Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

Protokół ten wykorzystuje analizę śledzenia nanocząstek do wykonywania dokładnych, wiarygodnych i powtarzalnych pomiarów średnic hydrodynamicznych nanomateriałów będących przedmiotem zainteresowania. Metoda jest szybka i łatwa do wykonania, ułatwiając pomiar hydrodynamicznej sferycznej równoważnej średnicy cząstek, poprzez analizę wizualną cząstka po cząstce w czasie rzeczywistym i minimalne przygotowanie próbki. Przed wykonaniem pomiaru należy przefiltrować objętość ultraczystej wody, która ma być użyta do analizy, przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,02 mikrona.

Odpowiednio rozcieńczyć próbkę w przefiltrowanej wodzie. W przypadku tej próbki dyspersji złota koloidalnego o długości 60 nanometrów należy rozcieńczyć objętościowo przez współczynnik 50. Podłącz przyrząd NTA, pompę strzykawkową i komputer, a następnie włącz sprzęt i oprogramowanie.

Wyjmij moduł laserowy z systemu i użyj chusteczki higienicznej i sprężonego powietrza, aby całkowicie wysuszyć szklane powierzchnie oraz wewnętrzne kanały LVFC, rurki i porty płynów. Umieść LVFC na module laserowym, a następnie zabezpiecz go czterema dokręcającymi je po przekątnej. Podłącz rurkę wylotową do portu po prawej stronie ogniwa.

Włóż rurkę dopływową do butelki na odpady i przepłucz 900 mikrolitrów roztworu czyszczącego tak szybko, jak pozwala na to ciśnienie wsteczne. Wymień strzykawkę podłączoną do rurki wlotowej na nową strzykawkę zawierającą jeden mililitr przefiltrowanej wody i podłącz rurkę wlotową do lewego portu komory przepływowej. Następnie powoli wprowadź około 500 mikrolitrów płynu do komory próbki, uważając, aby podczas załadunku nie dostały się pęcherzyki powietrza.

Aby załadować moduł laserowy, włóż wypełniony wodą LVFC do przyrządu i zablokuj ogniwo na miejscu. Zabezpiecz strzykawkę i podstawkę pompy strzykawkowej, a następnie kliknij przycisk Start Camera (Uruchom kamerę) w interfejsie oprogramowania, aby zainicjować kamerę. Na karcie sprzętu kliknij opcję Punktowe, aby przesunąć pozycję odniesienia i ustawić poziom kamery na 16.

Dostosuj ostrość ręcznie, aby sprawdzić, czy w rozcieńczalniku nie ma żadnych cząstek, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij w głównym oknie view, aby dostosować położenie pola widzenia, aby sprawdzić, czy nie ma żadnych cząstek. Aby wyczyścić system, wymień strzykawkę na strzykawkę pełną tylko powietrza i powoli zastąp wodę w komorze powietrzem. Wyjmij ogniwo z modułu laserowego z przyrządu i odłącz kawałki rurek.

Wyczyść szkło optyczne modułu laserowego i szklane powierzchnie LVFC wodą i osusz chusteczką i sprężonym powietrzem. Po ponownym złożeniu LVFC i modułu laserowego oraz zalaniu rurki, podłącz strzykawkę zawierającą jeden mililitr zawiesiny nanocząstek złota o długości 60 nanometrów do dolnego portu i powoli wstrzyknij 750 mikrolitrów próbki do komory LVFC. Po załadowaniu modułu laserowego i zainicjowaniu kamery kliknij przycisk Scatter (Rozproszenie), aby przesunąć ognisko referencyjne do pozycji, potwierdzając, że ostrość jest ustawiona prawidłowo, aby uzyskać wyraźny obraz cząstek.

Sprawdź, czy pole view jest ustawione centralnie w stosunku do położenia wiązki laserowej i uruchom funkcję automatycznej konfiguracji, aby automatycznie zoptymalizować ostrość i poziom kamery, aby zapewnić osiągnięcie optymalnej jakości obrazu. Aby przeanalizować próbkę, otwórz zakładkę Standardowa procedura operacyjna pomiaru standardowego i ustaw przyrząd tak, aby rejestrował pięć 60-sekundowych filmów przy powolnym i stałym przepływie. Następnie ustaw nazwę pliku i lokalizację danych i rozpocznij uruchamianie.

Aby przeanalizować dane, przeciągnij suwak na karcie Próg wykrywania, aby ustawić próg wykrywania tak, aby wykryć i śledzić jak najwięcej widocznych cząstek. Upewnij się, że nie widać więcej niż pięć niebieskich krzyżyków wskazujących na hałas. Aby automatycznie przetworzyć filmy z analizą śledzenia cząstek, kliknij Ustawienia, OK i pozostaw wszystkie parametry przetwarzania w ustawieniach automatycznych.

Po zakończeniu przetwarzania danych wyeksportuj dane jako plik wyników formularza CSV. W tym miejscu przedstawiono wyniki porównań międzylaboratoryjnych w pierwszej rundzie uzyskane przy użyciu różnych konfiguracji przyrządów do analizy śledzenia nanocząstek. Z wyjątkiem laboratorium szóstego, powtarzalność między pięcioma powtórzeniami przechwytywania była dobra, mimo że kilka laboratoriów zarejestrowało większy niż oczekiwano rozmiar trybu.

Dokładność wyników analizy śledzenia nanocząstek z trzeciej rundy została poprawiona przez wszystkie laboratoria, które wdrożyły tę samą standardową procedurę operacyjną i ustawienia przyrządów z trybem średnim we wszystkich laboratoriach wynoszącym 62,02 plus minus 1,97 nanometra. Średnią średnicę cząstek można obliczyć za pomocą obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jako technikę uzupełniającą NTA w celu walidacji wielkości cząstek, morfologii i proporcji. W tej analizie cząstki wydają się być w większości kuliste ze średnim współczynnikiem kształtu wynoszącym 1,1.

Ważne jest, aby upewnić się, że cela o małym przepływie objętościowym jest dobrze oczyszczona przed użyciem, że próbka jest odpowiednio rozcieńczona, dobrze obciążona i skoncentrowana oraz że przestrzegane są SOP. Metoda ta może być stosowana do dowolnej innej charakterystyki nanocząstek, w tym egzosomów i wirusów, w celu wsparcia badań stabilności i procesów kontroli jakości.