Name: Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj dwie techniki liczenia pęcherzyków w tkankach jajników myszy: stereologię i bezpośrednie zliczanie. Porównaj ich dokładność, czułość oraz łatwość wykonania, aby wybrać optymalną metodę dla badań biologii jajnika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była możliwa dzięki Wsparciu Infrastruktury Operacyjnej Rządu Stanu Wiktoria i Rządowi Australijskiemu NHMRC IRIISS oraz wspierana przez fundusze z National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) oraz Australian Research Council (KJH #FT190100265). Autorzy pragną podziękować za wsparcie techniczne ze strony Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform oraz Monash Micro Imaging Facility.

Jajniki pobrano od samic myszy C57BL6J. Wszystkie procedury i eksperymenty z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z australijskim kodeksem praktyk NHMRC dotyczącym opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania (NHMRC Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals) oraz zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Zwierząt Monash Animal Research Platform.
UWAGA: W niniejszym raporcie, w celu porównania dwóch metod liczenia w tym samym zwierzęciu, zastosowano środek chemioterapeutyczny, który według badań stereologicznych1 oraz bezpośrednich zliczeń12,13 powoduje wyczerpanie oocytów w pęcherzykach pierwotnych. Samice myszy w wieku 8 tygodni (młode dorosłe) zważono przed jednorazowym wstrzyknięciem dosutecznie 75 mg/kg/masy ciała cyklofosfamidy lub soli fizjologicznej jako kontroli (n=5/grupa). Wykazano, że dawka ta powoduje około 50% wyczerpanie pęcherzyków pierwotnych, przy czym nie zgłoszono, aby wywoływała ona zachorowalność lub śmiertelność u myszy14. Jajniki pobrano 48 godzin po podaniu preparatu. Jeden jajnik z każdego zwierzęcia utrwalono w 10% (v/v) neutralnym buforowanym roztworze formaliny przez 24 godziny, a drugi w roztworze Bouina przez 24 godziny. Tkankę zatopiono następnie albo w żywicy glikolometakrylanowej i wykonywano seryjne przekroje o grubości 20 µm, albo w parafinie i wykonywano seryjne przekroje o grubości 5 µm. Wszystkie tkanki barwiono metodą kwasu okresowego i Schiffa oraz hematoksyliną.
1. Przygotowanie histologiczne: utrwalanie, obróbka, zatapianie i cięcie jajników mysich
<ol>
	<li>Przeprowadź sekcję jajników myszy, usuwając jajowód oraz całą otaczającą tkankę tłuszczową, tak aby nie uszkodzić i nie przeciąć samego jajnika. W razie potrzeby w tym kroku należy użyć mikroskopu stereoskopowego i cienkiego ostrza (Rycina 1A).</li>
	<li>Natychmiast utrwalić tkanki, umieszczając je w małej, opisanej probówce zawierającej utrwalacz Bouina (stereologia) lub formalinę (liczenie bezpośrednie) na 24 godziny (Rysunek 1B), przed przeniesieniem tkanek do 70% etanolu. 
	UWAGA: Morfologia pęcherzyków jest najlepiej zachowana w tkance jajnika utrwalonej w płynie Bouina i zatopionej w żywicy glikolometakrylanowej (Rysunek 2).</li>
	<li>Przetwarzanie całych utrwalonych jajników, a następnie zatapianie ich w żywicy glikolmetakrylanowej do badań stereologicznych (Plik uzupełniający 1), lub wosku parafinowego do bezpośredniego liczenia z zastosowaniem standardowego protokołu histologicznego. 
	OSTROŻEGO: Żywica jest toksyczna, dlatego należy upewnić się, że wszystkie etapy obróbki tkanek są przeprowadzane w dygestorium, a rękawice są noszone przez cały czas.</li>
	<li>używając specjalistycznego mikrotomu do żywic metakrylanowych (Rysunek 1C) wyposażony w nóż szklany (Rycina 1D) do całkowitego wycięcia grubych skrawków z żywicy glikolometakrylanowej (np. 20 &#181;m). Pobieraj sekcje w regularnych odstępach (np. co 3rd sekcję) na szklanych płytkach mikroskopowych do stereologii.</li>
	<li>Użyj standardowego mikrotomu do wycinania cienkich skrawków parafiny (np. 4-6 &#181;m). Pobieraj przekroje tkanki w regularnych odstępach (np. co 9th przekrój) na szklaną lamellkę do bezpośredniego przeliczania mieszków włosowych.</li>
	<li>Barw lalki metodą kwasu okresowego i Schiffa (PAS) oraz hematoksyliną (Plik uzupełniający 2).</li>
	<li>Kryszalka z zastosowaniem standardowego medium DPX dla skrawków parafiniowych lub gęstego medium DPX dla skrawków zatopionych w żywicy glicolomakrylanycznej (Rycina 1E). 
	UWAGA: Żywica glikolometakrylanowa DPX jest substancją niebezpieczną, dlatego ten etap należy przeprowadzić w dygestorium. 
	UWAGA: Żywica glikolometakrylanowa DPX jest niezwykle lepka. Szkiełko podstawowe musi zostać mocno docisnięte za pomocą szpatułki, aby zapewnić równomierną i cienką warstwę DPX oraz uniknąć powstania pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem (Rysunek 1F).</li>
</ol>
2. Stereologiczna ocena liczby pęcherzyków pierwotnych z wykorzystaniem optycznego frakcjonatora
<ol>
	<li>Włącz komputer, jednostkę wielosteryjną, kamerę oraz źródło światła w zestawie do stereologii, a następnie ustaw obiektyw mikroskopu na niskie powiększenie (np. 10x).</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do stereologii.</li>
	<li>Mocno przymocuj pierwszy preparat do stolika mikroskopu.</li>
	<li>Dostosuj ekspozycję na światło, sprawdzając Automatyczny pod Ekspozycja w Ustawienia kamery panel (Rycina uzupełniająca 1A). Alternatywnie można ręcznie dostosować ekspozycję na światło.</li>
	<li>Użyj dżojstika, aby zlokalizować pierwszą próbkę tkanki, a następnie ustaw ostrość obrazu próbki.</li>
	<li>Dostosuj balans bieli, klikając w Więcej ustawień (znajdujący się w prawym dolnym rogu) Ustawienia kamery panelu), a następnie kliknij Balans bieli i kliknij w Automatyczny (Rycina uzupełniająca 1B). Alternatywnie kliknij Balans bieli przycisk sąsiadujący z Więcej ustawień przycisk (lub Wybierz obszar w Więcej ustawień), aby ręcznie ustawić balans bieli, wybierając biały obszar na preparacie.</li>
	<li>Przejdź do Sondy wybierz z menu rozwijanego i kliknij Przebieg pracy z optycznym frakcjoneremNastępnie kliknij Rozpocznij nowy projekt i kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
	<ol>
		<li>Jeśli zapisano istniejącą konfigurację próbkowania, w sekcji Parametry pobierania próbek kliknij Tak | &#8230; następnie należy wybrać pożądaną konfigurację próbkowania.</li>
		<li>Jeśli nie, kliknij Nie i ręcznie wprowadzić informacje o sekcji seryjnej (Rycina uzupełniająca 1C) i zdefiniuj konfigurację sondy w kroku 2.13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij Dalejustaw mikroskop na Niskie powiększenie i wybierz 10x powiększenie z menu rozwijanego.</li>
	<li>Kliknij w Następnya następnie obrysuj cały przekrój jajnika – zacznij od klikania lewym przyciskiem myszy wokół przekroju, a na koniec kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Zamknij kontur.</li>
	<li>Kliknij w Dalejnastawić mikroskop na Duże powiększenie i wybierz powiększenie 10x z imersją olejową z menu rozwijanego.</li>
	<li>Nanieś kroplę olejku na preparat tkankowy na szkiełku i przełącz obiektyw mikroskopu na powiększenie 10x.</li>
	<li>Dostosuj ekspozycję na światło (zgodnie z krokiem 2.4) i kliknij Dalej.</li>
	<li>Przygotuj Parametry pobierania próbek w celu zdefiniowania konfiguracji sondy. W tym przypadku ramka zliczania została ustawiona na 47.5 &#181;m Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 47.5 &#181;m (2,256.25 &#181;m2) a długość kroku ustawiono na 100 &#181;m Proszę o podanie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. 100 &#181;m (10,000 &#181;m2) (Rycina uzupełniająca 2). Po ustaleniu parametrów próbkowania należy zapisać szablon i ponownie go otworzyć podczas kolejnych sesji analizy w kroku 2.7.</li>
	<li>Kliknij w Rozpoczęcie liczenia (Rycina uzupełniająca 1D). Ustaw ostrość na górną część próbki, kliknij Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. i rozpocząć odliczanie.</li>
	<li>Użyj pokrętła ostrości, aby przesuwać się przez 10 &#181;m pobrać próbkę z odpowiedniej głębokości i policzyć wszystkie pęcherzyki pierwotne, w których jądro oocytu znajduje się w ogniskowej. Kliknij Dalej aby przejść do następnego obszaru.
	<ol>
		<li>Zaklasyfikuj pęcherzyki jako pierwotne, jeśli oocyt jest otoczony przez płaskie komórki ziarniste, ale nie występują komórki ziarniste sześcianne (Rycina 2A). 
		UWAGA: Pęcherzyki pierwotne różnią się od pęcherzyków przejściowych, które składają się z kombinacji sześcianowatych i płaskich komórek ziarnika (Rysunek 2B), oraz pęcherzyki pierwotne, które są otoczone głównie przez sześcianowe komórki ziarniste (Rycina 2C). Klasy te pęcherzyków należy kwantyfikować oddzielnie.</li>
		<li>Należy liczyć tylko te pęcherzyki, w których widoczne jest jądro oocytu. Jądro oocytu musi znajdować się wewnątrz pola liczenia lub stykać się z zielonymi liniami włączającymi pola liczenia (Rycina uzupełniająca 1E,F).</li>
		<li>Jeśli jądro oocyta znajduje się poza ramką liczenia (Rycina uzupełniająca 1G) lub dotyka czerwonych linii wykluczenia ramki zliczającej, nie należy wliczać tego pęcherzyka.</li>
		<li>Podczas oceny utraty pęcherzyków pierwotnych w odpowiedzi na egzogenną substancję chemiczną (np. chemioterapię) należy upewnić się, że wszystkie policzone pęcherzyki są zdrowe, a tym samym wykazują prawidłową morfologię (Rysunek 2). Policz oddzielnie wszelkie pęcherzyki nieprawidłowe lub atretyczne. Często śmierć pęcherzyków jest wywołana przez czynniki szkodliwe, takie jak chemioterapia; dlatego ilościowe oznaczenie pęcherzyków atretycznych należy przeprowadzić osobno, aby odróżnić pęcherzyki zdrowe od atretycznych, gdyż tylko pęcherzyki zdrowe stanowią rezerwę jajnikową.15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu liczenia w tej sekcji należy wykonać jedną z następujących czynności:
	<ol>
		<li>Kliknij Dodaj nową sekcjęa następnie należy powrócić do kroku 2.3, aby przygotować kolejny obszar do liczenia.</li>
		<li>Kliknij Zakończyłem liczenie aby zakończyć sesję. Przywróć powiększenie obiektywu do 10x, wyjdź z oprogramowania stereologicznego i wyłącz źródło światła, kamerę, jednostkę wielosterowania oraz komputer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy wyznaczyć całkowitą liczbę pęcherzyków (Q) dla każdego przekroju tkankowego pobranego z całego jajnika, a następnie, korzystając z arkusza kalkulacyjnego i poniższego równania, obliczyć wartość końcową dla każdego zwierzęcia powtórzeniowego (N).4. 
	<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg" />gdzie: 
	N = Całkowita szacowana liczba pęcherzyków w jajniku. 
	Q = Surowa liczba pęcherzyków pierwotnych. 
	f1 = Interwał pobierania próbek. Co 3B&R przekrój pobrano w następujący sposób <img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg" />. 
	f2 = Związek między ramką liczącą (obszarem próbki) a krokiem przesuwnym, obliczany jako <img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg" />Ponieważ obszar próbki był 2256 &#181;m2 (47.5 &#181;m Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 47.5 &#181;m) i obszar krokowy wynosił 10000 &#181;m2 (100 &#181;m Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 100 &#181;m), <img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg" />. 
	f3 = Odsetek pobranych próbek z przekroju jajnika. Ponieważ 10 &#181;m z 20 &#181;m pobrano próbkę z sekcji, <img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg" />. 
	W związku z powyższym, <img alt="Równanie 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg" />. 
	UWAGA: Niniejszy protokół opisuje sposób zastosowania tych zasad analiz stereologicznych przy użyciu powszechnie cytowanego oprogramowania do stereologii (Tabela materiałów); jednak dostępne jest inne oprogramowanie stereologiczne. Zasady stosowane podczas analiz stereologicznych pęcherzyków jajnikowych są takie same, niezależnie od oprogramowania wykorzystanego do ustawienia parametrów. Stereologia jest najdokładniejsza, gdy w jajniku dorosłej myszy policzonych zostanie 10 lub więcej obiektów4, ponieważ pozwala to uzyskać współczynnik błędu oszacowania poniżej 10%16Parametry pobierania próbek określone w niniejszym opisie zostały zoptymalizowane tak, aby zapewnić możliwość policzenia co najmniej około 10 obiektów (tj. pęcherzyków pierwotnych, przejściowych i pierwotnych) w jajnikach dorosłych myszy kontrolnych typu dzikiego szczepu C57BL6J. Można przeprowadzić badanie pilotażowe na małej próbie w celu ustalenia optymalnych parametrów pobierania, takich jak odstępy i liczba analizowanych przekrojów oraz liczba dyssektorów optycznych w pobranych przekrojach.17.</li>
</ol>
3. Oszacowanie liczby pęcherzyków pierwotnych poprzez bezpośrednie liczenie pęcherzyków jajnika
<ol>
	<li>Bezpiecznie umieść szkiełko przedmiotowe pod standardowym mikroskopem świetlnym i wykonaj bezpośrednie zliczenia, aby uzyskać surową liczbę pęcherzyków pierwotnych.
	<ol>
		<li>Klasyfikować pęcherzyki jako pierwotne, jeśli oocyt jest wyraźnie widoczny i otoczony jest przez płaskie komórki granulozowe, ale nie występują w nich komórki granulozowe sześcianowe (Rysunek 2D). 
		UWAGA: Pęcherzyki pierwotne różnią się od pęcherzyków przejściowych, które składają się z kombinacji sześcianowatych i płaskich komórek ziarnistych (Rysunek 2E), oraz pęcherzyki pierwotne, które są otoczone głównie przez sześciany komórki ziarniste (Rysunek 2F). Klasy pęcherzyków te należy kwantyfikować oddzielnie.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie policzone pęcherzyki są zdrowe i wykazują prawidłową morfologię (Rysunek 2). Policz oddzielnie wszelkie pęcherzyki nieprawidłowe lub atretyczne, ponieważ tylko zdrowe pęcherzyki stanowią rezerwę jajnikową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie można wykonać wiele pojedynczych lub zestawionych (tzw. stitched) mikrofotografii całego przekroju tkanki jajnika przy dużym powiększeniu (np. 20x), a następnie przeprowadzić zliczenia po otwarciu plików obrazów. Można to zrobić ręcznie lub z wykorzystaniem automatycznego skanera preparatów.</li>
	<li>Wyznacz całkowitą liczbę pęcherzyków (Q) z każdego przekroju tkanki pobranego z całego jajnika w ustalonym odstępie. Pomnóż tę liczbę przez odwrotność ułamka próbkowania, aby otrzymać wartość końcową dla każdego zwierzęcia w powtórzeniu (N), korzystając z poniższego równania. 
	<img alt="Równanie 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg" />gdzie: 
	N = Całkowita szacowana liczba pęcherzyków w jajniku. 
	Q = Surowa liczba pęcherzyków (dla każdego oddzielnego typu, obliczana osobno). 
	f1 = Interwał próbkowania. Co 9th próbkę z tej sekcji pobrano w następujący sposób <img alt="Równanie 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg" />. 
	W związku z tym, <img alt="Równanie 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg" />.</li>
</ol>

<ol><li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li>
<li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments%2C+environmental+toxins+and+maternal+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li>
<li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Mullerian+hormone%3A+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li>
<li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology%3A+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li>
<li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li>
<li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Reproductive+Biomedicine+%28Yazd%29%22%5BJournal%5D)">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+image+analysis+and+its+solution%3A+unbiased+stereology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li>
<li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li>
<li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1%2C+2%2C+3%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).</li>
<li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618(2018).</li>
<li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li>
<li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor%2C+olaparib%2C+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li>
<li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide%3A+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li>
<li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li>
<li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).</li>
<li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737(2017).</li>
<li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111(2015).</li>
<li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755(2015).</li>
<li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516(2018).</li>
<li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accurate%2C+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li>
<li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries%3A+symmetry+and+relationship+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li>
<li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number%3A+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li>
<li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+%28STRAW%29+staging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li>
<li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+reproductive+aging%3A+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li>
<li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499(2018).</li>
<li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li>
<li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten artykuł zawiera protokół krok po kroku dla złotego standardu techniki liczenia pierwotnych pęcherzyków myszy , stereologii i częściej stosowanej metody bezpośredniego liczenia mieszków włosowych. Chemioterapię zastosowano w celu porównania i skontrastowania wyników uzyskanych za pomocą tych dwóch różnych metod w obrębie lewego i prawego jajnika tego samego zwierzęcia. Obie metody wykazały dużą zmienność międzyzwierzęcą w liczbie pierwotnych pęcherzyków włosowych. Znaczne wyczerpanie rezerwy jajnikowej zarejestrowano ...

Niedojrzałe, meiotycznie zatrzymane oocyty przechowywane w pierwotnych pęcherzykach w jajniku są jednostką pamięci dla żeńskiej linii zarodkowej i stanowią dożywotnią rezerwę jajnikową danej osoby. Pierwotna liczba pęcherzyków włosowych zmniejsza się naturalnie wraz z wiekiem1, lub alternatywnie, może zostać przedwcześnie uszczuplona w wyniku ekspozycji na egzogenne chemikalia, w tym niektóre farmaceutyki i toksyny środowiskowe w powietrzu, żywności i wodzie2. Biorąc pod uwagę, że pierwotna liczba pęcherzyków jest skończona, ilość i jakość pęcherzyków obecnych w jajniku w dużej mierze decyduje o płodności samic i zdrowiu potomstwa. W związku z tym dokładna kwantyfikacja pierwotnej liczby pęcherzyków jajnikowych u kobiet jest niezbędna do oceny niezamierzonego wpływu egzogennych uszkodzeń na rezerwę jajnikową.
U kobiet analiza całego jajnika na ogół nie jest możliwa, dlatego w warunkach klinicznych należy stosować nieinwazyjne zastępcze pomiary rezerwy jajnikowej. Hormon anty-Mϋllerowski (AMH) jest najczęściej stosowanym klinicznie biomarkerem zastępczym3. Stężenie AMH w surowicy jest często mierzone u kobiet w zaawansowanym wieku matczynym lub przed i po leczeniu raka, takim jak chemioterapia. Jednak AMH jest wytwarzany przez wzrost pęcherzyków, a nie przez pęcherzyki pierwotne, a zatem poziomy w surowicy nie informują o bezwzględnej liczbie pęcherzyków pierwotnych.
Wobec braku metod do dokładnego określenia pierwotnej liczby pęcherzyków u kobiet in situ, liczenie pęcherzyków jajnikowych w małych modelach zwierzęcych, takich jak gryzonie, pozostaje niezbędnym narzędziem badawczym do oceny stopnia, w jakim egzogenne uszkodzenia wpływają na pierwotne pęcherzyki, a tym samym na płodność. Niestety, doniesienia w literaturze na temat liczby pierwotnych pęcherzyków w modelach gryzoni są bardzo zmienne4. Główną przyczyną takiego stanu rzeczy są szeroko zgłaszane różnice techniczne w stosowanej metodzie liczenia. Przeważnie istnieją dwie różne techniki opisane w literaturze do liczenia pierwotnych pęcherzyków u myszy. Należą do nich stereologia, w której stosuje się metodę frakcjonowania optycznego i dyssektoryzacji optycznej, oraz bezpośrednie zliczanie pęcherzyków.
Stereologia jest powszechnie uważana za złoty standard, ponieważ wykorzystuje systematyczne, jednolite, losowe pobieranie próbek5, co czyni ją najdokładniejszą metodą ilościowego określania pierwotnej liczby pęcherzyków w całych jajnikach myszy lub szczurów4,6,7. Stereologia jest bezstronna, ponieważ uwzględnia trójwymiarową strukturę obiektu zainteresowania8. Stosując metodę dysektora optycznego/frakcjonatora, stosuje się trzy poziomy pobierania próbek w celu ilościowego określenia pęcherzyków pierwotnych przy użyciu grubych skrawków tkanki (np. 20 μm) w obrębie znanej frakcji całkowitego jajnika myszy. Po pierwsze, interwał próbkowania jest wybierany (np. co 3sekcję) na losowym początku (frakcja próbkowania 1, f1)4. Skrawki są następnie pobierane w systematyczny, jednolity sposób od tego momentu przez cały jajnik. Następnie na przekrój jajnika nakłada się bezstronną ramkę zliczającą i stopniowo przesuwa wzdłuż zdefiniowanej, losowej siatki zliczania (próbkowanie frakcji 2, f2)8. Na koniec pobierana jest optycznie próbka znanego fragmentu grubości przekroju (np. 10 μm) i zliczane są mieszki włosowe w tym obszarze (frakcja próbkowania 3, f3)4. Surową liczbę pęcherzyków mnoży się przez odwrotność tych frakcji próbkowania, aby uzyskać wartość końcową. Metoda ta wymaga specjalistycznego przeszkolenia i sprzętu, w tym mikroskopu z zmotoryzowanym stolikiem sterowanym przez oprogramowanie stereologiczne. Tkanki powinny być zakonserwowane w specjalistycznym utrwalaczu Bouina i zatopione w żywicy glikolowo-metakrylanowej, aby umożliwić cięcie grubych skrawków tkanek za pomocą mikrotomu żywicy glikolowo-metakrylanowej ze szklanym nożem. Metoda ta ma na celu uwzględnienie kurczenia się i deformacji tkanek, aby jak najlepiej zachować trójwymiarową strukturę morfologiczną jajnika i mieszków włosowych9.
Bezpośrednie liczenie mieszków włosowych jest najczęściej używaną metodą liczenia mieszków włosowych10. Można stosować bardziej powszechne utrwalacze (np. formalinę), a następnie zatapianie wosku parafinowego i wyczerpujące cięcie seryjne przy użyciu standardowego mikrotomu o grubości od 4 do 6 μm. Pęcherzyki są systematycznie zliczane w całym wycinku tkanki w określonych odstępach czasu, a następnie mnożone przez odwrotność odstępu między próbkami w celu uzyskania całkowitego oszacowania pęcherzyka. Metoda ta jest szybka, łatwa, może być wykonana przy użyciu zarchiwizowanych tkanek i przygotowana przy użyciu standardowych technik histologicznych. Wymaga jedynie mikroskopu świetlnego o standardowych możliwościach obrazowania. Jednak pomimo tych zalet, bezpośrednie liczenie mieszków włosowych nie ma dokładności i ścisłych parametrów zliczania stereologii, co czyni je bardziej podatnym na stronniczość badaczy. Ponadto tkanki mogą ulegać kurczeniu się i deformacji podczas przetwarzania, zaburzając integralność i morfologię jajnika, a tym samym utrudniając klasyfikację pęcherzyków jajnikowych i kwantyfikację.
Celem tego artykułu jest opisanie dwóch powszechnie stosowanych metod ilościowego szacowania pierwotnej liczby pęcherzyków w jajnikach myszy: stereologii i bezpośredniego liczenia pęcherzyków. Przedstawimy szczegółowe protokoły dla tych dwóch metod i podkreślimy niektóre z ich mocnych i słabych stron, aby zwiększyć odtwarzalność w naszej dziedzinie i umożliwić naukowcom podjęcie świadomej decyzji o najbardziej odpowiedniej metodzie liczenia dla ich badań.

<table><tbody><tr><td>1-butanol (HPLC)</td><td>Fisher Chemical</td><td>#A383-1</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol kwasowy</td><td>Amber Scientific</td><td>#ACDL</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s utrwalacz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HT10132</td><td>Kwas pikrynowy 0,9% (w/v), formaldehyd 9% (v/v), kwas octowy 5% (w/v)</td></tr><tr><td>Cyklofosfamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ftalan dibutylu Polistyren ksylen (DPX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#06522</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Bursztyn Scientific</td><td>#ETH</td><td>Ethanol 100%</td></tr><tr><td>Micro Feather skalpel optalmiczny z aluminiową rękojeścią</td><td>Projekty dla Vision</td><td>#FEA-745-SR</td><td>Ostrze z piór do sekcji (widoczne na rysunku 1)</td></tr><tr><td>Utrwalacz formaliny</td><td>Australijski Biostain</td><td>#ANBFC</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane Thermo Scientific</td><td>#MENCS22501GP</td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Żywica glikometakrylanowa RM2165 mikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>#RM2165</td><td></td></tr><tr><td>Glikol-metakrylan DPX</td><td>*wyprodukowano we własnym zakresie</td><td></td><td>*Mieszaj 1,5 l ksylenu; 800 g granulek polistyrenu; 100 ml ftalanu dibutylu przez 3 tygodnie</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Trajan</td><td>#11031</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s haematoksylina</td><td>Bursztyn Naukowy</td><td>#MH</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX50</td><td>Olympus</td><td>#BX50</td><td>Mikroskop Brightfield wyposażony w 10-krotny obiektyw zanurzeniowy na sucho i 100-krotny w oleju (apertura numeryczna 1,3)</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny Olympus typ F</td><td>Olympus</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Olympus TH4-200 źródło światła</td><td>Olympus</td><td>#TH4-200</td><td></td></tr><tr><td>Wosk</td> <td>parafinowySigma-Aldrich</td><td>#03987</td><td></td></tr><tr><td>Kwas okresowy</td><td>Trajan</td><td>#PERI1%</td><td>Kwas okresowy 1%</td></tr><tr><td>Mikrotom rotacyjny CUT 4060</td><td>MicroTec</td><td>#4060R/F</td><td>Służy do cięcia skrawków parafinowych</td></tr><tr><td>Schiff' s odczynnik</td><td>Trajan</td><td>#SCHF</td><td></td></tr><tr><td>Woda z kranu Scotta</td><td>Bursztyn Naukowy</td><td>#SCOT</td><td>Węglan potasu, siarczan magnezu, woda</td></tr><tr><td>System stereologiczny StereoInvestigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td>Zawiera oprogramowanie StereoInvestigator, jednostkę sterującą, automatyczny stolik i joystick</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENSF41296SP</td><td>1 mm, 72 szt</td></tr><tr><td>Technovit 7100 Plastikowy system do zatapiania</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64709003</td><td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td></tr><tr><td>Technovit 3040 żółty</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64708805</td><td>100 g/80 ml</td></tr></tbody></table>

dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Samice ssaków rozmnażające się płciowo rodzą się z zapasem oocytów przez całe życie. Niedojrzałe, spoczynkowe oocyty znajdują się w pierwotnych pęcherzykach, jednostce magazynującej żeńskiej linii rozrodczej. Są nieodnawialne, dlatego ich liczba przy urodzeniu i późniejsze tempo utraty w dużej mierze decyduje o długości płodnego życia kobiet. Dokładne określenie ilościowe liczby pęcherzyków jajnikowych u kobiet i zwierząt ma zasadnicze znaczenie dla określenia wpływu leków i substancji toksycznych na rezerwę jajnikową. Jest to również niezbędne do oceny zapotrzebowania i sukcesu istniejących i pojawiających się technik zachowania płodności. Obecnie nie istnieją metody pozwalające na dokładny pomiar liczby pęcherzyków pierwotnych składających się na rezerwę jajnikową u kobiet. Co więcej, pozyskanie tkanki jajnikowej od dużych zwierząt lub gatunków zagrożonych wyginięciem w celach doświadczalnych jest często niewykonalne. W związku z tym myszy stały się niezbędnym modelem dla takich badań, a zdolność do oceny pierwotnej liczby pęcherzyków w całych jajnikach myszy jest kluczowym narzędziem. Jednak doniesienia o bezwzględnej liczbie pęcherzyków w jajnikach myszy w literaturze są bardzo zmienne, co utrudnia porównywanie i/lub replikowanie danych. Wynika to z wielu czynników, w tym szczepu, wieku, grup leczenia, a także różnic technicznych w stosowanych metodach liczenia. W tym artykule przedstawiamy przewodnik instruktażowy krok po kroku dotyczący przygotowania wycinków histologicznych i liczenia pęcherzyków pierwotnych w jajnikach myszy przy użyciu dwóch różnych metod: [1] stereologii, która opiera się na technice frakcjonowania/dysekcji optycznej; oraz [2] technika bezpośredniego liczenia. Podkreślone zostaną niektóre z kluczowych zalet i wad każdej z metod, tak aby można było poprawić odtwarzalność w tej dziedzinie i umożliwić naukowcom wybór najbardziej odpowiedniej metody dla ich badań.

Wykorzystano dobrze scharakteryzowany model wyczerpania pęcherzyków, w którym młodym dorosłym myszom żeńskim podano pojedynczą dawkę chemioterapii cyklofosfamidem lub kontrolną sól fizjologiczną (n=5/grupa), a po 48 godzinach pobrano oba jajniki od każdego zwierzęcia. Jeden jajnik od każdego zwierzęcia przygotowano zgodnie z opisem w Kroku 1 dla każdej z dwóch metod: stereologii lub bezpośredniego przeliczania. Lewy i prawy jajnik od każdego zwierzęcia przypisano losowo do każdej grupy. Dane te pokazują, że przy zastosow...

Tutaj opisujemy, porównujemy i kontrastujemy dwie różne techniki dokładnego liczenia pęcherzyków w stałych tkankach jajnika myszy.

Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Mamy nadzieję, że te dogłębne protokoły pomogą zwiększyć odtwarzalność w naszej dziedzinie, a jednocześnie umożliwią naukowcom podjęcie świadomej decyzji przy wyborze metody rozliczania dla ich badań. Ponieważ wykorzystuje kilka parametrów próbkowania, stereologia jest bardzo czuła i dokładna. Jednak bezpośrednie liczenie jest szybsze i łatwiejsze i można je przeprowadzić na próbkach przygotowanych przy użyciu standardowych technik histologicznych.Stereologia jest wykorzystywana w badaniach biologii jajników do oceny wpływu substancji toksycznych na rezerwy jajnikowe. Może być również stosowany w naukach przyrodniczych do badań nad nerkami i mózgiem. Zapoznanie się z morfologią mieszków włosowych wymaga doświadczenia.Wykorzystanie wcześniejszych badań do zdefiniowania morfologii wraz z ustaleniem ustandaryzowanych kryteriów klasyfikacji może pomóc w utrzymaniu spójności. Aby oszacować pierwotną liczbę pęcherzyków na podstawie stereologii za pomocą frakcjonatora optycznego, włącz komputer, wielofunkcyjną jednostkę sterującą, kamerę i źródło światła w konfiguracji stereologii i ustaw obiektyw mikroskopu na małe powiększenie. Otwórz oprogramowanie stereologiczne i bezpiecznie umieść p

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Wysoce obiecującą techniką generowania konstruktów tkankowych bez użycia matrycy jest hodowla komórek w symulowanych warunkach mikrograwitacji. Korzystając z systemu hodowli rotacyjnej, zbadaliśmy wzrost pęcherzyków jajnikowych i dojrzewanie oocytów pod kątem przeżycia pęcherzyków, morfologii, wzrostu i funkcji oocytów w symulowanych warunkach mikrograwitacji.

In vitro Wzrost pęcherzyków przedantralnych myszy w symulowanej mikrograwitacji

Tutaj prezentujemy protokół do nieinwazyjnej oceny kompetencji rozwojowych oocytów przeprowadzanej podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego do etapu metafazy II. Metoda ta łączy obrazowanie poklatkowe z prędkością obrazu cząstek (PIV) i analizami sieci neuronowych.

Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Ten protokół opisuje dokładną, tanią, szybką i nietoksyczną metodę określania płci zarodka świni z dnia 30 za pomocą metody PCR po zmieleniu zarodka na proszek bez ekstrakcji chloroformem fenolowym i oczyszczania kolumny DNA.

Dokładne i wolne od fenolu określanie płci DNA zarodków świń w dniu 30 za pomocą PCR

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Udostępniamy protokół obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii nabłonkowych komórek macierzystych w żywej tkance jajnika Drosophila. Opisujemy metody generowania transgenicznych muszek wykazujących ekspresję biosensora pH, mCherry::p Hluorin, obrazowania biosensora za pomocą ilościowego obrazowania fluorescencyjnego, generowania krzywych standardowych i konwersji wartości intensywności fluorescencji na wartości pH.

Metody obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii komórek macierzystych pęcherzyka w żywej tkance jajnika Drosophila

Poznaj dwie techniki liczenia pęcherzyków w tkankach jajników myszy: stereologię i bezpośrednie zliczanie. Porównaj ich dokładność, czułość oraz łatwość wykonania, aby wybrać optymalną metodę dla badań biologii jajnika.

Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów