Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Oczekuje się, że opisane tu protokoły ułatwią w przyszłości badania nad defektami oligodendroglialnymi w patogenezie neurodegeneracji. Jest to ulepszona metoda, którą można wykorzystać do wygenerowania funkcjonalnych ludzkich komórek linii oligodendrocytów w ciągu zaledwie trzech do czterech tygodni i ustanowienia systemu wspólnej hodowli w celu modelowania połączeń neuronów oligodendrocytów. Protokół może być wykorzystany do badania nie tylko choroby Alzheimera, ale każdego innego aspektu interakcji między oligodendrocytami neuronów a chorobą.

Na początek umieść około miliona komórek HEK293T w każdej kolbie T75, aby osiągnąć 40% konfluencję, a następnie transfekuj je plazmidami eksprymującymi indukowany tetracykliną gen NGN2 i oporny na puromycynę gen transaktywatora tetracykliny, wraz z trzema plazmidami pomocniczymi. Użyj PEI do transfekcji. Zmień nośnik po 16 godzinach.

Harvest uwolnił cząsteczki wirusa, zbierając pożywki hodowlane każdego dnia i zastępując je świeżymi pożywkami przez trzy dni. Zebrać zebrane pożywki do oczyszczenia, a następnie przefiltrować wirusa przez filtr 0,22 mikrometra i odwirować w temperaturze 49 000 razy G przez 90 minut. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości PBS glukozy.

Użyj dostępnych na rynku ludzkich komórek ES H1 do przeprowadzenia indukcji neuronów. Hoduj komórki na roztworze macierzy zewnątrzkomórkowej pokrytych 6-dołkowymi płytkami z pożywką podtrzymującą ESL i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Dwa dni przed indukcją różnicowania odłącz komórki ES, dodając jeden mililitr roztworu do odrywania komórek i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Przenieś komórki do probówki, a następnie umyj studzienkę dwoma mililitrami pożywki i dodaj do tej samej probówki. Odwirować komórki w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Następnie ponownie zawiesić osad w pożywce i umieścić komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą o gęstości osadzenia od jednego razy 10 do piątej komórki na studzienkę.

Następnego dnia dodaj lentiwirusy, wykazujące ekspresję NGN2 plus puro. R i transaktywator tetracykliny wraz z polibrenem w świeżej pożywce podtrzymującej komórki ES. W dniu zerowym dodaj dwa mikrogramy na mililitr doksycykliny w pożywce DMEM/F-12 uzupełnionej N2 i bez morfogenów.

Pierwszego dnia dodaj puromycynę do świeżego DMEM / F-12 oraz N2 i doksycyklinę do końcowego stężenia jednego mikrograma na mililitr. Wybrać transdukowane komórki w puromycynie przez co najmniej 24 godziny. Drugiego dnia odłącz różnicujące neurony roztworem do odłączania komórek i ponownie umieść je na 24-dołkowych płytkach pokrytych roztworem macierzy.

Utrzymuj je w podłożu MBA B27 bez doksycykliny. Hoduj czyste indukowane neurony na płytkach, pokryte roztworami opartymi na macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby przeprowadzić generowanie nerwowych komórek progenitorowych, należy wyhodować ludzkie komórki ES H1 i zróżnicować je w neuronalne komórki progenitorowe, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

W dniu ujemnym zasiewaj od 0,5 do miliona komórek w pożywce podtrzymującej komórki ES do każdej studzienki 6-dołkowej płytki pokrytej roztworem matrycy o obniżonym współczynniku wzrostu. W dniu zero traktuj komórki przez 24 godziny pożywką podtrzymującą komórki ES uzupełnioną 2% DMSO. W dniach od pierwszego do szóstego zmień całe podłoże na ciepłe podłoże do indukcji neuronów zawierające niektóre inhibitory dodawania z komercyjnego zestawu.

W siódmym dniu pasażuj NPC za pomocą roztworu do oddzielania komórek i płytkuj je z gęstością siedzenia od jednego do dwóch razy od 10 do piątych komórek na dołek 24-dołkowej płytki. Oznaczenie skuteczności różnicowania za pomocą barwienia immunohistochemicznego pod kątem braku markera pluripotencjalności i obecności markerów NPC. Aby wygenerować komórki prekursorowe oligodendrocytów, umieść NPC w ciepłym pożywce do indukcji neuronów z niektórymi inhibitorami z komercyjnego zestawu.

Ósmego dnia przygotuj roztwór 1% DMSO w pożywce różnicującej OPC i traktuj posiane NPC przez 24 godziny. W dziewiątym dniu zastąp pożywkę świeżą pożywką różnicującą OPC bez DMSO, a następnie podawaj komórki co drugi dzień do 15 dnia. Jeśli komórki osiągną zbieg przed 15 dniem, przejdź je do gęstości siedzenia od jednego do dwóch razy 10 do piątej komórki na studzienkę.

W dniu 14 płytek OPC w pożywce różnicującej OPC o gęstości od jednego do dwóch razy od 10 do piątej komórki na dołek, na 24-dołkowej płytce. Badaj komórki na obecność markerów specyficznych dla OPC przez barwienie IHC lub qPCR oraz na brak markerów NPC. W dniu 15 zastąp pożywkę pożywką do dojrzewania OL.

Zmieniaj podłoże co drugi dzień lub codziennie. Kiedy komórki osiągną 90% konfluencji, podziel je w stosunku jeden do trzech przez maksymalnie dwa przejścia lub do momentu, gdy podział komórek znacznie spowolni. Jeśli OPC dzielą się zbyt szybko i osiągają zbieg w czasie krótszym niż trzy dni, dodaj Ara-C w stężeniu od dwóch do pięciu mikromolowców przez jeden do trzech dni.

W dniu 14 ułóż IOPC o gęstości od jednego razy 10 do piątej komórki na dołek na 24-dołkowej płytce w pożywce różnicującej OPC. Następnego dnia odłącz indukowane ludzkie neurony za pomocą roztworu do odłączania komórek. Dodaj neurony do hodowanych OPC, posiewając z gęstością siedzenia dwa razy 10 do piątej komórki na studzienkę.

Użyj pożywki do kohodowli zawierającej pożywkę neurobazalną A, suplement 2% B27 i 100 nanogramów na mililitr trójjodotyroniny T3. Zmień podłoże następnego dnia, a następnie co drugi dzień. Jeśli OPC rozmnażają się zbyt szybko i osiągają konfluencję w czasie krótszym niż trzy dni, dodaj od dwóch do pięciu mikromolowych Ara-C.

Ważne jest, aby początkowe ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste wykazywały wysoki stopień pluripotencjalności dla pomyślnego generowania indukowanych neuronów lub OPC i oligodendrocytów. Dlatego komórki powinny być barwione pod kątem określonych markerów, takich jak OCT-4 i SOX2, przed rozpoczęciem któregokolwiek z protokołów indukcji. Ludzkie komórki H1 wykorzystano do uzyskania indukowanych pobudzających neuronów przodomózgowia.

Czyste neurony w hodowli zaczęły wyrażać synapsy w jednym w dniach od 14 do 16. IOPC zostały wygenerowane w ciągu dwóch tygodni, a dojrzałe oligodendrocyty w ciągu czterech do pięciu tygodni. Leczenie DMSO wzbogaciło liczbę komórek we wczesnej fazie G1 w celu lepszej integracji sygnalizacji.

Specyficzne markery OPC wykryto już dwa tygodnie po posiewie komórek ES H1. Populacja IOPC po dwóch tygodniach była dość jednorodna, z ponad 95% komórek dodatnich pod kątem barwienia 04 i wysokim poziomem immunoreaktywności dla innych markerów. Po rozpoczęciu dojrzewania oligodendrocytów wykrywano specyficzne markery oligodendrocytów począwszy od 28 dnia.

Idealne gęstości posiewu dla indukowanych neuronów i IOPC należy określić za pomocą serii miareczkowania liczby komórek, aby osiągnąć prawidłowe różnicowanie. Po czterech tygodniach, w kokulturach, IOPC powinny zostać odpowiednio zróżnicowane w oligodendrocyty, które są dodatnie dla określonych markerów, takich jak MBP. Ten system kokultur może znacznie zwiększyć liczbę synaps, co wskazuje, że IOPC zapewniają wsparcie neuronalne poprzez kontakt fizyczny lub uwalnianie czynników troficznych.

Ta opisana procedura może być jeszcze bardziej wyrafinowana poprzez dodanie różnych typów komórek mózgowych. Na przykład z komórek macierzystych uzyskano ludzkie astrocyty w celu modelowania nowych aspektów interakcji glejowych neuronów w zdrowiu i chorobie.