Name: Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego profilowania degradacji białek w żywych komórkach przy użyciu technologii HiBiT CRISPR. Protokół umożliwia ilościowe określanie kinetyki degradacji i parametrów Dmax.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.M.R, S.D.M., M.U. i D.L.D są pracownikami Promega Corporation

1. Badania degradacji końcowej z wykorzystaniem białek docelowych CRISPR HiBiT w formacie litycznym z opcjonalną fluorescencyjną analizą żywotności komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie i wysiew ssaczej linii komórkowej adherentnej lub w zawiesinie
	<ol>
		<li>Dostosuj gęstość komórek do poziomu 2,22 x 105/ml poprzez rozcieńczenie w odpowiedniej pożywce komórkowej stosowanej do pasażowania i wzrostu komórek.</li>
		<li>Rozdzielić komórki do płytek, zachowując minimum 3 studzienki na każdy wariant eksperymentalny oraz kontrolny. Rozdzielić 90 µL (20 000 komórek) zawiesiny komórkowej na każdą studzienkę białych płytek 96-dołkowych. W przypadku formatu 384-dołkowego należy nanieść 36 µL (8000 komórek) zawiesiny komórkowej na dołek w białych płytkach 384-dołkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i dodawanie związków
	<ol>
		<li>Przygotować płytki z PROTAC lub badanym związkiem degradującym w szeregowych rozcieńczeniach o stężeniu końcowym 1000x w 100% DMSO. Następnie rozcieńczyć go do stężenia końcowego 10x w pożywce hodowlanej. Do pożywki dodać równą objętość DMSO, która posłuży jako kontrola DMSO bez związku.</li>
		<li>W przypadku formatu 96-dołkowego dodać 10 µL 10-krotnych roztworów związku i roztworów kontrolnych do 90 µL komórek. W przypadku formatu 384-dołkowego dodać 4 µL 10-krotnych roztworów związków i roztworów kontrolnych do 36 µL komórek.</li>
		<li>Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO22 przez pożądany czas lub w warunkach optymalnych dla ich wzrostu. 
		UWAGA: Ponieważ jest to test końcowy, badanie wielu punktów czasowych będzie wymagało przygotowania oddzielnych płytek do degradacji dla każdego punktu czasowego, zgodnie z opisem w powyższym kroku 1.1.2. Czas inkubacji niezbędny do wykrycia degradacji indukowanej związkiem jest bardzo zróżnicowany i prawdopodobnie zależy również od stężenia związku. Sugerowane początkowe punkty czasowe to 6 h i 24 h.</li>
		<li>W przypadku pomiaru końcowej luminescencji bez opcjonalnego pomiaru żywotności komórek, należy przejść bezpośrednio do kroku 1.3 poniżej. W przypadku przeprowadzania analizy multipleksowej z pomiarem żywotności komórek, należy przejść do następnej sekcji 1.4 poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar lityczny komórek
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed wykonaniem pomiarów litycznych HiBiT należy przygotować 2x odczynnik do detekcji litycznej poprzez dodanie 20 µL podłoża litycznego i 10 µL białka LgBiT na każdy 1 ml buforu litycznego. Przygotować odpowiednią ilość 2x odczynnika detekcyjnego dla liczby studni przeznaczonych do analizy, uwzględniając dodatkową objętość w celu zniwelowania błędów pipetowania (tj. liczba studni + 10%).</li>
		<li>Dodać przygotowany odczyn do detekcji litycznej do komórek. W przypadku formatu 96-dołkowego dodać 100 µL 2x odczynnika do detekcji litycznej do każdej studzienki zawierającej 100 µL komórek. W przypadku formatu 384-dołkowego dodać 40 µL 2x odczynnika do detekcji litycznej do każdej studzienki zawierającej 40 µL komórek. Mieszaj płytkę na wstrząsarku do mikro płytek przez 10–20 min przy 350 obr./min.</li>
		<li>Pomiar luminescencji należy przeprowadzić za pomocą luminometru umożliwiającego odczyt luminescencji z płytki 96- lub 384-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalne multipleksowanie żywotności komórek 
	UWAGA: Ten etap jest wykonywany przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu CellTiter-Fluor (CTF) (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Na 30–40 minut przed planowanym pomiarem punktu końcowego przygotować 6-krotny roztwór odczynnika do wykrywania żywotności komórek poprzez dodanie 10 µL podłoża do 2 ml buforu do analizy. Należy przygotować odpowiednią ilość odczynnika 6x dla każdej analizowanej studzienki, uwzględniając dodatkową objętość na błędy pipetowania (tzn. liczba studzienek + 10%).</li>
		<li>Należy dodać przygotowany odczynnik do dołków. W przypadku formatu 96-dołkowego należy dodać 20 µL odczynnika 6x do każdej studzienki zawierającej już 100 µL objętość. Dla formatu 384-dołkowego dodać 8 µL 6x odczynnika do każdej studzienki zawierającej 40 µL komórek. Wymieszać krótko za pomocą wstrząsarki do mikropłytek, a następnie inkubować płytkę przez 30 min w 37 °C inkubator.</li>
		<li>W wyznaczonym punkcie końcowym pomiaru (tj. 6 lub 24 h po zastosowaniu preparatu, krok 1.2.3), zmierz fluorescencję przy użyciu urządzenia zdolnego do odczytu fluorescencji (380–400 nm)Ex/505 nmEm) w formacie 96- lub 384-dołkowym.</li>
		<li>Przygotować 2x odczynnik do detekcji litycznej poprzez dodanie 20 µL podłoża litycznego i 10 µL białka LgBiT na 1 ml buforu litycznego. Przygotować odpowiednią ilość 2-krotnego odczynnika detekcyjnego dla liczby studzienek do analizy, uwzględniając dodatkową objętość na błędy pipetowania (np. liczba studzienek + 10%).</li>
		<li>Do studni dodać przygotowany odczyn do detekcji lizy. W przypadku formatu 96-dołkowego dodać 120 µL 2x odczynnika do detekcji litycznej do każdej studni zawierającej już 120 µL objętość. W przypadku formatu 384-dołkowego dodać 48 µL 2x odczynnika do detekcji litycznej do każdej studzienki zawierającej już 48 µL objętość. Mieszaj płytkę na wstrząsarze do mikropłytek przez 10–20 min.</li>
		<li>Pomiar luminescencji należy przeprowadzić za pomocą luminometru zdolnego do odczytu luminescencji w płytkach 96- lub 384-dołkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowe określenie degradacji i żywotności komórek
	<ol>
		<li>Oblicz średnią wartość względnych jednostek światła (RLU) dla kontroli DMSO w danym punkcie czasowym. Wartość tę należy przyjąć jako bazowy poziom białka docelowego do obliczenia frakcyjnej degradacji, normalizując do niej wyniki wszystkich pozostałych badanych preparatów w tym samym punkcie czasowym. Na przykład, jeśli średnia wartość RLU dla studzienek z kontrolą DMSO po 6 h wynosiła 10 000, a wartość RLU dla konkretnego związku po 6 h wynosiła 5 000, frakcyjną degradację oblicza się następująco: 5 000 ÷ 10 000 = 0,5 (Równanie 1). 
		Równanie 1: <img alt="Równanie przedstawiające obliczanie ułamkowej wartości RLU dla eksperymentów PROTAC; stosunek sygnałów luminescencyjnych." src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie"></li>
		<li>Wyznacz procent degradacji na podstawie ułamkowych jednostek RLU: 
		Równanie 2: <img alt="Równanie stanu równowagi statycznej, (1 - ułamkowa wartość RLU)*100 = % degradacji, stosowane do analizy degradacji." src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie"></li>
		<li>Nanieś na wykres ułamkową wartość RLU lub % degradacji w określonych punktach czasowych, aby uszeregować aktywność związków.</li>
		<li>Opcjonalnie można przeanalizować dane dotyczące względnych jednostek fluorescencji (RFU) dla pomiaru testu żywotności komórek, porównując wartości dla wszystkich wariantów z kontrolą DMSO. Jeśli dla któregokolwiek wariantu zaobserwowano istotny spadek RFU w stosunku do kontroli DMSO, dane dotyczące degradacji można dodatkowo znormalizować względem danych z testu żywotności komórek, aby określić zmiany poziomu białka w relacji do spadku żywotności komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kinetyka degradacji białek docelowych CRISPR z tagiem HiBiT w czasie rzeczywistym i opcjonalny luminescencyjny test żywotności komórek
UWAGA: Możliwość przeprowadzenia screeningu kinetycznego i analizy degradacji wymaga koekspresji białka LgBiT w komórce, co zostało opisane wcześniej18,19,63. Można to osiągnąć poprzez przejściową transfekcję wektora LgBiT, zastosowanie BacMam LgBiT lub poprzez wykonanie insercji HiBiT za pomocą CRISPR w stabilnej linii komórkowej LgBiT.
<ol>
	<li>Wysiew linii komórek adherentnych.
	<ol>
		<li>Usunąć medium z kolby za pomocą aspiratora, przemyć komórki DPBS, dysocjować komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA i odczekać do pełnej dysocjacji komórek z dna kolby. W przypadku linii komórek w zawiesinie przejść do sekcji 2.2.</li>
		<li>Zneutralizować trypsynę za pomocą pożywki hodowlanej z dodatkiem surowicy, wymieszać w celu zebrania i resuspensji komórek, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej.</li>
		<li>Wirować komórki przy 125 x g przez 5 min. Odlać pożywkę hodowlaną i resuspenderować w równym objętości świeżej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Wysiać komórki na płytki analityczne, zapewniając minimum trzy powtórzenia dla każdego stanu badawczego i kontrolnego. Dla formatu 96-dołkowego ocenić gęstość komórkową, dostosować ją do poziomu 2 x 105 komórek/mL w medium analitycznym i nanieść 100 µL (20 000 komórek) na dołek w płytce 96-dołkowej. Dla formatu 384-dołkowego ocenić gęstość komórkową, dostosować ją do poziomu 4,44 x 105 komórek/mL w medium analitycznym i nanieść 18 µL (8 000 komórek) na dołek.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez noc lub w warunkach optymalnych dla ich wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew komórek w zawiesinie
	<ol>
		<li>Dostosować gęstość komórkową do poziomu 2,22 x 105 komórek/mL w medium niezależnym od CO2 uzupełnionym o 10% FBS i 1x Endurazine (rozcieńczenie 1:100 roztworu zapasowego).</li>
		<li>Wysiać komórki na płytki analityczne, zapewniając minimum 3 dołki dla każdego stanu badawczego i kontrolnego. Dla formatu 96-dołkowego nanieść 90 µL (20 000 komórek) na dołek. Dla formatu 384-dołkowego nanieść 36 µL (8 000 komórek) na dołek. 
		UWAGA: W przypadku linii komórek w zawiesinie o niskim stosunku sygnału do tła (S:B) luminescencji, np. podczas pracy z pulami CRISPR zamiast klonów, można zwiększyć luminescencję poprzez zwiększenie liczby wysiewanych komórek, do 100 000 komórek/dołek w formacie 96-dołkowym lub 40 000 komórek/dołek w formacie 384-dołkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kinetyczne analizy degradacji z użyciem komórek HiBiT CRISPR wykazujących ekspresję LgBiT
	<ol>
		<li>W przypadku komórek w zawiesinie zawierających już Endurazine, który został dodany na etapie wysiewu w punkcie 2.2., przejść bezpośrednio do kroku 2.3.3. Dla linii komórek adherentnych przygotować roztwór Nano-Glo Endurazine. Dla formatu 96-dołkowego przygotować roztwór 1x Endurazine, rozcieńczając odczynnik zapasowy 1:100 w medium niezależnym od CO2 uzupełnionym o 10% FBS. Dla formatu 384-dołkowego przygotować roztwór 2x Endurazine, rozcieńczając odczynnik zapasowy 1:50 w medium niezależnym od CO2 uzupełnionym o 10% FBS.</li>
		<li>Dodać roztwór Endurazine do każdego dołka z komórkami adherentnymi. Dla formatu 96-dołkowego odessać medium i dodać 90 µL roztworu 1x Endurazine. Dla formatu 384-dołkowego dodać 18 µL roztworu 2x Endurazine do 18 µL komórek. Nie odsysać medium, ponieważ analiza degradacji w formacie 384-dołkowym jest przeprowadzana w mieszaninie 50:50 pożywki hodowlanej i medium niezależnego od CO2.</li>
		<li>Inkubować płytki z komórkami w zawiesinie lub adherentnymi zawierające Endurazine przez 2,5 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby umożliwić wyrównanie poziomu luminescencji.</li>
		<li>Przygotować 10-krotne stężenie miareczkowania testowanego PROTAC w medium niezależnym od CO2 i dodać 10 µL do każdego dołka w płytce 96-dołkowej lub 4 µL w płytce 384-dołkowej. Dla związków o nieznanej skuteczności zaleca się stężenie końcowe 1-10 µM w najwyższym punkcie jako punkt wyjścia.</li>
		<li>Zbierać pomiary kinetyczne luminescencji w lumnometrze uprzednio wyrównanym do 37 °C w okresie od 0 do 48 h. Interwały czasowe pomiarów można dostosować do każdego eksperymentu, ale zalecanym początkowym eksperymentem byłyby pomiary luminescencji co 5-15 min przez 24 h lub wybrany czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalna analiza multipleksowa żywotności komórek w tym samym dołku po końcowym pomiarze kinetycznym 
	UWAGA: Analiza ta jest przeprowadzana przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu CellTiter-Glo (CTG) (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dostosować temperaturę odczynnika CTG do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Po pomiarze degradacji w ostatnim punkcie czasowym analizy kinetycznej, dodać 100 µL (płytka 96-dołkowa) lub 40 µL (płytka 384-dołkowa) odczynnika na dołek, a następnie mieszać na potrząsaczu do płytek z prędkością 500-700 rpm (płytka 96-dołkowa) lub w mikropłytkowym wstrząsacu (płytka 384-dołkowa) przez 5 min.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby umożliwić lizę komórek i wygaszenie sygnału HiBiT.</li>
		<li>Zmierzyć całkowitą luminescencję w lumnometrze zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja profilów kinetycznej degradacji
	<ol>
		<li>Wykorzystując zebrane pomiary kinetyczne luminescencji, znormalizować surowe wartości RLU dla każdego stężenia PROTAC względem średniej wartości dla powtórzeń w warunkach DMSO w każdym punkcie czasowym, aby uwzględnić zmiany stężenia wolnej furimazyny w czasie. Obliczyć ułamkowe RLU zgodnie z Równaniem 1. 
		Równanie 1: <img alt="Równanie pokazujące obliczanie ułamkowego RLU dla eksperymentów PROTAC; stosunek sygnałów luminescencyjnych." src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie "></li>
		<li>Na podstawie krzywych degradacji dopasować jednoskładnikowy model wykładniczego zaniku zgodnie z Równaniem 2 do początkowej części degradacji każdej krzywej, aż do punktu, w którym dane osiągną plateau. 
		UWAGA: Pomocne może być wykluczenie z dopasowania pierwszych kilku punktów danych, ponieważ może wystąpić krótka faza opóźnienia przed zaobserwowaniem degradacji. 
		Równanie 2: <img alt="Wzór wykładniczego zaniku, y=(y0-Plateau)e^(-λt)+Plateau, do analizy i dopasowania danych." src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie "></li>
		<li>Z Równania 2 wyznaczyć parametr ƛ, który reprezentuje stałą szybkości degradacji, oraz Plateau, który reprezentuje najniższą pozostałą ilość białka.</li>
		<li>Obliczyć Dmax, czyli maksymalną ułamkową ilość zdegradowanego białka, obliczaną jako 1-Plateau.</li>
		<li>Wykreślić Dmax dla każdego stężenia PROTAC, aby wyznaczyć niezależną od czasu krzywą mocy degradacji.</li>
		<li>Wyznaczyć wartość Dmax50 dla wykresu z punktu 2.3.5, aby przeanalizować skuteczność związków. 
		UWAGA: Aby wyznaczyć DC50 w konkretnym punkcie czasowym, należy wykreślić obliczony procent degradacji dla każdego stężenia w wybranym czasie. Może to być określone jako DC50 t=4 h lub DC50 t=12 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Promega Corporation jest właścicielem komercyjnym poprzez cesję patentów na technologie i zastosowania HiBiT i NanoLuc.

Przedstawiamy tutaj dwie metody przesiewowej aktywności związku degradacji w formacie litycznym punktu końcowego lub w trybie kinetycznym żywych komórek. Podejścia te opierają się na tych samych zasadach pomiaru luminescencyjnego, ale zapewniają różne poziomy szczegółowości i zrozumienia. Wybór któregokolwiek z tych podejść będzie prawdopodobnie zależał od celów przesiewowych i wielkości biblioteki złożonej. W przypadku dużych pokładów przesiewowych związków chemicznych lub przesiewowych wstępnych w celu obserwacji wykrywalnej degradacji, badania przesiewowe lityczne punktów końcowych zapewniają czułą i wydajną kompatybilność o wysokiej przepustowości, podczas gdy inne podejścia do punktów końcowych, takie jak western blot lub spektrometria mas, mogą być albo niepraktyczne, albo trudne do dostosowania14. Punktem wyjścia dla tych badań przesiewowych można było przeprowadzić przy ograniczonej liczbie stężeń i punktów czasowych. Zalecane stężenia początkowe do badania mieszczą się w zakresie 100 nM-10 μM, aby uwzględnić początkowe degradery o niskiej sile działania, słabej przepuszczalności lub, w niektórych przypadkach z bardzo silnymi związkami, obecność efektu haka. Ponadto zaleca się zbadanie co najmniej dwóch różnych punktów czasowych w celu ustalenia wczesnego początku degradacji po 4-6 godzinach oraz utajonej lub trwałej degradacji po 18-24 godzinach. Związki, które wykazują wysoką siłę degradacji i mechanizm on-target, są łatwo obserwowane w ciągu 4-6 godzin, podczas gdy degradacja lub pozorna utrata białka obserwowana dopiero w późniejszych punktach czasowych może być spowodowana różnymi mechanizmami. Zdecydowanie zaleca się monitorowanie żywotności komórek zarówno we wczesnym, jak i późnym punkcie czasowym, tak aby utrata białka mogła być oddzielona od utraty spowodowanej śmiercią komórki. Podobnie jak w przypadku każdego rodzaju testu luminescencyjnego lub fluorescencyjnego, istnieje możliwość, że związki w bibliotekach będą zakłócać lub hamować sygnał, dlatego ortogonalne eksperymenty uzupełniające ze związkami ołowiu wykorzystującymi niepowiązane fuzje lub alternatywne podejścia do monitorowania poziomu białka będą ważne dla oceny, czy utrata RLU w tych testach jest bezpośrednio związana z degradacją białka docelowego.
Zdolność do badania przesiewowego w formacie kinetycznym żywej komórki przez dłuższy czas zależy w dużej mierze od sygnału testowego do tła (S:B). Czynniki, które przyczyniają się do S:B, obejmują poziom ekspresji samego białka docelowego, który może obejmować kilka rzędów wielkości, wydajność ekspresji LgBiT w linii komórkowej wybranej do insercji peptydu, oraz dostępność oznaczonego celu do uzupełnienia w jego różnych natywnych kompleksach. Ustaliliśmy ogólny wymóg odcięcia składający się z S:B wynoszącego 15, aby skutecznie zmierzyć degradację w trybie kinetycznym za pomocą endurazyny lub wiwazyny. S: B określa się, mierząc sygnał wyjściowy komórek edytowanych przez HiBiT koeksprymujących LgBiT w stosunku do nieedytowanych komórek rodzicielskich eksprymujących LgBiT samodzielnie w obecności żywych substratów komórkowych endurazyny lub wiwazyny. Wiwazyna wytwarza silniejszy sygnał luminescencyjny, ale zanika szybciej niż endurazyna i może ograniczać akwizycję sygnału do 24 godzin lub mniej. Co więcej, S:B może być również w dużym stopniu zależny od tego, czy używane są pule CRISPR, czy klony. W przypadku celów w liniach komórkowych, które są bardziej podatne i mają wysoką wydajność w inżynierii CRISPR/Cas9, heterogeniczna populacja puli CRISPR edytowanych komórek może mieć wystarczającą ilość S:B do analizy kinetycznej. W przypadku celów w trudniejszych liniach komórkowych, w których mniej wydajna integracja genomowa za pomocą CRISPR skutkuje pulami o niskim S:B, izolacja klonów CRISPR może być konieczna w celu wzbogacenia edytowanych populacji i osiągnięcia wystarczająco wysokiego S:B do analizy kinetycznej. W każdym z tych scenariuszy, jeśli S:B jest mniejsze niż 15 z substratami enduraziny lub wiwazyny, zaleca się badanie przesiewowe lityczne punktu końcowego.
W celu lepszego zrozumienia i scharakteryzowania związków, w tym określenia profilu degradacji z parametrami ilościowymi, zalecanym podejściem przesiewowym jest analiza kinetyczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach14,18. Podobnie jak omówiona powyżej analiza końcowa, wstępne kinetyczne badania przesiewowe można przeprowadzić przy ograniczonej liczbie stężeń w zakresie 100nM-10μM w sposób wysokoprzepustowy. W formacie 384-dołkowym ponad 100 związków można łatwo przesiać w trzech egzemplarzach w jednym stężeniu na jednej płytce. Uzyskane w ten sposób profile degradacji dostarczą wskazówek nie tylko co do zaobserwowanego zakresu degradacji, ale także szybkości degradacji, czasu trwania degradacji i potencjalnego odzysku białka14,18 (Rysunek 2 i Rysunek 3). Kształty profilu degradacji również dostarczają cennych informacji. Specyficzne i silne degradery często wykazują początkową szybką utratę białka docelowego do plateau w ciągu kilku godzin18,53, podczas gdy inne mechanizmy, takie jak transkrypcyjne sprzężenie zwrotne lub toksyczność związków, zwykle powodują bardziej liniową utratę białka w czasie. Te szczegóły i niuanse są pomijane w analizie litycznej punktów końcowych, a przy analizie w czasie rzeczywistym w ciągu 24-48 godzin nie trzeba przewidywać czasu, aby uchwycić prawdziwy Dmax w zestawach nowych lub nieznanych związków.
Kinetyka w czasie rzeczywistym pozwala również na efektywne badanie przesiewowe odpowiedzi na dawkę w celu lepszego zrozumienia skuteczności związku, jego wpływu na początkową szybkość degradacji oraz oferuje możliwości klasyfikowania związków na podstawie więcej niż jednego parametru. Klasyczne pomiary siły degradacji obejmują obliczenia DC50 w określonym momencie w oparciu o maksima pozornej degradacji. W przeciwieństwie do tego, nasze kinetyczne podejście do oceny siły działania uwzględnia prawdziwe maksimum degradacji przy każdym stężeniu, niezależnie od tego, kiedy występuje w czasie18. Nazywamy ten pomiar siły degradacji kinetycznej Dmax5018. Analiza w ten sposób uwzględnia związki, które mogą inicjować degradację wolniej przy niższych stężeniach, a zatem potrzebują więcej czasu po obróbce, aby osiągnąć Dmax. Szczególnie pouczające może być uszeregowanie związków zarówno pod względem szybkości degradacji, jak i Dmax. W przypadku najsilniejszych degraderów spowoduje to dalsze odróżnienie powolnych, ale silnych degraderów od tych, które są zarówno szybkie, jak i silne. Łącznie, zarówno badania przesiewowe lityczne, jak i kinetyczne żywych komórek z wykorzystaniem linii komórkowych HiBiT CRISPR są potężnymi podejściami, które dają bardziej kompleksowy obraz ukierunkowanej degradacji białek, funkcji związków i umożliwiają proces przesiewowy od wstępnej oceny aktywności do dalszej optymalizacji chemicznej poprzez poprawę kluczowych parametrów degradacji.

Ukierunkowana degradacja białek stała się jednym z najszybciej rozwijających się obszarów w odkrywaniu leków małocząsteczkowych, znacznie wzmocnionym przez sukces terapeutyczny immunomodulujących molekularnych związków kleju (np. IMiD) w leczeniu raka, oraz obiecujące wczesne dane z badań klinicznych związków chimery ukierunkowanych na proteolizę1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Ukierunkowane związki degradacji białek działają poprzez zbliżenie docelowego białka z białkami maszynowymi ligazy E31,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Ta indukowana związkiem rekrutacja białka docelowego do ligazy E3 prowadzi do ubikwitynacji i degradacji białka docelowego poprzez szlak proteasomalny ubikwityny (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Historycznie rzecz biorąc, programy badań przesiewowych w celu odkrywania leków małocząsteczkowych opierały się na wstępnych testach biochemicznych w celu oceny aktywności i uszeregowania związków rzędu. Stanowi to jednak poważne wyzwanie dla docelowych degraderów białek, których ostateczna aktywność, degradacja przez proteasom, zależy od kaskady zdarzeń komórkowych1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17,18. Mnogość szlaków i złożoność kompleksów białkowych wymaganych do pomyślnej degradacji celu wymaga podejść do testów komórkowych w celu wczesnego badania przesiewowego i selekcji początkowych związków. Obecnie zdecydowanie brakuje technologii monitorowania degradacji białek docelowych w sposób wysokoprzepustowy w kontekście środowiska komórkowego14. Tutaj przedstawimy protokoły do oceny aktywności degradacji litycznej żywej żywej komórki lub punktu końcowego w czasie rzeczywistym przy użyciu CRISPR/Cas9 endogennie oznakowanych docelowych linii komórkowych HiBiT18,19,20 do monitorowania utraty docelowego białka za pomocą pomiaru luminescencyjnego po leczeniu związkami degradującymi10,11,18,19.
Aby osiągnąć skuteczną degradację celów terapeutycznych i rozszerzyć proteom ulegający leczeniu, pojawiły się liczne podejścia i typy degraderów, które mogą celować w szeroki zakres białek do zniszczenia, w tym te zlokalizowane na lub w błonie plazmatycznej, lizosomach, błonach mitochondrialnych, cytoplazmie i jądrze21–57. Dwie podstawowe klasy najczęściej badanych związków to kleje molekularne i białka ukierunkowane na cimeras2,4,5,6,7,12,26. Kleje molekularne są monowalentne, a więc zazwyczaj mają mniejszy rozmiar i ułatwiają nowy interfejs interakcji białko-białko z białkiem docelowym po związaniu ze składnikiem ligazy E32,12,26. Są to najczęściej degradery, które wiążą się ze składnikiem ligazy Cereblon (CRBN) E32,12,26,55,56,57. Ostatnio jednak ekscytujące nowe przykłady wykorzystujące inne maszyny ligazy E3, takie jak DCAF1558,59,60 i rekrutacja CDK/Cyclin do DDB145 pokazują potencjał ekspansji tej klasy związków. W przeciwieństwie do tego, PROTAC są większymi, dwuwartościowymi cząsteczkami, składającymi się z docelowego liganda wiążącego, najczęściej inhibitora, połączonego za pomocą łącznika chemicznego z ligazą E3 uchwyt1,3,4,5,7,13. W związku z tym związki te są zdolne do bezpośredniego wiązania się zarówno z ligazą E3, jak i z białkiem docelowym1,3,4,5,7,13. Wykazano, że liczne białka są degradowane przez te dwuwartościowe cząsteczki, a najczęściej używane uchwyty ligazy E3 rekrutują się do CRBN lub Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Jednak liczba dostępnych uchwytów do rekrutacji ligazy E3 w chimerach ukierunkowanych na projekt proteolizy szybko rośnie, rozszerzając możliwości tej klasy związków o potencjał degradacji różnych klas docelowych, a także zwiększenia swoistości komórek lub typów tkanek24,48,61,62. W połączeniu z minimalnym wymogiem angażowania białka docelowego, nawet przy marginalnym powinowactwie, związki degradacyjne dają nadzieję na rozszerzenie proteomu podatnego na działanie leków.
Scharakteryzowanie komórkowej dynamiki utraty białka, jak również potencjalnej regeneracji białka po leczeniu, jest kluczowe dla zrozumienia funkcji i skuteczności związku degradacji. Chociaż możliwe jest badanie zmian poziomu białka endogennego w odpowiednich układach komórkowych za pomocą testów przeciwciał Western blot lub spektrometrii mas, podejścia te są trudne do dostosowania do formatów badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, mają ograniczoną zdolność kwantyfikacji lub zdolność do pomiaru zmian kinetycznych w wielu punktach czasowych14. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy komórkowy system luminescencyjny oparty na płytkach do monitorowania zmian poziomów białek endogennych, który wykorzystuje insercję genomową za pośrednictwem CRISPR/Cas9 znacznika 11 aminokwasów, HiBiT, do loci dowolnych kluczowych celów degradacji18,19,20. Peptyd ten uzupełnia się z wysokim powinowactwem do swojego partnera wiążącego, LgBiT, aby wytworzyć jasną luminescencję w obecności swojego substratu18,19,20,63, dzięki czemu te oznaczone endogenne białka świecą w komórkach lub lizatach18,19,20,63. Względne jednostki światła (RLU) mierzone za pomocą luminometru są wprost proporcjonalne do oznaczonych docelowych poziomów białka18,19,20,63. Wraz z rozwojem stabilizowanych substratów lucyferazy, możliwe są pomiary poziomu białka kinetycznego w czasie rzeczywistym w przedziałach czasowych 24-48 godzin18,53,64. Pozwala to na określenie pełnego profilu degradacji dla dowolnego celu przy dowolnym stężeniu związku, w tym analizę ilościową początkowej szybkości degradacji, maksimum degradacji (Dmax) i odzysku po traktowaniu związkiem18,53. Jednak w przypadku badań przesiewowych dużych bibliotek związków degradacyjnych analizę punktów końcowych można również łatwo przeprowadzić w formacie 384-dołkowym przy różnych stężeniach leku i wyznaczonych porach.
Protokoły przedstawione w tym manuskrypcie reprezentują strategie badań przesiewowych komórek dla ukierunkowanych związków degradacji białek, mające zastosowanie do wszystkich typów degraderów. Wykorzystanie linii komórkowych HiBiT CRISPR wraz z tymi protokołami nie ogranicza się jednak do degradacji białek, a raczej jest to ogólne narzędzie do monitorowania dowolnego endogennego poziomu białka docelowego, który można modulować po leczeniu w celu zbadania wpływu związków, a nawet mechanizmów oporności20,65,66. Warunkiem wstępnym dla tych metod wykrywania opartych na luminescencji jest endogennie znakowana linia komórek docelowych HiBiT CRISPR, która ma kluczowe znaczenie, ponieważ umożliwia czułe wykrywanie luminescencyjne, przy jednoczesnym zachowaniu endogennej ekspresji celu i natywnej regulacji promotora18,19,20. Poczyniono znaczne postępy w wykorzystaniu CRISRP/Cas9 do wstawiania znaczników genomowych, szczególnie w skalowalności20 i wysokiej czułości wykrywania, w różnych formatach, w tym pulach CRISPR lub klonach z heterozygotyczną lub homozygotyczną insercją alleli18,19,20. Możliwe jest stosowanie egzogennej ekspresji HiBiT lub innych fuzji reporterowych w komórkach zamiast znakowania endogennego, ale należy zachować znaczną ostrożność przy użyciu systemów z nadekspresją białek14,18. Mogą one prowadzić do artefaktów w zrozumieniu prawdziwej siły działania związku i dynamiki odzyskiwania białek14,18, w tym potencjalne pętle transkrypcyjnego sprzężenia zwrotnego aktywowane po degradacji celu. Ponadto związki we wczesnym stadium o niskiej sile działania mogą zostać pominięte i prezentować się jako fałszywie ujemne wyniki w badaniach przesiewowych. Ponieważ utrata białka może wynikać z toksyczności wywołanej związkiem i śmierci komórki, opisane tutaj protokoły zawierają wysoce zalecane, ale opcjonalne testy żywotności komórek, luminescencyjne lub fluorescencyjne w połączeniu z protokołem degradacji. Protokół składa się z dwóch głównych sekcji: litycznego punktu końcowego i kinetycznego badania przesiewowego żywych komórek. W każdej z tych sekcji znajdują się opcje multipleksowanych pomiarów żywotności komórek w formatach końcowych lub kinetycznych. Monitorowanie zmian znakowanego białka endogennego wymaga uzupełnienia LgBiT w komórkach. W związku z tym sekcja badań przesiewowych kinetycznych odwołuje się do ważnych protokołów dotyczących ich wprowadzenia, co można osiągnąć poprzez przejściową lub stabilną ekspresję i jest niezbędne do wykonywania pomiarów luminescencyjnych na żywych komórkach. Wszystkie przedstawione tutaj podejścia umożliwiają szybkie uporządkowanie rang i ocenę aktywności związków, umożliwiając badania przesiewowe związków na wczesnym etapie i szybszą identyfikację degraderów ołowiu.
Ten protokół jest przeznaczony do badania związków degradacyjnych w połączeniu z linią komórkową HiBiT CRISPR. Protokoły generowania wstawienia HiBiT CRISPR dla wielu celów zostały przedstawione w kilku ostatnich publikacjach18,19,20.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik CellTiter-Glo 2.0</td><td>Promega</td><td>G9241</td><td>Test luminescencyjny żywotności komórek</td></tr><tr><td>Test żywotności komórek CellTiter-Fluor</td><td>Promega</td><td>G6080</td><td>Test fluorescencyjny żywotności komórek</td></tr><tr><td>CO2-independent</td><td>ThermoFisher</td><td>18045-088</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Do rozcieńczania i kontroli związków</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Seradigm</td><td>89510-194</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>HEK293 Stabilna linia komórkowa LgBiT</td><td>Promega</td><td>N2672</td><td>Do uzupełnienia HiBiT w celu wytworzenia luminescencji</td></tr><tr><td>HiBiT CRISPR linia komórkowa ssaków</td><td>Promega</td><td></td><td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td></tr><tr><td>Roztwór higromycyny B</td><td>Gibco</td><td>10-687-010</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>LgBiT BacMam</td><td>Promega CS1956C01</td><td></td><td>Do uzupełnienia HiBiT w celu wygenerowania luminescencji</td></tr><tr><td>Wektor ekspresji LgBiT</td><td>Promega</td><td>N2681</td><td>Do uzupełnienia HiBiT w celu wygenerowania luminescencji</td></tr><tr><td>Czytnik</td><td></td><td></td> <td>płytek luminometruLuminomenter zdolny do pomiaru luminescencji i fluorescencji (np. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td></tr><tr><td>NanoGlo Endurazine Żywy</td><td>substrat Odczynnik kinetyczny Promega</td><td></td><td>N2570</td> HiBiT</tr><tr><td>NanoGlo Vivazine Żywy substrat Odczynnik</td><td>kinetyczny Promega</td><td></td><td>N2580</td></tr><tr><td>NanoGlo HiBiT Lytic System detekcji</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td>Enpoint litycznie HiBiT</td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowana pożywka surowicy, bez czerwieni fenolowej (ThermoFisher)</td><td>ThermoFisher</td><td>11058-021</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, białe, płytka 96-dołkowa</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, białe, płytka 384-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych hibit crispr

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Ukierunkowane związki degradacji białek, w tym kleje molekularne lub chimery ukierunkowane na proteolizę, są ekscytującą nową metodą terapeutyczną w odkrywaniu leków małocząsteczkowych. Ta klasa związków indukuje degradację białek poprzez zbliżenie białka docelowego i białek maszynerii ligazy E3 wymaganych do ubikwitynacji i ostatecznie degradacji białka docelowego poprzez szlak ubikwityna-proteasomal (UPP). Profilowanie degradacji białka docelowego w sposób wysokoprzepustowy pozostaje jednak dużym wyzwaniem, biorąc pod uwagę złożoność szlaków komórkowych wymaganych do osiągnięcia degradacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół i strategię badań przesiewowych opartą na zastosowaniu endogennego znakowania białek docelowych CRISPR/Cas9 za pomocą 11-aminokwasowego znacznika HiBiT, który uzupełnia się z wysokim powinowactwem do białka LgBiT, w celu wytworzenia białka luminescencyjnego. Te ukierunkowane na CRISPR linie komórkowe z endogennymi znacznikami mogą być używane do pomiaru degradacji indukowanej związkami w czasie rzeczywistym, kinetycznych żywych komórkach lub w trybie litycznym punktu końcowego poprzez monitorowanie sygnału luminescencyjnego za pomocą czytnika opartego na płytce luminescencyjnej. W tym miejscu przedstawiamy zalecane protokoły badań przesiewowych dla różnych formatów, a także opisujemy obliczanie kluczowych parametrów degradacji szybkości, Dmax, DC50, Dmax50, a także multipleksowanie z testami żywotności komórek. Podejścia te umożliwiają szybkie odkrywanie i klasyfikację związków we wczesnym stadium przy jednoczesnym utrzymaniu endogennej ekspresji i regulacji białek docelowych w odpowiednich tłach komórkowych, co pozwala na skuteczną optymalizację wiodących związków terapeutycznych.

Aby zademonstrować analizę litycznej degradacji w punkcie końcowym przy pojedynczym stężeniu, kilka białek docelowych CDK; CDK2, CDK4, CDK7 oraz CDK10 zostało endogennie oznakowane HiBiT na C-końcu w komórkach HEK293 i poddanych działaniu pan-kinazy PROTAC opartego na Cereblonie, TL12-186 w stężeniu 1 µM54 (Rysunek 1A). Poziom białek CDK mierzono w różnych punktach czasowych, a następnie określono frakcyjne RLU względem kontroli DMSO (Rysunek 1A). Każde białko CDK wykazało różny stopień degradacji w odpowiedzi na traktowanie związkiem w poszczególnych punktach czasowych (Rysunek 1A). Aby bezpośrednio porównać białka CDK pod kątem utraty białka, frakcyjne RLU z Rysunku 1A przeliczono na całkowity % degradacji i przedstawiono dla każdego punktu czasowego na Rysunku 1B. Pokazuje to, że nawet w wczesnych punktach czasowych, 2 lub 4 h, niektóre członkowie rodziny CDK wykazują wysoki poziom degradacji, który nadal wzrasta w czasie (Rysunek 1B).
Aby zademonstrować analizę kinetyki degradacji, każdy z białek z rodziny BET; BRD2, BRD3 i BRD4 został endogennie oznakowany HiBiT na N-końcu w komórkach HEK293 stabilnie eksponujących białko LgBiT18. Następnie poddano je działaniu trzech różnych stężeń pan-BET PROTACów; opartego na Cereblonie dBET650 (Rysunek 2A) oraz opartego na VHL ARV-77141 (Rysunek 2B). Pomiary kinetyczne zbierano przez okres 24 h, a z profili dla każdego stężenia wyraźnie widać różnice w odpowiedzi członków rodziny BET. Zdolność BRD2 do inicjowania szybszej odpowiedzi regeneracyjnej po zastosowaniu związku degradującego (Rysunek 2A,B) była wcześniej obserwowana przy użyciu innych pan-BET PROTACów i prawdopodobnie wynika z transkrypcyjnej odpowiedzi sprzężenia zwrotnego konkurencyjnej wobec procesu degradacji18.
Zarówno analiza końcowa (endpoint), jak i kinetyczna mogą być przeprowadzone przy zastosowaniu pełnych serii dawek związków. Na Rysunku 3 przedstawiono kinetyczne profile degradacji w odpowiedzi na dawkę podczas traktowania komórek Jurkat Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR stabilnie ekspresujących białko LgBiT czterema różnymi związkami typu „molecular glue”2,26,55,57: lenalidomidem (Rysunek 3A), iberdomidem (CC-220) (Rysunek 3B), talidomidem (Rysunek 3C) oraz pomalidomidem (Rysunek 3D). Degradery te wykazują istotne różnice w odpowiedzi degradacyjnej zarówno pomiędzy poszczególnymi związkami, jak i w obrębie serii stężeń (Rysunek 3).
Aby ilościowo ocenić degradację i uszeregować związki przedstawione na Rysunku 3, wykorzystano profile odpowiedzi na dawkę do obliczenia kluczowych parametrów degradacji, w tym szybkości degradacji (Rysunek 4A), wartości Dmax (Rysunek 4B) oraz wartości Dmax50 (Rysunek 4B). Analizy te wykazują, że iberdomid (CC-220) i pomalidomid charakteryzują się bardzo podobnymi, szybkimi początkowymi szybkościami degradacji (Rysunek 4A), jednak iberdomid (CC-220) wykazuje najwyższą aktywność, co potwierdzono we wcześniejszych badaniach ortogonalnych55,57 (Rysunek 4B). Ponieważ iberdomid wykazuje tak wysoką aktywność, a wszystkie testowane stężenia powodują degradację przekraczającą 50%, wartość Dmax50 uzyskana dla iberdomidu stanowi szacunek wynikający z ograniczeń w dokładnym dopasowaniu danych. Z wykresów na Rysunku 3C,D oraz Rysunku 4B wynika, że ani lenalidomid, ani talidomid nie degradują celu Ikaros/IKZF1 do końca przy najwyższych testowanych stężeniach. Ze względu na bardzo niską degradację obserwowaną przy zastosowaniu talidomidu, krzywe degradacji nie mogły zostać dokładnie dopasowane do modelu wykładniczego, w związku z czym nie określono ilościowo szybkości degradacji dla tej terapii. Najsilniejszym degraderem okazał się iberdomid (CC-220)55,57 (Rysunek 4B). Multiplexowe testy żywotności komórek nie wykazały spadku żywotności komórkowej dla testowanych stężeń (Rysunek 4C).
<img alt="Degradacja CDK w czasie; wykres liniowy i słupkowy; analiza rozkładu CDK2/4/7/10-HiBiT; badanie proteolizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Degradacja końcowa CDK i toksyczność przy użyciu pan-kinazowego PROTAC, TL12-18654. (A) Wybrany panel endogennych białek docelowych CDK z fuzją HiBiT na C-końcu za pomocą CRISPR/Cas9, poddanych ocenie degradacji pod wpływem 1 µM PROTAC TL12-18654 po 2 h, 4 h, 8 h i 24 h traktowania. Wartości przedstawiono jako ułamkową liczbę jednostek względnej luminescencji (RLU) w stosunku do kontroli DMSO mierzonej w każdym punkcie czasowym. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 3 powtórzeń technicznych. (B) Procent degradacji panelu białek docelowych CDK obliczony na podstawie (A), reprezentujący stopień degradacji każdego członka rodziny zaobserwowany w punktach czasowych 2, 4, 8 i 24 h. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 3 powtórzeń technicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Profile kinetyki degradacji rodziny BET; wykres dla traktowania dBET6 i ARV-771; frakcyjne RLU w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Profilowanie selektywności kinetyki degradacji członków rodziny BET za pomocą degraderów BET, dBET650 oraz ARV-77141.Profile kinetyki degradacji endogennych członków rodziny BET (BRD2, BRD3 i BRD4), znakowanych HiBiT na N-końcu za pomocą CRISPR/Cas9, po traktowaniu pojedynczymi stężeniami 1 nM (lewo), 10 nM (środek) lub 100 nM (prawo) PROTAC-ów dBET650 (A) lub ARV-77141 (B). Wartości przedstawiono jako frakcyjne RLU obliczone względem kontroli DMSO dla każdego punktu czasowego kinetyki. Słupki błędów reprezentują SD ze średniej z 4 powtórzeń technicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy zależności dawka-odpowiedź dla Ikaros IKZF1 dla czterech leków; analiza profilu kinetycznego, ułamkowe RLU w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Profile zależności dawka-odpowiedź kinetycznej degradacji żywych komórek Ikaros/IKZF1-HiBiT z panelem klejów molekularnych2,26,55,57. Komórki Jurkat stabilnie eksponujące białko LgBiT zostały zmodyfikowane za pomocą CRISPR/Cas9 w celu oznakowania końca C Ikaros/IKZF1 peptydem HiBiT. Komórki poddano działaniu serii 8 stężeń w zależności dawka-odpowiedź, w tym DMSO, dla czterech różnych związków z grupy klejów molekularnych2,26,55,57: (A) lenalidomidu, (B) iberdomidu (CC-220), (C) talidomidu lub (D) pomalidomidu. Luminescencję mierzono co 5 min przez łącznie 19,5 h. Dane jednostek względnych światła (RLU) z (A-D) przekształcono w ułamkowe RLU zgodnie z opisem w kroku 2.4.1 i przedstawiono na wykresie jako funkcję czasu. Słupki błędów reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy farmakodynamiczne: szybkość degradacji, maksimum oraz wyniki CellTiter Glo dla lenalidomidu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obliczanie szybkości degradacji i Dmax50 dla Ikaros/IKZF1-HiBiT oraz multipleksowe testy kondycji komórek. Dane kinetyki degradacji z Ryciny 3 zostały wykorzystane do obliczenia ilościowych parametrów degradacji. (A) Szybkości degradacji i (B) maksymalne wartości degradacji (Dmax) przedstawiono na wykresach dla każdego stężenia leku w przypadku wskazanych związków typu molecular glue2,26,55,57. (B) Wartości Dmax50 dla każdego związku obliczono przy użyciu modelu zależności od dawki z ograniczonym współczynnikiem nachylenia krzywej Hilla wynoszącym 1, co pozwala na uszeregowanie związków degradujących pod kątem konkretnego celu. (C) Testy żywotności komórek dla zależności od dawki degradacji iberdomidu (CC-220)55,57 z Ryciny 3B przeprowadzono jako pomiar końcowy po zakończeniu pomiarów kinetyki degradacji. Słupki błędu reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje ilościowe wykrywanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach, które zostały zaprojektowane przy użyciu CRISPR/Cas9 do ekspresji znacznika wykrywania endogennego białka wolnego od przeciwciał połączonego z białkiem docelowym. Dołączone są szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania i uzyskiwania ilościowych parametrów degradacji, szybkości, Dmax, DC50 i Dmax50.

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Takie podejście pozwala na komórkowe monitorowanie degradacji białek i szybkie badania przesiewowe związków degraderowych. Dynamika degradacji może być monitorowana w kontekście komórkowym w bardzo czuły i ilościowy sposób, co pozwala na dokładne określenie kluczowych parametrów degradacji. Metody te pozwalają na profilowanie HTS aktywności związków degradujących, umożliwiając segregację we wczesnej fazie odkrywania terapeutycznego.Zapewniają również wgląd każdemu, kto chce badać modulację endogennych poziomów docelowych, niezależnie od tego, czy rosną, czy maleją. Procedurę zademonstruje Celia Bisbach, naukowiec z mojego laboratorium. Zacznij od przygotowania i posiewu komórek przylegających lub zawiesinowych ssaków.Dostosuj gęstość komórek do 2,22 razy 10 do 5 komórek na mililitr i dozuj je do płytek z co najmniej trzema dołkami na warunki eksperymentalne i kontrolne. Przygotuj seryjnie rozcieńczone płytki PROTAC lub degrader o stężeniu 1000x w 100% DMSO. Następnie rozcieńczyć go do 10-krotności końcowego stężenia w pożywce do hodowli komórkowych.Dodaj równą objętość DMSO do pożywki, aby uzyskać bezskładnikową kontrolę DMSO. Dodaj odpowiednią ilość 10x związku lub roztworu kontrolnego do komórek na płytce i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Aby zmierzyć końcowy sygnał luminescencyjny, przygotuj 2x odczynnik do wykrywania litów, dodając 20 mikrolitrów substratu litycznego i 10 mikrolitrów białka LgBiT na każdy mililitr buforu litycznego.Przygotuj wystarczającą ilość odczynnika do wszystkich studzienek, które mają być oznaczone, w tym dodatkową objętość, aby uwzględnić błąd pipetowania. Dodać przygotowany odczynnik do detekcji litycznej do komórek i mieszać płytkę na mieszalniku wirowym do mikropłytek przez 10 do 20 minut przy 350 obr./min. Zmierz luminescencję na luminometrze zdolnym do odczytu płytki 96 lub 384-dołkowej.W przypadku korzystania z multipleksowania żywotności komórek, należy to zrobić przed dodaniem odczynnika litycznego. 30 do 40 minut przed pożądanym pomiarem końcowym należy przygotować 6-krotny roztwór odczynnika do wykrywania żywotności komórek, dodając 10 mikrolitrów substratu do dwóch mililitrów buforu testowego. Przygotowany odczynnik dodać do studzienek i krótko wymieszać na mieszadle wirowym do mikropłytek.Następnie inkubuj płytkę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W pożądanym punkcie końcowym zmierz fluorescencję na przyrządzie zdolnym do odczytu fluorescencji w formacie 96 lub 384 dołków. Przygotuj 2x odczynnik lityczny zgodnie z wcześniejszym opisem.Następnie dodaj odczynnik do studzienek i mieszaj płytkę na mieszalniku wirowym do mikropłytek przez 10 do 20 minut. Po wymieszaniu użyj luminometru do pomiaru luminescencji. Aby zademonstrować analizę degradacji litycznej punktu końcowego pojedynczego stężenia, kilka docelowych białek CDK endogennie znakowano HiBiT i traktowano PROTAC TL12-186 opartym na kinazie pan, opartym na cereblonie.Poziom białka CDK mierzono w różnych punktach czasowych i oznaczano frakcyjne RLU. Aby zrozumieć, w jaki sposób białka CDK bezpośrednio porównują się ze sobą pod względem utraty białka, frakcyjne RLU obliczono jako całkowity procent degradacji. Analizę degradacji kinetycznej przeprowadzono poprzez endogenne znakowanie białek należących do rodziny BET komórkami HiBiT i HEK293 stabilnie eksprymującymi białko LgBiT.Komórki zostały następnie potraktowane trzema różnymi stężeniami pan-BET PROTAC. Oparty na mózgu dBET6 i ARV-771 oparty na VHL. Przedstawiono profile degradacji odpowiedzi na dawkę kinetyczną komórek Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat stabilnie eksprymujących białko LgBiT poddane działaniu czterech różnych molekularnych związków kleju.Obserwuje się istotne różnice w reakcji degradacji między związkami, a także w różnych stężeniach. Aby ilościowo ocenić degradację i kolejność rang związków, profile odpowiedzi na dawkę wykorzystano do obliczenia kluczowych parametrów degradacji, w tym szybkości degradacji, maksimum degradacji i wartości Dmax50. Testy multipleksowe żywotności komórek nie wykazały utraty żywotności komórek dla badanych stężeń.Najważniejszymi krokami w tym protokole jest określenie ułamkowego RLU lub procentowej degradacji przez normalizację do kontroli DMSO. Postępując zgodnie z tym protokołem, można przeprowadzić test fenotypowy, aby zrozumieć, w jaki sposób utrata określonego białka może wpłynąć na zdrowie lub funkcję komórki. Ponadto te linie komórkowe HiBiT mogą być również wykorzystywane do badania interakcji białek lub wiązania małych cząsteczek przy użyciu technologii NanoBRET.

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.

Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Tutaj prezentujemy protokół edycji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą technologii CRISPR Cas do modyfikacji komórek CAR-T.

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje, jak używać metody analitycznej MEDUSA do ilościowego określenia efektu regulacji śmierci każdego nokautu genu. Zawiera instrukcje dotyczące określania warunków eksperymentalnych, które optymalizują czułość, oraz samouczek krok po kroku dotyczący wykonywania analizy.

MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć w danych z profilowania chemogenetycznego

Poznaj metodę wysokoprzepustowego profilowania degradacji białek w żywych komórkach przy użyciu technologii HiBiT CRISPR. Protokół umożliwia ilościowe określanie kinetyki degradacji i parametrów Dmax.

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

Przeglądaj więcej filmów