Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR
November 9th, 2020
Ten protokół opisuje ilościowe wykrywanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach, które zostały zaprojektowane przy użyciu CRISPR/Cas9 do ekspresji znacznika wykrywania endogennego białka wolnego od przeciwciał połączonego z białkiem docelowym. Dołączone są szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania i uzyskiwania ilościowych parametrów degradacji, szybkości, Dmax, DC50 i Dmax50.
Takie podejście pozwala na komórkowe monitorowanie degradacji białek i szybkie badania przesiewowe związków degraderowych. Dynamika degradacji może być monitorowana w kontekście komórkowym w bardzo czuły i ilościowy sposób, co pozwala na dokładne określenie kluczowych parametrów degradacji. Metody te pozwalają na profilowanie HTS aktywności związków degradujących, umożliwiając segregację we wczesnej fazie odkrywania terapeutycznego.
Zapewniają również wgląd każdemu, kto chce badać modulację endogennych poziomów docelowych, niezależnie od tego, czy rosną, czy maleją. Procedurę zademonstruje Celia Bisbach, naukowiec z mojego laboratorium. Zacznij od przygotowania i posiewu komórek przylegających lub zawiesinowych ssaków.
Dostosuj gęstość komórek do 2,22 razy 10 do 5 komórek na mililitr i dozuj je do płytek z co najmniej trzema dołkami na warunki eksperymentalne i kontrolne. Przygotuj seryjnie rozcieńczone płytki PROTAC lub degrader o stężeniu 1000x w 100% DMSO. Następnie rozcieńczyć go do 10-krotności końcowego stężenia w pożywce do hodowli komórkowych.
Dodaj równą objętość DMSO do pożywki, aby uzyskać bezskładnikową kontrolę DMSO. Dodaj odpowiednią ilość 10x związku lub roztworu kontrolnego do komórek na płytce i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Aby zmierzyć końcowy sygnał luminescencyjny, przygotuj 2x odczynnik do wykrywania litów, dodając 20 mikrolitrów substratu litycznego i 10 mikrolitrów białka LgBiT na każdy mililitr buforu litycznego.
Przygotuj wystarczającą ilość odczynnika do wszystkich studzienek, które mają być oznaczone, w tym dodatkową objętość, aby uwzględnić błąd pipetowania. Dodać przygotowany odczynnik do detekcji litycznej do komórek i mieszać płytkę na mieszalniku wirowym do mikropłytek przez 10 do 20 minut przy 350 obr./min. Zmierz luminescencję na luminometrze zdolnym do odczytu płytki 96 lub 384-dołkowej.
W przypadku korzystania z multipleksowania żywotności komórek, należy to zrobić przed dodaniem odczynnika litycznego. 30 do 40 minut przed pożądanym pomiarem końcowym należy przygotować 6-krotny roztwór odczynnika do wykrywania żywotności komórek, dodając 10 mikrolitrów substratu do dwóch mililitrów buforu testowego. Przygotowany odczynnik dodać do studzienek i krótko wymieszać na mieszadle wirowym do mikropłytek.
Następnie inkubuj płytkę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W pożądanym punkcie końcowym zmierz fluorescencję na przyrządzie zdolnym do odczytu fluorescencji w formacie 96 lub 384 dołków. Przygotuj 2x odczynnik lityczny zgodnie z wcześniejszym opisem.
Następnie dodaj odczynnik do studzienek i mieszaj płytkę na mieszalniku wirowym do mikropłytek przez 10 do 20 minut. Po wymieszaniu użyj luminometru do pomiaru luminescencji. Aby zademonstrować analizę degradacji litycznej punktu końcowego pojedynczego stężenia, kilka docelowych białek CDK endogennie znakowano HiBiT i traktowano PROTAC TL12-186 opartym na kinazie pan, opartym na cereblonie.
Poziom białka CDK mierzono w różnych punktach czasowych i oznaczano frakcyjne RLU. Aby zrozumieć, w jaki sposób białka CDK bezpośrednio porównują się ze sobą pod względem utraty białka, frakcyjne RLU obliczono jako całkowity procent degradacji. Analizę degradacji kinetycznej przeprowadzono poprzez endogenne znakowanie białek należących do rodziny BET komórkami HiBiT i HEK293 stabilnie eksprymującymi białko LgBiT.
Komórki zostały następnie potraktowane trzema różnymi stężeniami pan-BET PROTAC. Oparty na mózgu dBET6 i ARV-771 oparty na VHL. Przedstawiono profile degradacji odpowiedzi na dawkę kinetyczną komórek Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat stabilnie eksprymujących białko LgBiT poddane działaniu czterech różnych molekularnych związków kleju.
Obserwuje się istotne różnice w reakcji degradacji między związkami, a także w różnych stężeniach. Aby ilościowo ocenić degradację i kolejność rang związków, profile odpowiedzi na dawkę wykorzystano do obliczenia kluczowych parametrów degradacji, w tym szybkości degradacji, maksimum degradacji i wartości Dmax50. Testy multipleksowe żywotności komórek nie wykazały utraty żywotności komórek dla badanych stężeń.
Najważniejszymi krokami w tym protokole jest określenie ułamkowego RLU lub procentowej degradacji przez normalizację do kontroli DMSO. Postępując zgodnie z tym protokołem, można przeprowadzić test fenotypowy, aby zrozumieć, w jaki sposób utrata określonego białka może wpłynąć na zdrowie lub funkcję komórki. Ponadto te linie komórkowe HiBiT mogą być również wykorzystywane do badania interakcji białek lub wiązania małych cząsteczek przy użyciu technologii NanoBRET.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę ilościowego wykrywania kinetyki degradacji białek w żywych komórkach za pomocą technologii CRISPR/Cas9. Zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania parametrów degradacji, takich jak prędkość i Dmax.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Degradacja białek
- Technologia CRISPR/Cas9
Tło
- Rozumienie degradacji białek jest kluczowe dla zdrowia komórkowego.
- CRISPR/Cas9 pozwala na precyzyjne modyfikacje genetyczne.
- Monitorowanie degradacji może pomóc w odkrywaniu terapii.
- Metody ilościowe poprawiają dokładność badań nad degradacją.
Cel badania
- Opracowanie protokołu monitorowania degradacji białek w żywych komórkach.
- Możliwość wysokowydajnego przesiewowego badania związków degraderujących.
- Dostarczenie wglądu w modulacje endogennych poziomów białek.
Stosowane metody
- Przygotowanie i rozsiew komórek ssaków w określonych gęstościach.
- Seryjne rozcieńczanie związków PROTAC do testowania.
- Zastosowanie luminescencyjnych reagentów wykrywczych do pomiaru degradacji.
- Obliczanie parametrów degradacji na podstawie danych luminescencji.
Główne wyniki
- Skuteczne monitorowanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach.
- Identyfikacja znaczących różnic w odpowiedziach na degradację między związkami.
- Ilościowa ocena szybkości degradacji i maksymalnych wartości degradacji.
- Brak utraty żywotności komórek obserwowany podczas eksperymentów.
Wnioski
- Ten protokół ułatwia badanie dynamiki degradacji białek.
- Może być stosowany do oceny wpływu utraty białek na funkcje komórkowe.
- Linie komórkowe z oznaczeniem HiBiT są przydatne do badania interakcji białek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative, high-throughput assessment of targeted protein degradation in physiologically relevant cellular contexts, supporting early triage of degrader compounds. By maintaining endogenous expression and regulation of target proteins, it provides predictive confidence in lead optimization and reduces mechanistic ambiguity in discovery pipelines. The approach directly informs go/no-go decisions by linking compound-induced target degradation to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of target protein loss in native cellular environments.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying degradation kinetics and potency under physiological regulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating degradation rate, Dmax, and DC50 parameters for lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: CRISPR-engineered HiBiT cell lines provide standardized, reproducible systems for luminescent readout of target degradation.
- Multiplexing Capability: Compatible with cell viability assays to distinguish specific target effects from cytotoxicity during screening.
- Scalability: Luminescent signal detection in 96- or 384-well formats enables high-throughput profiling of degrader compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains endogenous protein expression and regulation, improving relevance to in vivo disease models.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of target degradation with functional cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive Confidence: Quantitative degradation profiling reduces late-stage failure risk by confirming target engagement in relevant cellular backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, providing degradation-competent cellular systems for compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time or endpoint measurement of target protein degradation in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (rate, Dmax, DC50) for high-throughput evaluation of degrader compound libraries.
- Analytics: Generates normalized degradation metrics that allow cross-compound comparison and rank-ordering based on target engagement.
- Translational Research: Connects target degradation to functional outcomes via multiplexed viability assays, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: HiBiT-tagged cell lines serve as reusable assets across multiple projects targeting different proteins or degradation mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation, reduces mechanistic ambiguity, and enables functional target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization, reproducibility, and scalability across screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhances capital efficiency, and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of degrader leads based on quantitative degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 genome editing and clonal cell line development.
- Dependent on luminescent plate readers capable of 96- or 384-well format detection.
- Necessitates standardization of cell plating density and reagent preparation across wells.
- Adaptation considerations include varying endogenous expression levels and subcellular localization of target proteins.
- Practical limitations include signal dynamic range constraints in highly abundant or rapidly turning over target proteins.
