Name: Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę analizy śledzenia nanocząstek do pomiaru średnicy hydrodynamicznej nanocząstek złota w roztworach wodnych. Technika ta zapewnia dokładne, niezawodne i powtarzalne wyniki w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z projektu finansowanego w ramach programu H2020: ACEnano (Grant Agreement no 720952). Prace te były również częściowo wspierane przez Międzynarodowy Program Współpracy Badawczo-Rozwojowej finansowany przez Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii Korei (grant nr N053100009, "Horizon2020 Kor-EU collaborative R&BD on ACEnano Toolbox"), który umożliwił udział koreańskich partnerów w konsorcjum projektu ACEnano Horizon 2020.

Metodologia opisana w niniejszym opracowaniu została zastosowana podczas trzeciej rundy porównań międzylaboratoryjnych.
1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przefiltrować wodę przez filtr strzykawkowy 0,02 µm. Filtracja wody jest niezbędna w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń przed jej użyciem do rozcieńczania próbek.</li>
	<li>Aby przeanalizować świeżo przygotowaną próbkę, rozcieńczyć objętościowo próbkę dyspersji koloidu złota 60 nm 50-krotnie w przefiltrowanej wodzie ultraczystej. Sugerowane stężenie do analizy NTA wynosi 1 x 107 – 1 x 109 cząstek na mL.</li>
</ol>
2. Wykonywanie pomiaru
<ol>
	<li>Włączanie systemu
	<ol>
		<li>Podłącz instrument NTA, pompę strzykawkową oraz komputer. Uruchom sprzęt i oprogramowanie. Powiązane oprogramowanie (patrz Tabela materiałów) zapewnia prawidłowy przebieg komunikacji sprzętowej oraz wyświetlanie odczytu temperatury w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Wyjmij moduł laserowy z NTA i używając chusteczki oraz sprężonego powietrza, całkowicie osusz powierzchnie szklane, kanały wewnętrzne celi przepływowej o małej objętości (LVFC), rurki i porty płynowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapełnianie rurek
	<ol>
		<li>Przepłucz rurki wlotowe wodą ultrapure, aby usunąć wszelkie cząstki i zmniejszyć prawdopodobieństwo powstania pęcherzyków powietrza, które mogłyby zakłócić pomiary. Podczas płukania koniec rurki wlotowej wewnątrz obudowy instrumentu umieszcza się w pojemniku na odpady.</li>
		<li>Włóż strzykawkę 1 mL (bez igły) z filtrowaną wodą do portu Luer i przetłocz ~90 µL cieczy przez rurkę wlotową tak szybko, jak pozwala na to ciśnienie wsteczne. Pozostaw strzykawkę z pozostałą cieczą podłączoną, aby zapobiec efektowi syfonowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłączenie rurek pompy strzykawkowej
	<ol>
		<li>Zamontuj LVFC na module laserowym, aby stworzyć komorę próbkową, jak pokazano na Rysunku 1. Podłącz rurkę wylotową do prawego portu LVFC. 
		UWAGA: Rurki wlotowe i wylotowe różnią się średnicą; rurka wlotowa ma mniejszą średnicę niż wylotowa. Zamiana podłączeń rurek wlotowej i wylotowej może spowodować nadmierne zwiększenie ciśnienia w celi przepływowej i wycieki.</li>
		<li>Odłącz strzykawkę od rurki wlotowej i zamień ją na nową strzykawkę zawierającą 1 mL filtrowanej wody, zapewniając kontakt ciecz-ciecz. Podłącz rurkę wlotową do lewego portu LVFC. Powoli wprowadź ~50 µL płynu do komory próbkowaj. Należy zadbać o to, aby podczas ładowania nie wprowadzono pęcherzyków powietrza. Końcowa konfiguracja rurek przedstawiona jest na Rysunku 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Komora elektroforetyczna do rozdziału DNA w zastosowaniach biologii molekularnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zespół komórki przepływowej o małej objętości zamontowany na module laserowym. 
<img alt="Schemat celi przepływowej: Układ celi przepływowej o niskiej objętości z strzykawką, rurką doprowadzającą i odprowadzającą do analizy płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Konfiguracja przewodów celi przepływowej o małej objętości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="4">
	<li>Ładowanie modułu laserowego i kontrola systemu
	<ol>
		<li>Włożyć moduł laserowy z wypełnioną wodą komorą LVFC do urządzenia i zablokować go w odpowiedniej pozycji.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę w uchwycie pompy strzykawkowej i zabezpieczyć. Zainicjować kamerę, klikając Start Camera w interfejsie oprogramowania. W zakładce Hardware interfejsu kliknąć Scatter, aby przesunąć do pozycji referencyjnej.</li>
		<li>Ustawić poziom kamery na 16 i ręcznie wyregulować ostrość, aby sprawdzić rozcieńczalnik pod kątem obecności cząsteczek. Dostosować pozycję pola widzenia, klikając lewym przyciskiem myszy w głównym oknie podglądu i przeciągając myszą w górę i w dół, aby sprawdzić obecność cząsteczek. Jeśli w polu widzenia znajduje się więcej niż trzy cząsteczki, oznacza to problem z czystością wody lub procesem czyszczenia, w związku z czym proces czyszczenia należy powtórzyć, a wodę wymienić lub przefiltrować.</li>
		<li>Wyjąć moduł laserowy z urządzenia.</li>
		<li>Odłączyć strzykawkę od rurki wlotowej i zastąpić ją strzykawką wypełnioną wyłącznie powietrzem. Powoli wprowadzać powietrze do komory próbki, aby usunąć znajdujący się wewnątrz płyn. Wyjąć LVFC z modułu laserowego i odłączyć rurki. Oczyścić szklane powierzchnie LVFC oraz szkło optyczne modułu laserowego wodą i osuszyć chusteczką oraz sprężonym powietrzem. Osuszyć rurki sprężonym powietrzem. Ponownie zamontować LVFC na module laserowym i podłączyć rurki, przygotowując układ do ładowania próbki. 
		UWAGA: Ten krok nie zawsze jest wymagany, jednak w tym przypadku został dodany jako dodatkowa ostrożność, aby dalej zredukować wszelkie możliwe różnice.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie próbki
	<ol>
		<li>Powtórzyć krok 2.2.2. Do portu Luer podłączyć strzykawkę zawierającą 1 mL dyspersji nanocząsteczek złota o rozmiarze 60 nm przygotowanej w kroku 1.1. Powoli wstrzyknąć 750 µL próbki do LVFC poprzez rurkę wlotową, obserwując moduł laserowy poza urządzeniem, aby upewnić się, że nie wprowadzono pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Włożyć moduł laserowy z powrotem do urządzenia NTA i zainicjować kamerę, klikając Start Camera w interfejsie oprogramowania. W zakładce Hardware interfejsu kliknąć Scatter, aby przejść do referencyjnej pozycji ostrzenia i sprawdzić, czy jest ona ustawiona prawidłowo, zapewniając wyraźny obraz cząsteczek.</li>
		<li>Sprawdzić, czy pole widzenia jest ustawione centralnie względem pozycji wiązki lasera. Dostosować je, klikając lewym przyciskiem myszy w głównym oknie podglądu w oprogramowaniu i przeciągając myszą w górę i w dół.</li>
		<li>Uruchomić funkcję AutoSetup, aby automatycznie zoptymalizować ostrość i poziom kamery, zapewniając uzyskanie optymalnej jakości obrazu. 
		UWAGA: Automatyczne parametry kamery i ostrości pozwalają na większą spójność między różnymi laboratoriami, ponieważ są one niezależne od użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza próbki
	<ol>
		<li>Utworzyć skrypt pomiarowy w Standard measurement, zakładka SOP, aby uzyskać 5 powtórzeń nagrań wideo po 60 s przy wolnym (cząsteczki powinny przemieszczać się z jednej strony ekranu na drugą w około 10 s) i stałym przepływie (Supplementary File 1). 
		UWAGA: Zaleca się stosowanie przepływu, aby zapewnić lepszą reprezentację całej próbki do pomiaru. Precyzja i powtarzalność pomiarów stężenia ulegają znacznej poprawie, gdy próbce nadaje się powolny przepływ, co zapewnia, że przez strefę pomiarową przepływa i jest analizowana większa liczba nowych cząsteczek podczas eksperymentu. Długość wideo zależy od rozkładu profilu i jego zmienności w czasie analizy. 5 filmów po 60 s uznaje się za typowy czas pomiaru.</li>
		<li>Ustawić nazwę pliku eksperymentu i lokalizację danych, a następnie rozpocząć pomiar. Analiza zgodnie z opisaną procedurą została przeprowadzona przez siedem laboratoriów projektu Horizon 2020 ACEnano17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
UWAGA: Wszystkie analizy danych zostały przeprowadzone w oprogramowaniu v 3.4 (patrz Tabela materiałów), nie zastosowano dodatkowych ręcznych konwersji ani obliczeń. Dane dotyczące wielkości cząstek są przedstawione w formie surowej jako histogram rozkładu i są obliczane na podstawie zmierzonej zmiany pozycji cząstki przy użyciu równania Stokesa-Einsteina. Oprogramowanie określa średnią odległość, jaką przemieściła każda cząstka w płaszczyznach x i y. Wartość ta pozwala na wyznaczenie współczynnika dyfuzji cząstek (D), z którego – przy znanej temperaturze próbki T i lepkości rozpuszczalnika η – można obliczyć równoważny sferyczny hydrodynamiczny promień, RH, cząstek. Temperatura próbki jest automatycznie rejestrowana przez NTA. Domyślna lepkość próbki używana przez oprogramowanie dotyczy wody i jest zawarta w powyższym skrypcie pomiarowym, choć lepkość może zostać zmieniona przez użytkownika w przypadku zastosowania innych rozcieńczalników próbek,either przed lub po wykonaniu pomiaru.
<ol>
	<li>Ustaw próg detekcji (DT), przeciągając pasek suwaka lub klikając przyciski + i - w oprogramowaniu w sekcji Detection Threshold. Jest to parametr analizy służący do optymalnego śledzenia wizualizowanych cząstek, którego wartość powinna mieścić się w zakresie od 2 do 20. Upewnij się, że wybrana wartość DT pozwala na identyfikację i śledzenie jak największej liczby widocznych cząstek (automatycznie zaznaczonych czerwonymi krzyżykami na ekranie obrazu w oprogramowaniu).
	<ol>
		<li>W ramach wytycznych dotyczących ustawiania progu detekcji, liczba zidentyfikowanych cząstek na obrazie powinna wynosić około 30-80, przy czym nie więcej niż 10 czerwonych krzyżyków powinno odpowiadać miejscaom, które obserwator nie uzna za cząstki. Nie powinno być widocznych więcej niż 5 niebieskich krzyżyków (wskazujących na szum).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Wykres rozkładu wielkości cząstek; stężenie w funkcji średnicy; wyniki analizy nanotechnologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obserwacje dotyczące ustawiania progu. Obserwacja błędnego (po lewej) oraz prawidłowego (po prawej) ustawienia progu detekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="2">
	<li>Automatycznie przetwórz filmy z analizy śledzenia cząstek, klikając przycisk Process w oprogramowaniu. Pozostaw wszystkie parametry przetwarzania w trybie automatycznym i wyeksportuj dane do pliku wyników w formacie .csv, zawierającego pełny rozkład wielkości cząstek oraz dodatkowe metadane opisujące konfigurację pomiaru. Aby zweryfikować jakość pomiaru, przejdź do karty Analyze w oprogramowaniu lub sprawdź w wyeksportowanym pliku .csv, czy nie pojawiły się żadne komunikaty ostrzegawcze lub alerty. Przykład raportu z wynikami w formacie PDF przedstawiono w Supplementary File 2.</li>
	<li>Odczytaj wyniki rozmiaru dominującego (mode size) oraz powiązaną z nimi odchylenie standardowe z raportu PDF. 
	UWAGA: Wyniki rozmiaru dominującego zostały wykorzystane do porównania wielkości uzyskanych w siedmiu laboratoriach; są one przedstawione i omówione w Sekcji 5.</li>
</ol>
4. Czyszczenie i suszenie
<ol>
	<li>Po zakończeniu pracy dokładnie wypłucz system czystą wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości próbki z przewodów i powierzchni optycznych. Efektywność czyszczenia można monitorować, obserwując ilość cząsteczek w polu widzenia.</li>
	<li>Wyjmij moduł laserowy z urządzenia NTA.</li>
	<li>Przepuść przez system powietrze za pomocą strzykawki, aby opróżnić przewody oraz LVFC.</li>
</ol>

<ol><li>Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxidative+toxicity+of+Ag+and+ZnO+nanoparticles+towards+the+aquatic+plant+Spirodela+punctuta+and+the+role+of+testing+media+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science-Processes+and+Impacts%22%5BJournal%5D)">The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters.</a> Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).</li>
<li>Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformations+of+nanomaterials+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Transformations of nanomaterials in the environment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).</li>
<li>Auffan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+definition+of+inorganic+nanoparticles+from+an+environmental%2C+health+and+safety+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective.</a> Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).</li>
<li>Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+safe+are+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How safe are nanomaterials.</a> Science. 350 (6259), 388-389 (2015).</li>
<li>Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+impacts+of+polyvinylpyrrolidone+%28PVP%29+capped+metal+oxide+nanoparticles+on+Daphnia+magna%3A+role+of+core+composition+and+acquired+corona%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).</li>
<li>Hassellöv, M. aR. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHassell%C3%B6v%2C+MaRK+%22Analysis+and+Characterization+of+Manufactured+Nanoparticles+in+Aquatic+Environments.+Environmental+and+Human+Health+Impacts+of+Nanotechnology%22">Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 211-266 (2009).</li>
<li>Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+known+and+unknown+health+risks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and known and unknown health risks.</a> Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12(2004).</li>
<li>Briffa, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+transformations+of+manufactured+nanomaterials+as+a+proposed+proxy+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).</li>
<li>European Commission. Nanotechnology. European Commission. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ec.europa.eu/nanotechnology/policies_en.html">http://ec.europa.eu/nanotechnology/policies_en.html</a> (2011).</li>
<li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271(2017).</li>
<li>Dynamic Light Scattering - common terms defined. Malvern. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.malvern.com/en/support/resource-center/Whitepapers/WP111214DLSTermsDefined.aspx">http://www.malvern.com/en/support/resource-center/Whitepapers/WP111214DLSTermsDefined.aspx</a> (2015).</li>
<li>Walker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nano-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Improved nano-particle tracking analysis.</a> Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605(2012).</li>
<li>Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx">https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx</a> (2019).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li>
<li>Roebben, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+size+and+surface+charge+measurements+on+nanoparticles+prior+to+biological+impact+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment.</a> Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675(2011).</li>
<li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%3A+An+Interdisciplinary+Forum+for+Nanoscale+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101(2013).</li>
<li>Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cordis.europa.ue/project/id/720952">https://cordis.europa.ue/project/id/720952</a> (2019).</li>
<li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoille%2C+P+%22Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations%22">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations</a>. 1360, VC, SPIE (1990).</li>
</ol>

Autorka Jo Sullivan, Agnieszka Siupa, Pauline Carnell-Morris i Michele Carboni są pracownikami firmy Malvern Panalytical Ltd., która produkuje instrumenty użyte w tym artykule.

Niespójne wyniki uzyskane w ramach rundy 1 ILC uwypukliły potrzebę kontroli stanu urządzeń w przypadku starszych systemów, a także opracowania bardziej szczegółowych standardowych procedur operacyjnych, potrzebę praktycznego szkolenia oraz lepszego zrozumienia ustawień pomiarów i analizy, aby zapewnić bardziej spójne wyniki w różnych laboratoriach. W rzeczywistości Hole i in. stwierdzili, że brak wspólnych wytycznych dotyczących korzystania z systemu NTA i przygotowywania próbek skutkował zmiennością między laboratoriami, nawet w przypadku próbek stosunkowo monorozproszonych16. W związku z tym wszyscy uczestnicy ILC wzięli udział w warsztatach szkoleniowych obejmujących najlepsze praktyki dotyczące warunków działania systemu i pomiarów, a także wskazówki dotyczące czyszczenia i konserwacji konkretnego instrumentu NTA. Wszyscy uczestnicy wykonywali również pomiary na tym samym instrumencie we własnych laboratoriach na potrzeby kolejnych rund ILC. Procedura obejmowała najpierw rundę, w której przetestowano system lokalnie w każdym laboratorium, przeprowadzając ILC na standardowych próbkach lateksu (ILC Runda 2), a następnie wykorzystano go przez partnerów do powtórzenia pomiarów złota (ILC Runda 3). Celem pomiaru tych próbek złota za pomocą NTA było wprowadzenie pewności i jasności do metod i praktyk oceny ryzyka związanego z nanomateriałami, które są niezbędne do wywarcia wpływu na protokoły wytycznych dotyczących nanobezpieczeństwa.
NTA to technika, która może mierzyć hydrodynamiczną sferyczną równoważną średnicę cząstek i może być stosowana do analizy wizualnej cząstka po cząstce w czasie rzeczywistym układów polirozproszonych w zakresie od 10 nm do 50 nm do około 1000 nm (w zależności od właściwości próbki i konfiguracji urządzenia). Wymagane jest minimalne przygotowanie próbki. Pomimo minimalnego przygotowania próbki, ten krok ma kluczowe znaczenie dla protokołu i należy zachować dużą ostrożność podczas rozcieńczania próbki i wyboru rozcieńczalnika. Kształt może być czynnikiem ograniczającym w odniesieniu do NTA, ponieważ uzyskuje się pomiary równoważnej wielkości sferycznej, a cząstki niesferyczne będą miały mniej dokładną wartość rozmiaru.
W przypadku technologii NTA zawsze należy spodziewać się pewnych zmian w wynikach, ponieważ z całej próbki obserwuje się tylko reprezentatywną próbkę. Niezależnie od tego, wszystkie wyniki są zgodne z normą ISO 19430 dotyczącą wymiarowania cząstek. Optymalne stężenie, które należy zapewnić, wynosi zwykle około 10-8 cząstek/ml w czasie analizy 30-60 sekund. W przypadku próbek o niższych stężeniach cząstek wymagany będzie dłuższy czas analizy, aby zapewnić powtarzalne wyniki. W przypadku próbek zawierających cząstki o stężeniu większym niż 109 cząstek/ml istnieje większe prawdopodobieństwo wystąpienia problemów ze śledzeniem, a próbki będą musiały zostać rozcieńczone do odpowiedniego zakresu do pomiaru NTA.
Ogólnie rzecz biorąc, wyniki 3. rundy ILC wskazują na dobrą odtwarzalność pomiarów nanocząstek złota za pomocą NTA ze zwiększoną dokładnością i powtarzalnością. Wszystkie pomiary NTA zostały przeprowadzone przy użyciu automatycznych ustawień poziomu kamery i ostrości w celu dostosowania obrazu, zgodnie z wyborem funkcji Auto-Setup w oprogramowaniu. Poziom kamery ustawiony przez oprogramowanie był bardzo spójny, przy czym poziom kamery 10 lub 11 był ustawiany we wszystkich przypadkach, co pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami, im więcej automatyzacji obejmuje proces, tym większa spójność jest osiągana. Wyniki wymiarowania były porównywalne z wynikami uzyskanymi przez producenta za pomocą TEM, co wskazuje, że wyniki były odtwarzalne, jednak należy oczekiwać minimalnych różnic w przypadku różnych technik, ponieważ TEM nie określa średnicy hydrodynamicznej. Znaczna poprawa spójności wyników pokazuje znaczenie i korzyści płynące z konserwacji urządzeń, szczegółowych procedur SOP, aktualizacji najlepszych praktyk, wiedzy użytkowników i stosowanej automatyzacji pomiarów dla NTA. Podsumowując, Komisja Zarządzania Iloką zatwierdziła tę konkretną standardową procedurę operacyjną NTA, a tym samym wprowadziła pewność i jasność do tej konkretnej metody oceny ryzyka związanego z nanomateriałami.

Nanomateriały (NMs) mogą różnić się zarówno pod względem fizycznym, jak i chemicznym, co z kolei wpływa na ich zachowanie, stabilność i toksyczność1,2,3,4,5. Jedną z głównych trudności w dokładnym zrozumieniu właściwości, zagrożeń i zachowań nanomateriałów jest możliwość uzyskania powtarzalnych informacji o fizycznych i chemicznych właściwościach nanomateriałów. Przykładami takich właściwości fizycznych są wielkość cząstek i rozkład wielkości6,7,8. Są to ważne parametry, ponieważ stanowią one kluczowy aspekt definicji terminu "nano" przyjętej przez Komisję Europejską (KE) 9.
Osiągnięcie precyzyjnych pomiarów wielkości cząstek jest również kluczowe dla wielu różnych zastosowań i procesów przemysłowych i badawczych, oprócz zrozumienia wpływu NMs na los i toksyczność6,10. Ważne jest, aby dysponować dobrze ugruntowanymi metodami umożliwiającymi dokładny, niezawodny i powtarzalny pomiar wielkości nanometrów. Ponadto zgłaszane informacje powinny zapewnić dogłębne zrozumienie zastosowanej techniki, np. wskazywać rodzaj parametru wielkości (np. rozmiar rzeczywisty lub rozmiar hydrodynamiczny), a także warunki próbki, np. konkretne medium, w którym obecny jest NM, oraz aby metoda działała niezawodnie w różnych mediach. W celu pomiaru wielkości można zastosować szereg technik, w tym mikroskopię elektronową (EM), dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (spICP-MS), różnicową sedymentację odśrodkową (DCS), mikroskopię z sondą skaningową (SPM), rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS) i analizę śledzenia nanocząstek (NTA).
NTA to stosunkowo nowa technologia, która w ostatnich latach została znacznie zaawansowana i wykazano, że niezawodnie mierzy hydrodynamiczną średnicę sferycznych NM w złożonych ośrodkach wodnych, takich jak te mające znaczenie dla środowiska, np. systemy słodkowodne. Średnica hydrodynamiczna to 'rozmiar hipotetycznej twardej kuli, która dyfunduje w taki sam sposób, jak cząstka mierzona'11; W praktyce i w ośrodkach wodnych opisuje to średnicę większą niż średnica samej cząstki, która obejmuje również warstwę cząsteczek (głównie wody) utrzymywanych na powierzchni cząstki przez słabe siły elektrostatyczne. Średnica hydrodynamiczna cząstki będzie się różnić w różnych ośrodkach, zmniejszając się wraz ze wzrostem siły jonowej ośrodka, w którym jest mierzona.
Dodatkową ważną cechą techniki NTA jest to, że pozwala ona analitykowi na uzyskanie pomiarów wielkości ważonych liczbami, które są wymagane w kontekście definicji nanomateriału EC. Analiza cząstka po cząsteczce o wysokiej rozdzielczości sprawia, że technika ta jest mniej podatna na zakłócenia powodowane przez aglomeraty lub większe cząstki, gdy są obecne w niejednorodnej próbce testowej o dużej przepustowości cząstek10,12.
Procedura pomiarowa polega na przygotowaniu odpowiedniej zawiesiny próbki, co często wymaga rozcieńczenia próbki, a następnie nagraniu wideo zachowania ruchów Browna i analizie wideo. Z komory na próbkę przepuszczana jest wiązka laserowa, a cząstki zawiesiny znajdujące się na drodze wiązki laserowej rozpraszają światło, prowadząc do ich wizualizacji za pomocą mikroskopu optycznego z zamontowaną kamerą. Kamera rejestruje plik wideo rozproszonego światła laserowego od cząstek poruszających się pod wpływem ruchu Browna. Wiele cząstek można śledzić indywidualnie w celu określenia ich współczynników dyfuzji, a ich średnice hydrodynamiczne można obliczyć za pomocą równania Stokesa-Einsteina: d = kT/3πηD, gdzie d jest średnicą hydrodynamiczną, k jest stałą Boltzmanna, T to temperatura, η to lepkość, a D to współczynnik dyfuzji10. NTA może być również używany do śledzenia zachowania agregacji cząstek, które są ogólnie niestabilne koloidalnie (cząstki muszą być jednak stabilne koloidalnie w skali czasu pomiaru)13,14. NTA jest metodą absolutną i nie jest wymagana kalibracja systemu na przyrządzie używanym w tej pracy. Jeśli użytkownicy chcą sprawdzić wydajność systemu, można to łatwo zrobić, mierząc rozmiar standardowych materiałów tak często, jak jest to pożądane.
Instrument NTA jest łatwy w obsłudze z szybkim czasem analizy (poniżej 10 minut na próbkę). Aby uzyskać wysoką jakość pomiarów z dobrą powtarzalnością i odtwarzalnością danych, zarówno podczas przygotowywania próbek, jak i obsługi urządzenia, należy wziąć pod uwagę szereg czynników. Jeśli takie czynniki nie zostaną dokładnie uwzględnione, pomiary na tym samym materiale w różnych laboratoriach i u różnych operatorów mogą być obarczone nieznanymi lub słabo określonymi ilościowo niepewnościami. Podczas charakteryzowania NP stosowanie najlepszych praktyk opracowanych przez nas SOP nie zawsze gwarantuje spójność z innymi laboratoriami, jak wykazano przez Roebbena i in. dla techniki DLS15.
W rzeczywistości, wczesna (pierwsza runda) NTA ILC pomiędzy różnymi laboratoriami, użytkownikami i instrumentami ujawniła niespójne wyniki. Jednym z głównych problemów było korzystanie z różnych starszych, starszych przyrządów, które nie były regularnie serwisowane ani nie były poddawane kontrolom kalibracji, a także różnice w interpretacji metod. Badanie NTA ILC przeprowadzone przez Hole i wsp. wykazało, że przy braku wspólnych wytycznych dotyczących korzystania z systemu i przygotowywania próbek, zmienność między laboratoriami może być duża nawet w przypadku próbek stosunkowo monorozproszonych16. To, wraz z wynikami pierwszej rundy ILC, podkreśla potrzebę dobrej konserwacji urządzeń, a także szkolenia w zakresie metod i dobrze opracowanych standardowych procedur operacyjnych (SOP). Te ostatnie działają jako potężne narzędzie do opisywania i dokumentowania zgodności z dobrymi praktykami. Standardowe procedury operacyjne (SOP), jeśli są bardzo szczegółowe, mogą zapewnić jasność, wyjaśnienie, zrozumienie, standaryzację i zapewnienie jakości.
Rekomendacja dotycząca przyjęcia badania ILC jest zatem idealna zarówno do opracowywania, jak i testowania protokołów16. Ćwiczenie w ramach systemu ILC miało na celu walidację tej konkretnej procedury operacyjnej NTA, a tym samym wprowadziło zaufanie i jasność do tej konkretnej metody oceny ryzyka związanego z nanomateriałami. Składał się on z trzech rund. Runda 1 polegała na analizie nanocząsteczek złota o długości 60 nm na własnych instrumentach każdego uczestnika przed treningiem. Runda 2 polegała na analizie lateksu 100 nm przy użyciu nowego instrumentu o wspólnej konfiguracji jako prostego testu w celu ustalenia, czy instrument został prawidłowo skonfigurowany, a użytkownicy mają dobrą wiedzę na temat korzystania z instrumentu. Runda 3 obejmowała analizę nanocząstek złota o długości fali 60 nm na nowym instrumencie o wspólnej konfiguracji, po przeszkoleniu. Uczestnicy ILC pochodzili z siedmiu różnych laboratoriów, a wszyscy byli członkami konsorcjum projektu ACEnano w ramach programu Horyzont 202017.
Celem tego artykułu jest omówienie metody i wyników trzeciej rundy testów porównawczych dla technologii NTA, gdzie 60 nm złotych nanocząsteczek zostały ponownie przeanalizowane przez siedmiu partnerów po szczegółowym szkoleniu i opracowaniu SOP. Dokonane zostanie również porównanie i odniesienie się do wyników uzyskanych w pierwszej rundzie ILC. Wszystkie analizy od rundy 3 ILC zostały przeprowadzone przy użyciu tego samego przyrządu (patrz tabela materiałów) o identycznej konfiguracji, wyposażonego w laser 405 nm i kamerę sCMOS o wysokiej czułości. Analiza porównawcza polega na ocenie wydajności technologii na próbkach, a tym samym prowadzi do opracowania protokołów "najlepszych praktyk". W związku z tym w niniejszym artykule udostępniono również metodę NTA dla instrumentu stosowanego w tym systemie ILC i udostępnia go społeczności naukowej, ponieważ została ona zharmonizowana poprzez przeprowadzenie i ocenę ILC zgodnie z międzynarodowymi standardami.

<table><tbody><tr><td>Dyspersja koloidowa złota 60 nm</td><td>BBI Solutions OEM Ltd.</td><td>Produkt EM. GC60, Numer serii 024650</td><td></td></tr><tr><td>0,02 &micro; m filtr strzykawkowy - Sterylne filtry strzykawkowe Whatman Anotop 25</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA68092102</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight</td><td>Malvern Panalytical Ltd.</td><td>Oprogramowanie NS300</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA v3.4</td><td>Malvern Panalytical Ltd.</td><td>v3.4</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka PP/PE bez końcówki ślizgowej luer igły, wyśrodkowana, pojemność 1&nbsp; ml, z podziałką, 0,01&nbsp; ml, sterylne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z230723</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

W dziedzinie nanotechnologii, charakterystyka analityczna odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu zachowania i toksyczności nanomateriałów (NM). Charakterystyka musi być dokładna, a wybrana technika powinna być dobrze dopasowana do właściwości, która ma być określona, analizowanego materiału i ośrodka, w którym jest obecny. Ponadto działanie i metodologia przyrządu muszą być dobrze opracowane i jasno zrozumiałe dla użytkownika, aby uniknąć błędów w gromadzeniu danych. Wszelkie rozbieżności w zastosowanej metodzie lub procedurze mogą prowadzić do różnic i słabej odtwarzalności uzyskanych danych. Niniejszy artykuł ma na celu wyjaśnienie metody pomiaru średnicy hydrodynamicznej nanocząstek złota za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Badanie to zostało przeprowadzone jako porównanie międzylaboratoryjne (ILC) między siedmioma różnymi laboratoriami w celu walidacji wydajności i odtwarzalności standardowej procedury operacyjnej. Wyniki uzyskane w tym badaniu ILC ujawniają znaczenie i korzyści płynące ze szczegółowych standardowych procedur operacyjnych (SOP), aktualizacji najlepszych praktyk, wiedzy użytkowników i automatyzacji pomiarów.

Wyniki pierwszej rundy (Round 1) ILC z wykorzystaniem różnych konfiguracji aparatury NTA przedstawiono na Rysunku 4. Z wyjątkiem Laboratorium 6, powtarzalność między 5 powtórzeniami pomiaru była dobra, jednak w kilku laboratoriach odnotowano rozmiar modowy wyższy od oczekiwanego. Wyniki Laboratorium 6 wykazały słabą powtarzalność oraz znacznie wyższy zmierzony rozmiar modowy. Po przeprowadzeniu dochodzenia ustalono, że systemy wykazujące największe różnice w rozmiarach były albo niekonserwowane zgodnie z zaleceniami, albo analiza została zaburzona przez niespójność w przygotowaniu próbek, gdzie etap rozcieńczania mógł spowodować zmienność wynikającą z zastosowania innego sprzętu do pipetowania, sposobu pracy i techniki użytkownika oraz/lub konfiguracji pomiaru, w tym zanieczyszczenia celi przepływowej, użycia niewłaściwego poziomu kamery, nieprawidłowego ustawienia ostrości obrazu lub błędnego ustawienia progu detekcji (Detection Threshold) podczas analizy.
<img alt="Wykres pudełkowy analizy danych dotyczących rozmiaru mody (nm), porównujący laboratoria i urządzenia, wyniki statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki pomiarów rozmiaru trybu w 1. rundzie ILC. Wyniki rozmiaru mody od wszystkich partnerów benchmarkingu NTA dla 1. rundy dyspersji nanocząsteczek złota o rozmiarze 60 nm, przeprowadzonej na różnych instrumentach NTA (oznaczonych skrótami na osi X). 
Dokładność wyników NTA z rundy 3 uległa poprawie we wszystkich laboratoriach wdrażających tę samą SOP oraz ustawienia instrumentu. Wyniki rozmiaru modowego uzyskane w tej rundzie 3 ILC przedstawiono na rysunku 5. Średnia moda we wszystkich laboratoriach wyniosła 62,02 ± 1,97 nm. Wszystkie wyniki pomiarów z rundy 3 były bardziej spójne niż wyniki z pierwszego etapu, a uzyskane wartości mieściły się w granicach 10% średniego rozmiaru partii wynoszącego 60,5 nm, zgodnie z deklaracją producenta. Współczynnik zmienności dla próbek złota podany przez producenta wynosił ≤8%.
<img alt="Wykres pudełkowy rozmiaru modalnego (nm) w podziale na numery laboratoriów, wykres zmienności statystycznej, przedstawiający próg 60 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wyniki rozmiaru mody z 3. rundy ILC. Wyniki rozmiaru modu z wszystkich laboratoriów partnerskich biorących udział w walidacji NTA dla 60 nm złotych cząstek ILC w 3. rundzie, analizowanych na tym samym urządzeniu NTA. Średnia wartość modu we wszystkich laboratoriach wyniosła 62,02 ± 1,97 nm. 
Aby zweryfikować rozmiar cząsteczek podany przez producenta, niewielką liczbę (N=82) cząsteczek poddano analizie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Około 10 µl nierozcieńczonej dyspersji naniesiono metodą drop-casting na miedzianą siatkę TEM powleczoną węglem i wysuszono na powietrzu przed obrazowaniem w analitycznym TEM przy napięciu 20 kV. Zdjęcia, takie jak Rycina uzupełniająca 1, wykonano w obszarach z minimalnym nakładaniem się cząsteczek, a następnie poddano je półautomatycznej analizie obrazu. Zastosowano automatyczną metodę watershed w celu rozdzielenia cząsteczek; artefakty powstałe w tym procesie oraz cząsteczki znajdujące się na krawędziach zostały wykluczone z analizy18. Średnicę średnią obliczono albo jako średnią z osi głównej i pomocniczej (61 ± 7 nm), albo poprzez przeliczenie zmierzonej powierzchni (62 ± 6 nm), zakładając sferyczny kształt cząsteczek. Cząsteczki wydają się być w większości sferyczne, przy średnim stosunku wymiarów (aspect ratio) wynoszącym 1,1. Wyniki TEM wskazują na nieco większą średnicę niż wartość podana przez producenta (60,5 nm), jednak mieszczą się one w granicach tolerancji. Ponadto odnotowano bardzo dobrą zgodność z wartością średnicy hydrodynamicznej wyznaczoną metodą NTA.
Rysunek uzupełniający 1: Obraz TEM nanocząsteczek złota o rozmiarze 60 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>
Plik uzupełniający 1: Skrypt pomiarowy. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/Measurement_script.docx" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 2: Przykład raportu z wynikami w formacie PDF. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/PDF_results_report.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisany tutaj protokół ma na celu zmierzenie hydrodynamicznej średnicy sferycznych nanocząstek, a dokładniej nanocząstek złota, w środowisku wodnym za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Ta ostatnia polega na śledzeniu ruchu cząstek spowodowanym ruchami Browna i implementacji równania Stokesa-Einsteina w celu uzyskania średnicy hydrodynamicznej.

Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Protokół ten wykorzystuje analizę śledzenia nanocząstek do wykonywania dokładnych, wiarygodnych i powtarzalnych pomiarów średnic hydrodynamicznych nanomateriałów będących przedmiotem zainteresowania. Metoda jest szybka i łatwa do wykonania, ułatwiając pomiar hydrodynamicznej sferycznej równoważnej średnicy cząstek, poprzez analizę wizualną cząstka po cząstce w czasie rzeczywistym i minimalne przygotowanie próbki. Przed wykonaniem pomiaru należy przefiltrować objętość ultraczystej wody, która ma być użyta do analizy, przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,02 mikrona.Odpowiednio rozcieńczyć próbkę w przefiltrowanej wodzie. W przypadku tej próbki dyspersji złota koloidalnego o długości 60 nanometrów należy rozcieńczyć objętościowo przez współczynnik 50. Podłącz przyrząd NTA, pompę strzykawkową i komputer, a następnie włącz sprzęt i oprogramowanie.Wyjmij moduł laserowy z systemu i użyj chusteczki higienicznej i sprężonego powietrza, aby całkowicie wysuszyć szklane powierzchnie oraz wewnętrzne kanały LVFC, rurki i porty płynów. Umieść LVFC na module laserowym, a następnie zabezpiecz go czterema dokręcającymi je po przekątnej. Podłącz rurkę wylotową do portu po prawej stronie ogniwa.Włóż rurkę dopływową do butelki na odpady i przepłucz 900 mikrolitrów roztworu czyszczącego tak szybko, jak pozwala na to ciśnienie wsteczne. Wymień strzykawkę podłączoną do rurki wlotowej na nową strzykawkę zawierającą jeden mililitr przefiltrowanej wody i podłącz rurkę wlotową do lewego portu komory przepływowej. Następnie powoli wprowadź około 500 mikrolitrów płynu do komory próbki, uważając, aby podczas załadunku nie dostały się pęcherzyki powietrza.Aby załadować moduł laserowy, włóż wypełniony wodą LVFC do przyrządu i zablokuj ogniwo na miejscu. Zabezpiecz strzykawkę i podstawkę pompy strzykawkowej, a następnie kliknij przycisk Start Camera (Uruchom kamerę) w interfejsie oprogramowania, aby zainicjować kamerę. Na karcie sprzętu kliknij opcję Punktowe, aby przesunąć pozycję odniesienia i ustawić poziom kamery na 16.Dostosuj ostrość ręcznie, aby sprawdzić, czy w rozcieńczalniku nie ma żadnych cząstek, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij w głównym oknie view, aby dostosować położenie pola widzenia, aby sprawdzić, czy nie ma żadnych cząstek. Aby wyczyścić system, wymień strzykawkę na strzykawkę pełną tylko powietrza i powoli zastąp wodę w komorze powietrzem. Wyjmij ogniwo z modułu laserowego z przyrządu i odłącz kawałki rurek.Wyczyść szkło optyczne modułu laserowego i szklane powierzchnie LVFC wodą i osusz chusteczką i sprężonym powietrzem. Po ponownym złożeniu LVFC i modułu laserowego oraz zalaniu rurki, podłącz strzykawkę zawierającą jeden mililitr zawiesiny nanocząstek złota o długości 60 nanometrów do dolnego portu i powoli wstrzyknij 750 mikrolitrów próbki do komory LVFC. Po załadowaniu modułu laserowego i zainicjowaniu kamery kliknij przycisk Scatter (Rozproszenie), aby przesunąć ognisko referencyjne do pozycji, potwierdzając, że ostrość jest ustawiona prawidłowo, aby uzyskać wyraźny obraz cząstek.Sprawdź, czy pole view jest ustawione centralnie w stosunku do położenia wiązki laserowej i uruchom funkcję automatycznej konfiguracji, aby automatycznie zoptymalizować ostrość i poziom kamery, aby zapewnić osiągnięcie optymalnej jakości obrazu. Aby przeanalizować próbkę, otwórz zakładkę Standardowa procedura operacyjna pomiaru standardowego i ustaw przyrząd tak, aby rejestrował pięć 60-sekundowych filmów przy powolnym i stałym przepływie. Następnie ustaw nazwę pliku i lokalizację danych i rozpocznij uruchamianie.Aby przeanalizować dane, przeciągnij suwak na karcie Próg wykrywania, aby ustawić próg wykrywania tak, aby wykryć i śledzić jak najwięcej widocznych cząstek. Upewnij się, że nie widać więcej niż pięć niebieskich krzyżyków wskazujących na hałas. Aby automatycznie przetworzyć filmy z analizą śledzenia cząstek, kliknij Ustawienia, OK i pozostaw wszystkie parametry przetwarzania w ustawieniach automatycznych.Po zakończeniu przetwarzania danych wyeksportuj dane jako plik wyników formularza CSV. W tym miejscu przedstawiono wyniki porównań międzylaboratoryjnych w pierwszej rundzie uzyskane przy użyciu różnych konfiguracji przyrządów do analizy śledzenia nanocząstek. Z wyjątkiem laboratorium szóstego, powtarzalność między pięcioma powtórzeniami przechwytywania była dobra, mimo że kilka laboratoriów zarejestrowało większy niż oczekiwano rozmiar trybu.Dokładność wyników analizy śledzenia nanocząstek z trzeciej rundy została poprawiona przez wszystkie laboratoria, które wdrożyły tę samą standardową procedurę operacyjną i ustawienia przyrządów z trybem średnim we wszystkich laboratoriach wynoszącym 62,02 plus minus 1,97 nanometra. Średnią średnicę cząstek można obliczyć za pomocą obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jako technikę uzupełniającą NTA w celu walidacji wielkości cząstek, morfologii i proporcji. W tej analizie cząstki wydają się być w większości kuliste ze średnim współczynnikiem kształtu wynoszącym 1,1.Ważne jest, aby upewnić się, że cela o małym przepływie objętościowym jest dobrze oczyszczona przed użyciem, że próbka jest odpowiednio rozcieńczona, dobrze obciążona i skoncentrowana oraz że przestrzegane są SOP. Metoda ta może być stosowana do dowolnej innej charakterystyki nanocząstek, w tym egzosomów i wirusów, w celu wsparcia badań stabilności i procesów kontroli jakości.

nanoparticle-tracking-analysis-gold-nanoparticles-aqueous-media

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Używamy optycznego śledzenia plazmonicznych nanocząstek do badania i charakteryzowania częstotliwości ruchów organizmów wodnych.

Analiza ruchu naupliusa 'Artemia salina' za pomocą optycznego śledzenia nanocząstek plazmonicznych

Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.

Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

Opisujemy metodę syntezy biokompatybilnych nanocząsteczek złota 10 nm, funkcjonalizowanych przez powlekanie powierzchni glikolu polietylenowego. Cząstki te mogą być wykorzystywane in vitro i in vivo do dostarczania środków terapeutycznych do nanoskalowych przestrzeni komórkowych i zewnątrzkomórkowych, które są trudno dostępne przy konwencjonalnych rozmiarach nanocząstek.

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Tutaj pokazujemy użycie tradycyjnej mikroskopii ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na błonie komórkowej. Lokalizacja i orientacja pojedynczych AuNR są wykrywane za pomocą ImageJ i MATLAB, a stany dyfuzyjne AuNR są charakteryzowane przez analizę śledzenia pojedynczych cząstek.

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Ten protokół opisuje użycie asymetrycznego frakcjonowania przepływu w połączeniu z detekcją UV-vis do określenia wielkości próbki nieznanej próbki nanocząstek złota.

Frakcjonowanie w polu przepływu asymetrycznego do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie

To badanie przedstawia wyniki benchmarkingu dla porównania międzylaboratoryjnego (ILC) mającego na celu przetestowanie standardowej procedury operacyjnej (SOP) opracowanej dla dyspersji koloidowych złota (Au) charakteryzujących się spektroskopią ultrafioletowo-widzialną (UV-Vis), wśród sześciu partnerów z projektu H2020 ACEnano do przygotowania, pomiaru i analizy próbek.

Charakterystyka spektroskopowa UV-VIS nanomateriałów w środowisku wodnym

Pokazujemy, jak używać nowatorskiego instrumentu do analizy śledzenia nanocząstek, aby oszacować rozkład wielkości i całkowite stężenie cząstek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołokomórkowej i ludzkiego osocza.

Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest powszechnie stosowaną metodą do charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. W artykule przedstawiono parametry eksperymentalne i kontrolne NTA oraz jednolitą metodę analizy i charakterystyki próbek i rozcieńczalników niezbędną do uzupełnienia wytycznych zaproponowanych przez MISEV2018 i EV-TRACK w zakresie odtwarzalności między laboratoriami.

Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek

Obecny protokół opisuje technologię znakowania za pomocą klonowalnego mikroskopu elektronowego do wykrywania białek znakowanych metalotioneiną w komórkach za pomocą nowatorskiej techniki syntezy nanocząstek złota opartej na mechanizmie tłumienia autonukleacji.

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Poznaj metodę analizy śledzenia nanocząstek do pomiaru średnicy hydrodynamicznej nanocząstek złota w roztworach wodnych. Technika ta zapewnia dokładne, niezawodne i powtarzalne wyniki w czasie rzeczywistym.

Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

Przeglądaj więcej filmów