierwotne ryby powierzchniowe i jaskiniowe A. mexicanus zostały zebrane w Teksasie i Meksyku w latach 90., ich potomkowie byli rutynowo stymulowani do rozmnażania i składania ikry dużej liczby zarodków co dwa miesiące w laboratorium Jeffery'ego. Chociaż hodowla jest kontrolowana przez obfitość i jakość pożywienia, cykle jasne-ciemne i temperaturę, odkryliśmy, że przyrostowe zmiany temperatury odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu maksymalnego tarła. Stopniowy wzrost temperatury z 72 °F do 78 °F w pierwszych trzech dniach tygodnia lęgowego zapewnia dwa-trzy kolejne dni tarła z maksymalną liczbą wysokiej jakości zarodków, po których następuje stopniowy spadek temperatury z 78 °F do 72 °F w ciągu ostatnich trzech dni tygodnia tarłowego. Procedury pokazane w tym filmie przedstawiają przebieg pracy przed i w trakcie tygodnia hodowli laboratoryjnej w celu stopniowego tarła stymulowanego temperaturą.

Zazwyczaj hodujemy i rozmnażamy potomstwo ryb powierzchniowych pierwotnie zebranych z Nacimiento del Rio Choy w San Luis Potosi w Meksyku (ryby powierzchniowe z Rio Choy) i San Solomon Springs w Balmorhea State Park w Teksasie (ryby powierzchniowe z Teksasu), a także ryb jaskiniowych pochodzących z Cueva de El Pachón (ryby jaskiniowe z Pachón) w Tamaulipas w Meksyku oraz Cueva de los Sabinos (ryby jaskiniowe z Los Sabinos) i Sotano de la Tinaja (ryby jaskiniowe z Tinaja) w San Luis Potosi w Meksyku.
<p class="jove_co...

Ten artykuł przedstawia podstawowe warunki laboratoryjne i protokoły dla reżimu przyrostu temperatury w celu stymulowania maksymalnego tarła u meksykańskiej tetra Astyanax mexicanus, która jest nowym modelem do badań rozwojowych i ewolucyjnych.

Przyrostowe zmiany temperatury dla maksymalnej hodowli i tarła w Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...

Tak więc, ponieważ Astyanax mexicanas jest małą rybą. Pochodzi z północno-wschodniego Meksyku i południowego Teksasu. Ważną rzeczą jest to, że istnieje w dwóch formach.Jedna forma to ryba żyjąca na powierzchni, która ma duże oczy i pigmentację, a druga forma to ryba żyjąca w jaskini, która straciła oczy i straciła pigmentację. Nadal są zdolne do tarła, do hybrydyzacji ze sobą, więc można je wykorzystać w analizie genetycznej do badania genetyki i rozwoju. Mają również duże zarodki, które są przezroczyste i mogą być wykorzystywane do badań porównawczej biologii rozwojowej.Są one więc używane od wielu lat jako system do zrozumienia ewolucji rozwoju. Na kilka dni przed pożądanym tarłem zaczynamy lepiej karmić ryby. Zwiększamy również temperaturę stopniowo, tak aby w czasie, w którym chcemy, aby się tarło, przeszły około dwóch lub trzech dni nadmiernego tarła, wytwarzając dużą liczbę zapłodnionych zarodków, które rozwijają się dobrze i przechodzą przez stadia larwalne do dorosłych.Po nakarmieniu ryb o godzinie 10:00 szczyptą płatków Tetra, sprawdź inkubator, który będzie służył do przechowywania misek palcowych rozwijających się zarodków i w razie potrzeby zmień wodę. Sprawdź poziom wody we wszystkich zbiornikach i dodaj wodę systemową do wszystkich zbiorników, w których jest na wyczerpaniu.Następnie ustaw inkubator na 23 stopnie Celsjusza Co najmniej 30 minut po pierwszym karmieniu, nakarm ryby w zbiornikach hodowlanych szczyptą płatków żółtka jaja, wystarczającą ilością skupisk czarnych robaków, aby każda ryba w zbiorniku mogła spożyć około pięciu do 10 robaków lub jedno i drugie. Co najmniej godzinę po drugim karmieniu w razie potrzeby wyszoruj zbiorniki hodowlane i ostrożnie ustaw siatki hodowlane, nie zakłócając dopływu powietrza do zbiornika. Następnego ranka usuń siatki hodowlane z dna zbiorników systemu dla dorosłych między 9:00 a 10:00.i użyj węża dołączonego do urządzenia, aby delikatnie spłukać zarodki do ręcznej siatki. Odwróć siatkę do miski na palec z czystą wodą systemową i przenieś około 100 zarodków na miskę na palec do 200 mililitrów czystej wody systemowej uzupełnionej 0,00003% błękitu metylenowego. Etapuj zarodki pod mikroskopem świetlnym, aby oszacować czas zapłodnienia zgodnie z harmonogramem rozwoju A-mexicanas.Po inscenizacji umieść miseczki paluszkowe w inkubatorze na pięć do siedmiu dni i nakarm kultury żywymi krewetkami solankowymi. Dla każdego zbiornika, w którym upuściły się zarodki, zapisz datę i numer zbiornika oraz zapisz liczbę i jakość upuszczonych zarodków. Zapisać średni czas tarła zgodnie z tabelą postoju i zapisać temperaturę systemu w czasie tarła ryb.Monitoruj miseczki palcowe zarodków przez cały dzień, używając pipety do pastwisk, aby usunąć martwe lub zdeformowane zarodki i zanieczyszczenia, takie jak niezjedzone jedzenie lub kał, i w razie potrzeby zmieniając niebieską wodę. O godzinie 13:00 nakarm ryby w zbiornikach hodowlanych zgodnie z demonstracją i ustaw temperaturę wody na 24 stopnie Celsjusza.Następnie usuń nadmiar jedzenia i zanieczyszczeń ze zbiorników i wyszoruj zbiorniki przed ponownym ustawieniem sieci. W środę i czwartek powtórz pobieranie i ocenę zarodków, jak pokazano we wtorek. Nakarm rybę i ustaw wodę na odpowiednią temperaturę.Sprawdzić zarodki w inkubatorze i zastąpić wodę z miski na palec świeżą wodą systemową uzdatnioną błękitem metylenowym. Następnie w razie potrzeby wyczyść zbiorniki hodowlane i zresetuj siatki. W piątek po nakarmieniu ryb ustaw temperaturę wody na 23 stopnie Celsjusza i sprawdź zarodki w inkubatorze.W soboty i niedziele karm ryby. Na tym rysunku przedstawiono dane hodowlane od lipca 2017 r. do marca 2020 r. dla ryb powierzchniowych Rio Choy i Texas oraz ryb jaskiniowych Los Sabinos, Tinaha i Pakon. Dane analizowano w podziale na tygodnie lęgowe i średnią liczbę zarodków zbieranych dziennie w ciągu jednego tygodnia hodowlanego.Dane wskazują, że rozmnażanie było ciągłe przez cały rok u ryb z Rio Choy i Texas Surface oraz u ryb jaskiniowych Pakon. Ilość i jakość większości ryb powierzchniowych Rio Choy mieściła się między niską a wysoką, podczas gdy ilość i jakość większości ryb powierzchniowych z Teksasu i ryb jaskiniowych Pachon mieściła się między niską a średnią. Występowanie tarła nie było ciągłe u ryb jaskiniowych Tinaja lub Los Sabinos, przy czym tarło było niskie lub nie występowało u tych ryb od późnego lata do jesieni.Chociaż najniższy poziom tarła odnotowano w przypadku ryb jaskiniowych Los Sabinos, jakość zarodków była najlepsza. Ogólnie rzecz biorąc, ta ryba powierzchniowa wykazywała lepszą ilość i jakość tarła niż ryby jaskiniowe. Korzystając z tego systemu, możemy rozmnażać setki, a właściwie tysiące jaj co dwa miesiące, a następnie te jaja są wykorzystywane, te zarodki są następnie wykorzystywane do wielu różnych celów.

incremental-temperature-changes-for-maximal-breeding-spawning

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mutageneza ukierunkowana na geny jest teraz możliwa w szerokim zakresie organizmów przy użyciu technik edycji genomu. W tym miejscu demonstrujemy protokół celowanej mutagenezy genów przy użyciu aktywatora transkrypcji, takiego jak nukleazy efektorowe (TALEN) u Astyanax mexicanus, gatunku ryb, który obejmuje ryby powierzchniowe i jaskiniowe.

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

Opisano szereg podstawowych metod umożliwiających badanie ekologii reprodukcyjnej ryb trzymanych w akwariach. Są to przydatne protokoły do zbierania ryb za pomocą SCUBA, transportu żywych ryb i obserwacji zachowań reprodukcyjnych dziko żyjących ryb trzymanych w akwariach.

Podstawowe metody badania ekologii rozrodu ryb w akwariach

Długoterminowe badania są niezbędne do zrozumienia procesu ewolucji i mechanizmów adaptacji. Ogólnie rzecz biorąc, badania te wymagają zobowiązań wykraczających poza okres życia badaczy. W tym miejscu opisano potężną metodę, która radykalnie przyspiesza najnowocześniejsze gromadzenie danych w celu generowania danych podłużnych w systemach naturalnych.

Wskrzeszenie uśpionej rozwielitki magna: protokół i zastosowania

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

W tym protokole pokazujemy, jak hodować dorosłe osobniki Astyanax mexicanus, hodować larwy i przeprowadzać immunohistochemię na rybach po larwie, aby porównać fenotypy morfotypów powierzchniowych i jaskiniowych.

Hodowla meksykańskiego Tetra Astyanax mexicanus w celu analizy fenotypów postlarwalnych i immunohistochemii całego wierzchowca

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Tutaj prezentujemy metody wysokoprzepustowego badania szeregu zachowań meksykańskich ryb jaskiniowych i istotnego barwienia systemu mechanosensorycznego. Metody te wykorzystują wolne oprogramowanie i niestandardowe skrypty, zapewniając praktyczną i opłacalną metodę badania zachowań.

Śledzenie behawioralne i obrazowanie neuromastu meksykańskich ryb jaskiniowych

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Zapłodnienie in vitro jest powszechnie stosowaną techniką z różnymi organizmami modelowymi do utrzymania populacji laboratoryjnych i produkcji zsynchronizowanych zarodków do dalszych zastosowań. Tutaj przedstawiamy protokół, który implementuje tę technikę dla różnych populacji meksykańskiej ryby tetra, Astyanax mexicanus.

Pobieranie gamet i zapłodnienie in vitro Astyanax mexicanus

Tym celem tego protokołu jest produkcja chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi pochodzącymi z tkanki dawcy zmutowanej, Cas9, przy użyciu technik przeszczepu tkanek embrionalnych.

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Obecny protokół ilustruje użycie dostępnych na rynku komponentów do generowania stabilnego i liniowego gradientu termicznego. Taki gradient można następnie wykorzystać do wyznaczenia górnej granicy termicznej organizmów planktonowych, w szczególności larw bezkręgowców.

Wyznaczanie limitów termicznych dla zooplanktonu za pomocą bloku cieplnego

Poznaj protokół przyrostowych zmian temperatury w celu stymulacji maksymalnego tarła u Astyanax mexicanus. Metoda ta umożliwia uzyskanie dużej liczby przezroczystych zarodków do badań genetycznych i rozwojowych.

Przyrostowe zmiany temperatury dla maksymalnej hodowli i tarła w Astyanax mexicanus

Przeglądaj więcej filmów