Name: Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania rekombinowanych białek IgG z GFP w Nicotiana benthamiana przy użyciu chromatografii kolumnowej. Protokół umożliwia wizualizację przeciwciał roślinnych na każdym etapie produkcji białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Marii Pii DiPalma za montaż filmu. Dziękujemy również Biuru ds. Pomocy Edukacyjnej i Obsługi Studentów na Uniwersytecie Stanowym Arizony za hojną pomoc w opłatach za publikację. Badania nad tym protokołem były wspierane przez Szkołę Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Stanowego Arizony.

1. Uprawiaj rośliny N. benthamiana
<ol>
	<li>Ułóż granulki torfu na tacy i zalej je wcześniej ugotowaną, jeszcze gorącą (~40-45 °C) wodą w celu pełnego rozprężenia. Po całkowitym rozprężeniu granulek umieść 2-3 nasiona N. benthamiana na każdym granulowaniu torfu za pomocą pęsety.</li>
	<li>Wlej około 0,5 cala wody, aby przykryć dno tacy. Oznacz tacę datą wysiewu. Kontynuuj codzienne podlewanie sadzonek odpowiednią ilością nawozu. Stężenie nawozu (rozpuszczalnego w wodzie uniwersalnego nawozu roślinnego) wynosi zwykle 2,5-2,8 g/l.</li>
	<li>Przykryj tacę humidome górną pokrywą po umieszczeniu w komorze wzrostowej. Przechowuj wysiane granulki torfu w komorze wzrostowej w temperaturze 23-25 °C, z 16-godzinnym fotoperiodem i wilgotnością względną 60%.</li>
	<li>Po tygodniu usuń dodatkowe rośliny, pozostawiając każdą granulkę tylko z jedną sadzonką.</li>
	<li>Gdy rośliny osiągną wiek 2-3 tygodni, przenieś każdą granulkę torfu do indywidualnej doniczki zawierającej glebę kontrolującą wilgotność. W tej demonstracji wykorzystano ziemię doniczkową Miracle-Gro do kontroli wilgotności</li>.
	<li>Podlewaj codziennie 1 g/l nawozu. Nigdy nie pozostawiaj gleby całkowicie suchej. Rośliny są gotowe do infiltracji w wieku 5-6 tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie Agrobacterium tumefaciens do infiltracji
UWAGA: Konstrukty fuzyjne GFP-IgG można uzyskać zgodnie z opisem w tym artykule31. Gen asGFP został uzyskany i zoptymalizowany pod kątem roślin w tym badaniu45. Poniższe czynności należy wykonać obok palnika Bunsena i zastosować podstawowe techniki aseptyki, aby uniknąć zanieczyszczenia.
<ol>
	<li>Streak A. tumefaciens EHA105 zawiera wirusa żółtego karłowatego karłowatego bąb (BeYDV)19 wektor ekspresji roślinnej dla każdego konstruktu (asGFP-IgG, GFP-IgG, łańcuch lekki) z glicerolu na agarze LB (10 g/L trypton, 10 g/L NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 15 g/L agar, 50 μg/ml kanamycyny). </li>
	<li>Hodować przez jeden dzień w inkubatorze stojącym o temperaturze 30 °C. Wyizoluj pojedynczą kolonię w celu weryfikacji za pomocą standardowego protokołu PCR z ekranem kolonii. </li>
	<li>Użyj zweryfikowanej kolonii dla każdego konstruktu. Napełnij probówkę stożkową 10 ml pożywki LB (10 g/l tryptonu, 10 g/l NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 50 μg/ml). Następnie dodaj 10 μl 100 μg/ml kanamycyny. Dodać 10 μl 2,5 μg/ml ryfampicyny, aby zapobiec zanieczyszczeniu E. coli. Inkubować w temperaturze 30°C i 120-150 obr./min przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia, jeśli kultura Agrobacterium zostanie wyhodowana do OD600 = 0,6-0,9, można ją wykorzystać do infiltracji. Jeśli jest przerośnięty (OD600 > 1), 1-2 ml należy przenieść do świeżego LB z antybiotykami i wyhodować do wymaganego OD600. W zależności od początkowego stężenia hodowli, może to zająć potencjalnie dwa dni, aby osiągnąć OD600 = 0,6-0,9.</li>
	<li>Po osiągnięciu odpowiedniego OD600 umieść kultury w wirówce i osadzaj bakterie przez odwirowanie przy 4,500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Zdekantować supernatant z obu próbek, a następnie ponownie zawiesić każdą osadkę w 1x buforze infiltracyjnym (10 mM kwas 2-(N-morfolino) etanosulfonowy, 10 mM siarczan magnezu, dostosowany do pH 5,5 za pomocą KOH), aby uzyskać końcowy OD600 = 0,4. Powinno to zająć około 15-45 ml buforu infiltracyjnego, w zależności od początkowej gęstości hodowli. Połącz równe objętości każdego konstruktu fuzyjnego IgG z konstruktem łańcucha lekkiego, aby uzyskać końcowy OD600 = 0,2 na konstrukt w każdej probówce.</li>
</ol>
3. Agroinfiltracja strzykawką bezigłową
<ol>
	<li>Weź wyprostowany spinacz do papieru i 5-6-tygodniowe rośliny N. benthamiana z kroku 1. Używając ostrej krawędzi spinacza do papieru, wykonaj małe nakłucie w pierwszej warstwie naskórka liścia na powierzchni adaksjalnej. Unikaj przebijania go na wylot. 
	UWAGA: Dolne liście są łatwiejsze do infiltracji, podczas gdy liście na wierzchu rośliny są twardsze. Ogólnie rzecz biorąc, ekspresja rekombinowanych białek jest najwyższa w liściach znajdujących się w środku rośliny, a liście te również stają się mniej nekroztyczne.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml bez dołączonej igły przygotowanym roztworem Agrobacterium z kroku 2. Zakryj otwór wykonany w poprzednim kroku końcem strzykawki i powoli dociśnij, aby wstrzyknąć bakterie do liścia, jednocześnie wywierając delikatny przeciwnacisk od tyłu liścia. Obserwuj, jak liść ciemnieje, gdy roztwór jest wstrzykiwany, bez wywierania zbyt dużego nacisku na strzykawkę.</li>
	<li>Staraj się infiltrować większość obszaru liści maksymalnie 3-4 razy – nadmierne uszkodzenie liści może utrudnić plon białka. Infiltrowany liść rośliny będzie wyglądał na przeważnie ciemny od dołu. 
	UWAGA: Ten roztwór bakteryjny powinien wystarczyć na co najmniej 3-4 rośliny na konstrukt. Pozostały roztwór bakteryjny należy złożyć w autoklawie przed wyrzuceniem.</li>
</ol>
4. Uprawiaj i obserwuj infiltrowany N. benthamiana
<ol>
	<li>Umieść infiltrowane rośliny z powrotem w komorze wzrostowej i kontynuuj codzienne podlewanie.</li>
	<li>Obserwuj liście pod kątem chlorozy i nekrozy w infiltrowanych obszarach. Obserwuj rośliny pod kątem fluorescencji GFP (jeśli GFP jest obecny) pod długo- i krótkofalową lampą UV.</li>
	<li>Dzień 4-5 wykazuje najwyższą fluorescencję obu konstruktów GFP w liściach. Zbierz wszystkie liście w temperaturze 4-5 dpi (dni po infiltracji) i zważ cały materiał liści. </li>
	<li>Należy go natychmiast zużyć do dalszego przetwarzania lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Przed użyciem należy przechowywać i kubki blendera na lodzie lub w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 2-3 ml lodowatego buforu ekstrakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 z HCl) na 1 g materiału roślinnego. Dodać 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) z wywaru (100 mM) i 50 mM askorbinianu sodu do buforu ekstrakcyjnego bezpośrednio przed ekstrakcją.</li>
	<li>Umieść tkankę roślinną z kroku 4 w wstępnie schłodzonym kubku blendera. Dodać odmierzoną ilość schłodzonego buforu ekstrakcyjnego do kubka blendera (jak wskazano w kroku 5.2). Umieść kubek blendera na blenderze. Weź wstępnie przycięty arkusz parafilmu i rozciągnij go na górze kubka blendera. Miksuj do uzyskania jednorodności w 20-sekundowych odstępach, dobrze mieszając między cyklami miksowania w razie potrzeby.</li>
	<li>Przenieść zmieszany materiał do zlewki. Dodać mieszadło i mieszać w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby zwiększyć rozpuszczalność białek i umożliwić wytrącanie się ciał stałych.</li>
	<li>Umieść 2 warstwy Miracloth na czystej zlewce na lodzie i przelej przez nią ekstrakt, aby usunąć duże resztki liści. Po wylaniu całego ekstraktu złóż Miracloth, aby wycisnąć resztki ekstraktu z liści. Ekstrakt powinien być ciemnozielony bez widocznych cząstek.</li>
	<li>Przenieść 50 μl tej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i oznaczyć "ekstrakt całkowity" do późniejszej analizy. Przenieść ekstrakt do probówek wirówkowych. Odwirować pozostałą część ekstraktu roślinnego w temperaturze 16 000 x g przez 20 minut, w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do stożkowej probówki.</li>
	<li>Przefiltrować rozpuszczalny ekstrakt za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml i strzykawkowego filtra z włókna szklanego (0,75 μm).</li>
	<li>Zebrać 50 μl próbki po odwirowaniu, oznaczyć "ekstrakt rozpuszczalny" do późniejszej analizy.</li>
</ol>
6. Procedura chromatografii w kolumnie G białka
UWAGA: Opisany tutaj protokół dotyczy chromatografii grawitacyjno-przepływowej z użyciem żywicy agarozowej Pierce Protein G. Jeśli używasz innej żywicy, zapoznaj się z instrukcjami producenta dotyczącymi regulacji. Nigdy nie pozwól, aby żywica wyschła i nie pozwól całej cieczy spłynąć. W razie potrzeby zamknij gniazdko.
<ol>
	<li>Ustaw kolumnę polipropylenową, która mieści 20 ml próbki. </li>
	<li>Oszacuj potrzebną ilość gnojowicy w zależności od docelowego typu immunoglobuliny i jej powinowactwa do żywicy. Ogólnie rzecz biorąc, 3 ml całkowitej zawiesiny przy objętości złoża 1,5 ml wystarcza do oczyszczenia kilku miligramów Ab.</li>
	<li>Ostrożnie wlać wymaganą ilość zawieszonej gnojowicy do zakrytej kolumny. Otwórz wylot kolumny od dołu kolumny i pozwól mu spłynąć, aż większość bufora zniknie. </li>
	<li>Natychmiast wlej 10 ml buforu do płukania 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 z HCl) na wierzch. Pozwól mu spłynąć i powtórz ten krok prania 2 razy. </li>
	<li>Nanieść przefiltrowaną próbkę z kroku 5 do kolumny i zebrać przepływ - podwielokrotność 50 μl przepływu do późniejszej analizy. Zachowaj resztę przepływu na wypadek, gdyby Ab nie związał się z żywicą. 
	UWAGA: Ponowne zastosowanie przepływu do nowej kolumny zwykle nie daje dobrej wydajności; Dlatego zaleca się rozpoczęcie od nowego materiału liściowego.</li>
	<li>Umyj żywicę dwukrotnie 10 ml 1x PBS, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie. W razie potrzeby należy podsycić 50 μl roztworu do płukania, gdy bufor przepływa przez kolumnę, aby sprawdzić, czy docelowy Ab nie jest eluowany za pomocą buforu do przemywania wody. </li>
	<li>Ustawić i oznaczyć pięć probówek 125 μl sterylnego 1 M Tris-HCl o pH 8. Ma to na celu zneutralizowanie Abs w kwaśnym buforze elucyjnym, aby uniknąć potencjalnych zmian strukturalnych. Alternatywnie, dodać 30 μl 2 M zasady Tris, aby uzyskać mniej rozcieńczoną próbkę. 
	UWAGA: Podczas elucji do wizualizacji można użyć światła UV. Nie trzeba tego robić przez cały czas trwania elucji. Jeśli używane jest promieniowanie UV, należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć uszkodzenia oczu i skóry. Na etapie elucji nie trzeba używać światła UV</li>.
	<li>Eluować Abs, nakładając 5 ml buforu elucyjnego (100 mM glicyny, pH 2,5 z HCl) do kolumny i zebrać 1 ml frakcji do każdej wyznaczonej probówki z poprzedniego etapu. </li>
	<li>Natychmiast zregenerować kolumnę, nakładając 20 ml buforu do przemywania wody, a następnie 10 ml buforu do płukania. Upewnij się, że żywica nie jest pozostawiona w kwaśnym środowisku przez dłuższy czas. Elucje powinny wydawać się fluorescencyjne, często najwyższą fluorescencję obserwuje się w drugiej elucji, ale może się różnić w zależności od ekstrakcji.</li>
	<li>Do przechowywania umyj żywicę 10 ml 20% etanolu w PBS i pozwól jej spłynąć do połowy. Przykryj górną, a następnie dolną część kolumny i utrzymuj w pozycji pionowej w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, żywice białkowe G mogą być ponownie użyte do 10 razy bez znaczącej utraty wydajności. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z wytycznymi producenta.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie Ab za pomocą spektrofotometru, mierząc absorbancję przy 280 nm, używając buforu elucyjnego jako próby ślepej. Przechowywać eluaty w temperaturze -80 °C i podwielokrotność 50 μl każdej frakcji do oddzielnej probówki w celu dalszej analizy. </li>
</ol>
7. SDS-PAGE do wykrywania fuzji GFP-Ig
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie próbki przed skonfigurowaniem SDS-PAGE.
	<ol>
		<li>Dodać 4 μl buforu do próbek (6x redukujący bufor próbki: 3,0 ml glicerolu, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg błękitu bromofenolowego); (6x nieredukujący bufor próbki: 3,0 ml glicerolu, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg błękitu bromofenolowego) do 20 μl każdej próbki (ekstrakt całkowity, ekstrakt rozpuszczalny, przepływ, płukanie, wszystkie frakcje elucyjne) do analizy. Upewnij się, że zaślepki rurek są dobrze zamocowane.</li>
		<li>Przez 5 minut należy traktować tylko próbki redukcyjne we wrzącej łaźni wodnej, a następnie umieszczać próbki na 5 minut na lodzie. Odwirować próbki w mikrowirówce przez ~5 s i załadować 20 μl każdej próbki w kolejności pobierania do dołków żelowych. Załaduj 3 μl dwukolorowej drabinki białkowej do osobnego dołka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom żel SDS-PAGE przy stałym napięciu 100 V do pożądanej separacji pasm białkowych; zajmuje to około 1,5 godziny. Monitoruj drabinę jako wskaźnik separacji białek.</li>
	<li>Wizualizuj żel pod wpływem promieniowania UV, aby zaobserwować fluorescencję GFP.</li>
	<li>W razie potrzeby zabarwić żel barwnikiem Coomassie, aby ocenić całkowite białko w każdej próbce. Alternatywnie, wykonaj western blot, aby ocenić docelowe białko przy użyciu określonego Abs. 
	UWAGA: Zarówno barwienie Coomassie, jak i western blot można wykonać zgodnie ze standardowymi protokołami47,48.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten może być wykorzystany do wizualnej weryfikacji dowolnego rekombinowanego białka Ab lub rekombinowanego białka wytwarzanego w roślinach N. benthamiana, w tym tych, które wymagają czasowego narażenia na kwaśne środowisko w celu oczyszczenia kolumny 42,43,44. Co więcej, fuzja asGFP z innymi białkami w różnych systemach ekspresji może być użytecznym narzędziem do eksperymentalnej wizualizacji i edukacji. Protok...

Raporty branżowe wskazują, że trzynaście z dwudziestu najbardziej dochodowych leków w Stanach Zjednoczonych to leki biologiczne (farmaceutyki oparte na białkach), z czego dziewięć to przeciwciała. W 2019 r. istniało ponad 570 terapii przeciwciałami (Ab) w różnych fazach rozwoju klinicznego1,2,3. Obecna globalna sprzedaż Ab przekracza 100 mld USD, a rynek terapeutyczny monoklonalnego Ab (mAb) ma wygenerować do 300 mld USD do 2025 r.1,4. Przy tak dużym popycie i przewidywanym wzroście przychodów, naukowcy pracują nad opracowaniem sposobów produkcji leków Ab na coraz większą skalę, o wyższej jakości i niższych kosztach. Roślinne systemy ekspresji mają kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi liniami komórkowymi ssaków w przystępnej cenie i na dużą skalę produkcji leków Ab5,6. Produkcja leków białkowych w roślinach ("farmacja molekularna") nie wymaga drogich bioreaktorów ani urządzeń do hodowli komórkowych, jak to ma miejsce w przypadku tradycyjnych technik hodowli komórek ssaków7,8. Rośliny nie mogą zarazić się ludzkimi patogenami, co minimalizuje potencjalne zanieczyszczenie9. Zarówno przejściowa, jak i transgeniczna ekspresja białek roślinnych może być wykorzystana jako tańsza alternatywa dla systemów produkcji ssaków lub bakterii10. Chociaż rośliny transgeniczne są preferowane do produkcji roślinnej, produkcja białka rekombinowanego przy użyciu tej metody może zająć tygodnie lub miesiące. Postępy w przejściowej ekspresji za pomocą wektorów wirusowych za pomocą strzykawki lub agroinfiltracji próżniowej pozwalają na produkcję pożądanego białka na małą i dużą skalę w ciągu kilku dni11,12,13,14. Produkcja mAb przeciwko wirusom Ebola, Denga i Zika oraz wielu innym rekombinowanym białkom została wyprodukowana i oczyszczona szybko i wydajnie przy użyciu przejściowej ekspresji w roślinach N. benthamiana 15,16,17,18,19. Okoliczności te sprawiają, że przejściowa ekspresja roślinna jest atrakcyjną opcją dla rozwoju wielu terapii Ab i metod zademonstrowanych w tym protokole20.
Przeciwciała mAb pierwszej generacji były pochodzenia mysiego, co skutkowało niespecyficzną immunogennością w badaniach na ludziach21. Z biegiem czasu chimeryczne, humanizowane i ostatecznie w pełni ludzkie Abs zostały wyprodukowane, aby zmniejszyć immunogenność indukowaną przez terapie Ab. Niestety, niektóre z tych Ab nadal powodują immunogenność gospodarza ze względu na różnice w glikozylacji21. Postęp w inżynierii roślinnej pozwolił na modyfikację glikanów Ab, co jest niezbędne, ponieważ na stabilność i funkcję Ab może znacząco wpływać jego stan glikozylacji22. Postępy umożliwiły produkcję w systemach roślinnych wysokiego poziomu ekspresji humanizowanych mAb, zawierających ludzkie glikany, a w rezultacie pożądane cechy biologiczne masowo produkowanego ludzkiego farmaceutyku19,21.
Oprócz rekombinowanych Abs, cząsteczki fuzyjne Ab (fuzje Ab) były badane do różnych celów w ostatnich dziesięcioleciach. Fuzje Ab często składają się z fragmentu Ab lub Ab połączonego z cząsteczką lub białkiem i mają na celu wywołanie odpowiedzi komórek efektorowych układu odpornościowego23. Cząsteczki te zostały stworzone jako potencjalne interwencje terapeutyczne w leczeniu różnych patologii, takich jak rak i choroby autoimmunologiczne24,25,26,27. Rekombinowane kompleksy immunologiczne (RIC) to kolejna klasa fuzji Ab, które zostały wykorzystane jako kandydaci na szczepionki28. RIC wykorzystują zdolność układu odpornościowego do rozpoznawania regionów Fc fuzji Ab i stwierdzono, że poprawiają immunogenność w połączeniu z innymi platformami szczepionkowymi29,30,31. 
Zielone białko fluorescencyjne (GFP) to bioluminescencyjne białko pochodzące od meduzy Aequorea Victoria, która emituje zielone światło, gdy jest wzbudzone przez światło ultrafioletowe32,33. Z biegiem lat zastosowanie GFP jako wizualnego markera ekspresji genów rozszerzyło się z ekspresji w Escherichia coli na liczne systemy ekspresji białek, w tym rośliny N. benthamiana class34,35,36,37,38. Widoczne markery, takie jak GFP, mają liczne implikacje w nauczaniu i uczeniu się pojęć naukowych. Wielu uczniów na poziomie podstawowym opisuje trudności ze zrozumieniem pojęć naukowych, gdy nauczana idea nie jest widoczna gołym okiem, takich jak koncepcje biologii molekularnej i dziedzin pokrewnych39. Markery wizualne, takie jak GFP, mogą zatem przyczyniać się do przetwarzania informacji związanych z procesami naukowymi i mogą pomóc w zmniejszeniu trudności, jakie zgłaszają uczniowie w poznawaniu wielu pojęć naukowych.
Chociaż GFP jest często używany jako marker do oznaczania genu i ekspresji in vivo, trudno jest go zwizualizować w dalszych procesach, jeśli używa się kwaśnych warunków. Okoliczność ta wynika przede wszystkim z faktu, że GFP nie zachowuje swojej struktury i wynikowej fluorescencji przy niskim pH40. Tymczasowe środowisko kwaśne jest często wymagane w różnych procesach oczyszczania, takich jak chromatografia białek G, białek A i białek L, często wykorzystywanych do oczyszczania Ab41,42,43,44. Mutanty GFP zostały użyte do zachowania fluorescencji w środowisku kwaśnym45,46.
Tutaj opisujemy prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanych białek fuzyjnych IgG w roślinach N. benthamiana. Wyprodukowaliśmy tradycyjny GFP połączony z N-końcem humanizowanego łańcucha ciężkiego IgG, tworząc fuzję GFP-IgG. Jednocześnie opracowaliśmy fuzję sekwencji zoptymalizowanej pod kątem kodonów roślinnych dla stabilnego kwasowo GFP (asGFP) do N-końca humanizowanego łańcucha ciężkiego IgG, tworząc fuzję asGFP-IgG. Do zalet produkcji GFP-IgG należy możliwość wizualizacji obecności białka docelowego podczas ekspresji, podczas gdy asGFP-IgG pozwala dostrzec obecność białka rekombinowanego nie tylko na etapach ekspresji i ekstrakcji, ale także na etapach oczyszczania białka. Protokół ten można dostosować do produkcji, oczyszczania i wizualizacji szeregu białek fuzyjnych GFP wytwarzanych w N. benthamiana i oczyszczanych przy użyciu technik chromatograficznych, które wymagają niskiego pH. Proces ten można również dostosować do różnych ilości materiału liściowego. Chociaż Abs i białka fuzyjne oznaczone GFP lub jako GFP nie są przeznaczone do stosowania w terapiach, metody te mogą być przydatne jako kontrola podczas eksperymentów, a także mogą być dalej wykorzystywane jako narzędzie dydaktyczne dla biologii molekularnej i komórkowej oraz biotechnologii, zarówno osobiście, jak i wirtualnie.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Blender z kubkami</td><td>dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>219482101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA ( Kwas etylenodinitrylo)tetraoctowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E-6760</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>G-Biosciences</td><td>BTNM-0037</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>HCl (kwas solny)</td> <td>EMD MILLIPORE CORPORATION</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>dowolnego renomowanego dostawcy</td><td>Nr Dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>: Jiffy-7 727 z otworem w pelety torfowe</td><td>Hummert International</td><td>14237000</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>K-120-100</td><td></td></tr><tr><td>KCl (chlorek potasu)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (fosforan potasu)</td> <td>J.t.baker</td><td>3248-05</td><td></td></tr><tr><td>KOH (wodorotlenek potasu)</td> <td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Millipore</td><td>4 75855-1R</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka doniczkowa kontrolująca wilgotność</td><td>Miracle-Gro</td><td>755783</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (fosforan sodu)</td><td>J.t.baker</td><td>3827-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (chlorek sodu)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203274C</td><td></td></tr><tr><td>Nasiona Nicotiana benthamiana</td><td>dowolny renomowany dostawca</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu)</td><td>G-Biosciences</td><td>786-787</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna polipropylenowa</td><td>dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610394</td><td></td></tr><tr><td>Żywica białkowa G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20399</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>R-120-25</td><td></td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>G-Biosciences</td><td>DG093</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7631-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>dowolnego renomowanego dostawcy</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Tytan3 0,75 &mikro; m filtr z włókna szklanego</td><td>ThermoScientific</td><td>40725-GM</td><td></td></tr><tr><td>Taca na pelety torfowe z kopułą</td><td>dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Base</td><td>J.t.baker</td><td>4109-02</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M108-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>17221</td><td></td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>dowolna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalna w wodzie Uniwersalny Pokarm roślinny</td><td>Miracle-Gro</td><td>2000992</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>9182</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie białek fuzyjnych igg ulegających przejściowej ekspresji w nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Wysokie zapotrzebowanie na przeciwciała jako interwencje terapeutyczne dla różnych chorób zakaźnych, metabolicznych, autoimmunologicznych, nowotworowych i innych stwarza rosnącą potrzebę opracowania skutecznych metod produkcji rekombinowanych przeciwciał. W 2019 r. istniało ponad 70 zatwierdzonych przez FDA przeciwciał monoklonalnych, a potencjał wzrostu jest wykładniczy. Pomimo ich obietnicy, czynnikami ograniczającymi powszechne stosowanie są koszty produkcji i złożoność. Potencjalnie zakłady oferują tanie, bezpieczne i łatwo skalowalne strategie produkcji białek. Rośliny takie jak Nicotiana benthamiana nie tylko mogą prawidłowo składać i składać złożone białka ssaków, ale także mogą dodawać krytyczne modyfikacje potranslacyjne podobne do tych oferowanych przez hodowle komórek ssaków. W tej pracy, wykorzystując natywny GFP i stabilny kwasowo wariant białka zielonej fluorescencji (GFP) połączony z ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi, byliśmy w stanie zwizualizować cały przejściowy proces ekspresji i oczyszczania przeciwciał z roślin N. benthamiana. W zależności od celu eksperymentu, natywna fuzja GFP może zapewnić łatwiejszą wizualizację podczas fazy ekspresji w roślinach, podczas gdy stabilna kwasowo fuzja GFP pozwala na wizualizację podczas dalszego przetwarzania. Ta skalowalna i prosta procedura może być wykonana przez jednego badacza w celu wyprodukowania miligramowych ilości wysoce czystych przeciwciał lub białek fuzyjnych przeciwciał w ciągu kilku dni przy użyciu zaledwie kilku małych roślin. Taką technikę można rozszerzyć na wizualizację dowolnego rodzaju procesu oczyszczania przeciwciał i potencjalnie wielu innych białek, zarówno w roślinach, jak i innych systemach ekspresyjnych. Co więcej, techniki te mogą przynieść korzyści z wirtualnych instrukcji i być wykonywane w laboratorium dydaktycznym przez studentów studiów licencjackich posiadających minimalne wcześniejsze doświadczenie z technikami biologii molekularnej, zapewniając podstawę do eksploracji opartej na projektach z zastosowaniami w świecie rzeczywistym.

To badanie demonstruje łatwą i szybką metodę produkcji białek rekombinowanych i ich wizualizacji w dalszych procesach. Stosując N. benthamiana i postępując zgodnie z dostarczonym protokołem, opisaną tutaj rekombinowaną produkcję białka można osiągnąć w czasie krótszym niż tydzień. Ogólny przebieg procesu ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania roślin jest pokazany na Rysunek 1. Etapy wzrostu roślin z siewek 2-tygodniowych, 4-tygodniowych i 6-tygodniowych są wyświetlane odpowiednio w <s...

Opisujemy tutaj prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanej ludzkiej IgG połączonej z GFP u Nicotiana benthamiana. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie i wizualizację wielu białek, które wykorzystują chromatografię kolumnową. Co więcej, protokół można dostosować do osobistego i wirtualnego laboratorium dydaktycznego w college'u, zapewniając eksplorację opartą na projektach.

Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Jest to demonstracja prostej metody ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanej ludzkiej IgG połączonej z GFP w roślinach Nicotiana benthamiana związanych z tytoniem. Protokół ten może być wykorzystany do oczyszczania i wizualizacji przeciwciał wytwarzanych przez rośliny, fuzji przeciwciał i większości białek, które można oczyścić za pomocą chromatografii kolumnowej. Protokół ten umożliwia naukowcom i studentom w uniwersyteckich laboratoriach wizualizację białek znakowanych GFP na większości etapów procesu produkcji białek.Umieść granulki torfu na tacy i zalej je wcześniej przegotowaną, jeszcze gorącą wodą, aby uzyskać pełne rozprężenie. Pelety potrzebują kilku minut, aby w pełni się rozprężyć. Po całkowitym rozwinięciu palet umieść dwa do trzech nasion Nicotiana benthamiana na każdej granulce torfu za pomocą pęsety.Po wykonaniu tej czynności musisz wlać około 0,5 cala wody, aby przykryć dno tacy. Nie zapomnij oznaczyć tacki datą wysiewu. Kontynuuj codzienne podlewanie sadzonek odpowiednią ilością nawozu.Tacę należy przykryć humidome i umieścić w komorze wzrostowej. Wysiane granulki torfu należy przechowywać w komorze wzrostowej w temperaturze od 23 do 25 stopni Celsjusza z

production-igg-fusion-proteins-transiently-expressed-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania rekombinowanych białek IgG z GFP w Nicotiana benthamiana przy użyciu chromatografii kolumnowej. Protokół umożliwia wizualizację przeciwciał roślinnych na każdym etapie produkcji białka.

Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana

Przeglądaj więcej filmów