Name: Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji inhibitorów EGFR i RAS wykorzystującą Caenorhabditis elegans do odkrywania leków przeciwnowotworowych. Protokół umożliwia wizualizację efektów terapeutycznych w prostym modelu organizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) za udostępnienie let-60(n1046). Dziękujemy również dr Davidowi Reinerowi (Texas A&M Health Science Center, Institute of Biosciences & Technology w Houston) za szczep lin-1. Na koniec dziękujemy dr Danielle Garsin i jej laboratorium (The University of Texas, McGovern Medical School) za dostarczenie niektórych odczynników. Niektóre szczepy robaków zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Badania te były wspierane przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) grant RP200047 dla JF Hancocka.

1. Przygotowanie płytki z podłożem do wzrostu nicieni (NGM)
<ol>
	<li>Dodać 2,5 g peptonu i 3 g NaCl do 970 ml wody dejonizowanej znajdującej się w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 l. Wymieszaj zawartość za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie dodać 20 g agaru do kolby. Zawartość kolby należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 15 funtów/cal2 przez 30 minut. Po sterylizacji umieścić kolbę na płytce mieszającej i pozostawić pożywkę do ostygnięcia, aż temperatura osiągnie 50 °C.</li>
	<li>Aby przygotować płytki NGM, dodać następujące odczynniki do schłodzonego podłoża: 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH = 6,0), 1 ml 1 MMgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg/ml w 95% etanolu) cholesterolu, 1 ml (10% m/w etanolu) nystatyny, i 1 ml streptomycyny w stężeniu 25 mg/ml.</li>
	<li>Pod przepływem laminarnym wlać schłodzone podłoże do sterylnych szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm. Pozwól talerzom zastygnąć przez 2 godziny. Płytki te można przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Rozmnażanie C. elegans
<ol>
	<li>Umieść 100 μl wyhodowanej przez noc E. coli OP50 na środku każdej płytki NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia przez 24 godziny w okapie laminarnym. Następnie płyty można przechowywać w pojemniku styropianowym. 
	UWAGA: Kultura E. coli OP50 jest uprawiana na pożywce Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C przed wysiewem płytek. Kultura może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1–2 miesiące i używana do okresowego wysiewu talerzy.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego kilofa do robaków zbierz 10–12 ciężarnych dorosłych robaków z wcześniej wyhodowanej płytki pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieść te robaki na świeżą płytkę NGM z wysianą E. coli OP50 i inkubować szalkę przez 24 godziny w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach za pomocą sterylnego wykałacza do robaków należy usunąć dorosłe robaki z płytek. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez ~ 3 dni. Zarodki rozwiną się w grawitacyjne dorosłe robaki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie synchronicznej kultury C. elegans
<ol>
	<li>Zebrać dorosłe robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, myjąc 2–4 płytki M9W.
	<ol>
		<li>Przygotowanie M9W: Rozpuścić 5 g NaCl, 6 g Na2HPO4 i 3 g KH2PO4 w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 1 L. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 lb/in2 przez 30 min. Do schłodzonego roztworu dodać 1 ml 1 MMgSO4</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzać robaki przez odwirowanie probówki o stężeniu 450 x g przez 1 min. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu robaka.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do lizy robaków, łącząc 400 μl 8,25% podchlorynu sodu (wybielacz domowy) i 100 μl 5 N NaOH. Dodaj ten roztwór do osadu robaka i przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość probówki. Zapobiegaj nadmiernemu bieleniu zarodków w probówce, obserwując lizę robaków pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Dodaj 10 ml M9W do stożkowej probówki, aby rozcieńczyć mieszaninę do lizy, gdy 70% dorosłych robaków uległo lizie.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 450 x g przez 1 minutę. Zastąp supernatant 10 ml M9W.</li>
	<li>Powtórz krok 3.5 dwa razy.</li>
	<li>Po zakończeniu etapów mycia dodaj 3–5 ml M9W, aby ponownie zawiesić osad jajeczny. Obracaj rurkę przez noc z prędkością 18 obr./min na rotatorze rurowym w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji wyjąć probówkę z rotatora, osadzać larwy L1 przez odwirowanie probówki przy 450 x g przez 1 min. Zassać M9W, aż w probówce pozostanie 250 μl.</li>
	<li>Potrząśnij rurką, aby ponownie zawiesić larwy. Dodać trzy krople o pojemności 5 μl zawierające larwy na pokrywkę szalki Petriego. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz liczbę robaków w każdej kropli i określ liczbę robaków w 1 μl.</li>
</ol>
4. Przygotowanie testów leków
UWAGA: Kroki w tym teście są pokazane w Rysunek 1.
<ol>
	<li>Hodować 30 ml E. coli OP50 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C przez noc w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min.</li>
	<li>Wirować wyhodowaną przez noc kulturę E. coli OP50 przy 4,000 x g przez 10 minut, aby zagnieździć komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml M9W w celu zagęszczenia kultury.</li>
	<li>Przed przygotowaniem roztworów roboczych do testu leku należy dodać 0,1 ml (5 mg/ml w 95% etanolu) cholesterolu do 100 ml M9W.</li>
	<li>Przygotować roztwory robocze każdego eksperymentalnego leku, rozcieńczając każdy lek wraz z nośnikiem (dimetylosulfotlenek; DMSO) w 4,8 ml M9W uzupełniony cholesterolem w celu uzyskania odpowiednich stężeń. Rozpuść DMSO w 4,8 ml M9W uzupełnionym cholesterolem, aby przygotować kontrolę pojazdu.</li>
	<li>Dodać 200 μl skoncentrowanej kultury E. coli OP50 do każdej probówki zawierającej kontrolę nośnika lub probówki wirowe, aby upewnić się, że są wymieszane.</li>
	<li>Aby przeprowadzić eksperyment, dodaj 2 ml każdego roztworu leku roboczego lub kontrolnego nośnika do każdego dołka w 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Przetestuj każde stężenie leku i kontrolę nośnika w dwóch egzemplarzach.</li>
	<li>Dodać ~100 larw L1 na studzienkę (patrz etapy synchronicznej hodowli C. elegans) za pomocą sterylnej mikropipety. Ogranicz objętość robaków do 10 μl.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>W razie potrzeby uzupełnij studzienki 50 μl 10x skoncentrowanej E. coli OP50 w 3. dniu testu.</li>
</ol>
5. Preparat z agarozy do mikroskopii
<ol>
	<li>Przygotuj 2% w/v roztwór agarozy, rozpuszczając 0,1 g agarozy w 5 ml wody dejonizowanej. Podgrzej zawartość w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Z 5 ml roztworu agarozy można przygotować 20 szkiełek.</li>
	<li>Umieść paski taśmy laboratoryjnej wzdłuż dwóch szklanych szkiełek. Taśma będzie pełniła rolę przekładek ograniczających grubość podkładek agarozowych. Następnie umieść trzecie czyste szkiełko między zaklejonymi taśmą szkiełkami.</li>
	<li>Aby zrobić podkładkę agarozową, umieść 100 μl stopionej agarozy na środku czystego szkiełka. Umieść kolejne czyste szkiełko w poprzek i na wierzchu agarozy i delikatnie dociśnij, aby utworzyć podkładkę. Zdejmij górny suwak, gdy podkładka zastygnie.</li>
</ol>
6. Obserwacja fenotypu Muv w szczepach let-60, let-23 i lin-1
UWAGA: Tylko potencjalne leki, które hamują fenotypy Muv w szczepach let-23 i let-60, będą badane przy użyciu szczepu lin-1 w celu określenia, czy zahamowanie występuje na poziomie RAS czy EGFR.
<ol>
	<li>Po osiągnięciu odpowiedniego etapu cyklu życiowego (3 dni dla szczepów let-60 i let-23, 5 dni dla szczepu lin-1), należy wyjąć płytki z inkubatora i zebrać robaki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml za pomocą pipety.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 450 x g przez 1 minutę. Usunąć M9W bez naruszania osadu robaka i dodać 5 ml świeżego M9W.</li>
	<li>Powtórz krok 6.2 dwa razy.</li>
	<li>Nie naruszając granulki robaka, usuń wszystkie pozostałe M9W przez aspirację. Następnie dodać 500 μl 2 mM azydku sodu lub 2 mM chlorowodorku tetraizolu. Pozostaw probówki do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut. 2 mM azydku sodu lub 2 mM chlorowodorku tetramizolu znieczuli robaki do obrazowania. 
	UWAGA: Upewnij się, że nosisz środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z azydkiem sodu. Roztwór należy przygotować pod maską chemiczną.</li>
	<li>Dodać 10 μl znieczulonej zawiesiny ślimakowej na środek podkładki agarozowej. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe #1.5 na zawiesinie ślimaka. W razie potrzeby przymocuj szkiełko nakrywkowe odrobiną lakieru do paznokci, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	<li>Użyj mikroskopu DIC, aby obserwować szczepy let-60(n1046), let-23(sa62) i lin-1(sy254). Wyobraź sobie robaki w powiększeniach 10x i 20x.</li>
	<li>W przypadku let-60(n1046) i let-23(sa62) oceń dorosłe robaki na podstawie obecności lub braku fenotypu Muv. Natomiast w przypadku szczepu lin-1 należy policzyć liczbę VPC, które przyjęły losy komórek 1° lub 2° po brzusznej stronie larw L4, za pomocą mikroskopu DIC o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Po nacięciu mikrofotografii dla każdego szczepu i leczenia farmakologicznego, wykonaj test t Studenta, aby określić różnice statystyczne między terapiami.</li>
</ol>

<ol><li>Marshall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Ras+and+Raf%3A+key+regulatory+proteins+in+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).</li>
<li>Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+the+Ras-ERK%2FMAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Grandis, J. R., Tweardy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+transforming+growth+factor+alpha+and+epidermal+growth+factor+receptor+messenger+RNA+are+early+markers+of+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).</li>
<li>Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+molecular+pathobiology+in+oral+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review.</a> International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).</li>
<li>Stransky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutational+landscape+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).</li>
<li>Bos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ras+oncogenes+in+human+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">ras oncogenes in human cancer: a review.</a> Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).</li>
<li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).</li>
<li>Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+survey+of+Ras+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive survey of Ras mutations in cancer.</a> Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).</li>
<li>Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins%3A+different+signals+from+different+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ras proteins: different signals from different locations.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).</li>
<li>Hancock, J. F., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+plasma+membrane+signalling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ras plasma membrane signalling platforms.</a> Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).</li>
<li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fendiline+inhibits+K-Ras+plasma+membrane+localization+and+blocks+K-Ras+signal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).</li>
<li>Moghal, N., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+system+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).</li>
<li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTK%2FRas%2FMAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">RTK/Ras/MAPK signaling.</a> WormBook. , 1-19 (2006).</li>
<li>Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+22+genes+that+affect+the+vulval+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).</li>
<li>Katz, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+the+extracellular+domain+activates+LET-23%2C+the+Caenorhabditis+elegans+epidermal+growth+factor+receptor+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).</li>
<li>Hara, M., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+farnesyltransferase+inhibitors+suppress+the+phenotype+resulting+from+an+activated+ras+mutation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).</li>
<li>Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Caenorhabditis+elegans+to+evaluate+inhibitors+of+Ras+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo.</a> Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).</li>
<li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelin+Metabolism+Is+a+Regulator+of+K-Ras+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function.</a> Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).</li>
<li>Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gene+lin-1+encodes+an+ETS-domain+protein+and+defines+a+branch+of+the+vulval+induction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway.</a> Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+diet+mediates+pathogen+and+stress+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 15 (3), 1008011(2019).</li>
<li>Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+microbiome+drug+metabolism+by+gut+bacteria+and+their+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes.</a> Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).</li>
<li>Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+EGF+receptor-mediated+vulva+development+by+the+heterotrimeric+G-protein+G-alpha+q+and+excitable+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans.</a> Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Testy, które opisujemy przy użyciu robaka, są proste i niedrogie do zidentyfikowania inhibitorów funkcji EGFR i RAS. C. elegans jest atrakcyjnym modelem do odkrywania leków, ponieważ jest łatwy w hodowli w laboratorium ze względu na krótki cykl życia (3 dni w temperaturze 20 °C) i zdolność do generowania dużej liczby larw. Co ważniejsze, szlak EGFR-RAS-ERK MAPK jest ewolucyjnie i funkcjonalnie zachowany, a ssaki zapewniają genetycznie podatny system do analizy wpływu inhibitorów EGFR i RAS. Co więcej, przezroczy...

Szlaki komórkowe, które regulują procesy rozwojowe w organizmach, są wysoce zachowane wśród wszystkich metazoan. Jednym z takich szlaków jest kaskada sygnalizacyjna kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) EGFR-RAS-ERK, która jest krytycznym szlakiem regulującym proliferację, różnicowanie, migrację i przeżycie komórek1,2. Defekty w tym szlaku sygnałowym mogą prowadzić do stanów patologicznych lub chorobowych, takich jak rak. Wykazano, że receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) ulega silnej ekspresji w ludzkich nowotworach, w tym w 50% raków płaskonabłonkowych jamy ustnej, i przyczynia się do rozwoju nowotworów złośliwych3,4,5. Natomiast mutacje w trzech izoformach RAS, H-, K i N-RAS, są głównymi czynnikami powodującymi złośliwe przemiany w wielu nowotworach u ludzi. Spośród tych trzech izoform RAS, mutacje onkogenne w K-RAS są najbardziej rozpowszechnione6,7,8. Aby EGFR i RAS działały, muszą zlokalizować się w błonie komórkowej (PM). Zapobieganie lokalizacji tych cząsteczek w PM może całkowicie znieść aktywność biologiczną tego szlaku sygnałowego9,10. W związku z tym hamowanie lokalizacji tych białek w PM jest strategią terapeutyczną mającą na celu zablokowanie dalszej sygnalizacji i wynikających z niej niekorzystnych wyników. Za pomocą testu przesiewowego o wysokiej zawartości fendyliny, blokera kanału wapniowego typu L, zidentyfikowano jako inhibitor aktywności K-RAS11. Nanogrupowanie K-RAS do wewnętrznej ulotki PM jest znacznie zmniejszone w obecności fendyliny. Ponadto K-RAS jest redystrybuowany z błony plazmatycznej do retikulum endoplazmatycznego (ER), aparatu Golgiego, endosomów i cytozolu. Co ważniejsze, proliferacja linii komórkowych raka trzustki, okrężnicy, płuc i endometrium wykazujących ekspresję onkogennego mutanta K-RAS jest blokowana przez hamowanie dalszej sygnalizacji przez fendiline11. Dane te sugerują, że fendylina funkcjonuje jako specyficzny lek przeciwnowotworowy K-RAS, który powoduje nieprawidłową lokalizację białka RAS w PM.
Nicień Caenorhabditis elegans został dokładnie przebadany w kontekście rozwoju. Wiele ścieżek sygnałowych, które rządzą rozwojem robaka, jest ewolucyjnych i funkcjonalnie zachowanych. Na przykład, aktywacja RAS za pośrednictwem EGFR i następująca po niej aktywacja kaskady sygnałów ERK MAPK są zachowane w worm12. Kaskada jest reprezentowana przez następujące białka: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 jest homologiczny do RAS, podczas gdy LET-23 jest homologiczny do EGFR. U robaka szlak ten reguluje rozwój sromu13. Srom to otwór nabłonkowy na brzusznej ścianie ciała robaka, który umożliwia składanie zapłodnionych jaj. Tworzenie się sromu u robaka zależy od ekspozycji komórek prekursorowych sromu (VPC) na gradient aktywacji kaskady sygnałowej EGFR-RAS-MAPK. Podczas normalnego rozwoju proksymalne VPC otrzymują silne sygnały z komórek kotwiczących gonad, aby różnicować się w losy komórek 1° i 2°, które dają początek funkcjonalnemu sromowi12. Natomiast dystalne VPC różnicują się w losy komórek 3°, które łączą się z syncytium podskórnym i nie tworzą sromu z powodu zubożonej sygnalizacji. W przypadku braku sygnalizacji wszystkie VPC różnicują się w losy komórek 3°, co prowadzi do braku sromu. Jednak sygnalizacja konstytutywna prowadzi do powstania jednego lub więcej niefunkcjonalnych sromów w wyniku indukcji wszystkich VPC do przyjmowania losów komórek 1° i 2°.
Mutacje, które powodują wadliwą lub nadmierną indukcję sromu, zostały zidentyfikowane dla wielu genów kodujących białka reprezentujące ten szlak. Wadliwa indukcja sromu skutkuje fenotypem bezsromowym (Vul), podczas gdy nadmierna indukcja sromu powoduje fenotyp wielosromowy (Muv), który jest reprezentowany przez rozwój licznych niefunkcjonalnych ektopowych pseudosromów w całej brzusznej ścianie ciała. Fenotyp Muv wyrażony przez szczep let-60 (n1046) jest spowodowany mutacją wzmocnienia funkcji w RAS, podczas gdy w szczepie let-23 (sa62) jest spowodowany mutacją aktywującą w EGFR14,15. Wykazano, że silny fenotyp Muv w tych zmutowanych szczepach jest zaburzony przez interwencje farmakologiczne, jak wykazano w leczeniu robaków let-60 (n1046) inhibitorem MEK-1 U012616,17. Co ciekawe, wykazaliśmy, że R-fendylina i inhibitory wpływające na metabolizm sfingomieliny hamują fenotyp Muv u robaka18. Aby zademonstrować, że te inhibitory blokują sygnalizację let-60 na poziomie RAS, wykorzystano szczep zerowy lin-117. Lin-1 jest hamującym czynnikiem transkrypcyjnym podobnym do Ets, który działa jako represor w rozwoju sromu19. Silna rewersja fenotypu Muv u robaków let-60(n1046) i brak wpływu na robaki zerowe lin-1 sugerują, że hamowania te występują na poziomie RAS.
W tym protokole demonstrujemy użycie C. elegans jako modelu do identyfikacji inhibitorów białek RAS i EGFR. Korzystając z testu na bazie cieczy, wykazujemy hamujące działanie R-fendyliny poprzez tłumienie fenotypów Muv w zmutowanych szczepach let-60 (n1046) i let-23 (sa62) C. elegans. Test ten potwierdza zastosowanie C. elegans jako narzędzia w początkowej fazie odkrywania leków przeciwnowotworowych.

<table><tbody><tr><td><silny>Media i chemikalia</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Pepton baktowy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco LB Bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatyna</td><td>Acros organiczna</td><td></td><td></td>AC455500050</tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>R-Fendylina</td><td></td><td></td><td>komercyjnie syntetyzowana (klasa farmaceutyczna)</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>8,25% podchloryn sodu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Wybielacz</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>(&minus;)-Chlorowodorek tetramizolu</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UO126 (inhibitor MEK)</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>19-147</td><td></td></tr><tr><td><mocne>materiały eksploatacyjne&nbsp; </mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>Nr 1,5&nbsp; 18 mm X 18 mm Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego z przezroczystą pokrywką (60 x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką (100X15mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe ze zwykłego szkła (75 x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-197-4804</td><td></td></tr><tr><td>Software&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczepy bakteryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczep</td><td>Genotyp </td><td>Transgene<</td><td>strong>Źródło</td></tr><tr><td>MT2124 &nbsp;</td><td>let-60(n1046) IV.</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>MT7567</td><td>lin-1(sy254) IV.</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>PS1839</td><td>let-23(sa62) II.</td><td></td><td>CGC</td></tr></tbody></table>

identyfikacja inhibitorów egfr i ras za pomocą caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Zmiany w lokalizacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i jego efektora RAS w błonie komórkowej są związane z wieloma chorobami, w tym z rakiem. Wolno żyjący nicień C. elegans posiada ewolucyjną i funkcjonalnie zachowaną kaskadę sygnałową EGFR-RAS-ERK MAP, która ma kluczowe znaczenie dla rozwoju sromu. Mutacje wzmocnienia funkcji w homologu RAS LET-60 i homologu EGFR LET-23 indukują wytwarzanie widocznego, niefunkcjonalnego ektopowego sromu rzekomego wzdłuż brzusznej ściany ciała tych robaków. Wcześniej wykazano, że fenotyp wielosromu (Muv) u tych robaków jest hamowany przez małe cząsteczki chemiczne. W tym miejscu opisujemy protokół użycia robaka w teście na bazie płynu w celu identyfikacji inhibitorów, które znoszą aktywność białek EGFR i RAS. Korzystając z tego testu, pokazujemy, że R-fendylina, pośredni inhibitor K-RAS, hamuje fenotyp Muv wyrażony w zmutowanych robakach let-60 (n1046) i let-23 (sa62). Test jest prosty, niedrogi, nie jest czasochłonny w konfiguracji i może być wykorzystany jako wstępna platforma do odkrycia terapii przeciwnowotworowych.

W pierwszej kolejności wykazaliśmy, że R-fendilina jest w stanie zahamować fenotyp Muv w szczepie mutantów let-60(n1046) w porównaniu do nicieni traktowanych DMSO. Nasze dane pokazują, że R-fendilina blokuje fenotyp Muv w let-60(n1046) w sposób zależny od dawki (Rycina 2A,B). Jednak w szczepie mutantów null lin-1 zaobserwowano brak odwrócenia fenotypu Muv w odpowiedzi na zwiększające się stężenia R-fendiliny (Rycina 2B...

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Protokół ten może być wykorzystany w początkowej fazie odkrywania leku do identyfikacji inhibitorów, które znoszą aktywność białek EGFR i RAS. Główną zaletą tego testu jest to, że hamujące działanie leków anty-EGFR i anty-RAS można łatwo zobrazować u C.egelans. Zacznij od zauważenia 100 mikrolitrów wyhodowanej przez noc E.coli OP50 na środku każdej płytki NGM.Pozostaw płytki do wyschnięcia na 24 godziny w okapie laminarnym, a następnie przechowuj je w pojemniku z polistyrenu. Za pomocą sterylnego kilofa do robaków zbierz od 10 do 12 grawitacyjnych dorosłych robaków z wcześniej wyhodowanej płytki i przenieś je na świeżą płytkę NGM obsianą E. coli OP50. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Po 24 godzinach użyj sterylnego kilofa, aby usunąć dorosłe robaki z płytek. Inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez około trzy dni, aby zarodki mogły przekształcić się w grawitacyjne dorosłe robaki. Zbierz grawitacyjne dorosłe robaki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, myjąc dwie do czterech płytek M9W.Osadzać robaki, odwirowując probówkę o stężeniu 450 razy G przez jedną minutę, a następnie zdekantować supernatant bez naruszania osadu roba

identification-of-egfr-and-ras-inhibitors-using-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Neureksyny i neuroliginy są białkami adhezyjnymi błony neuronów, które pełnią kluczowe role w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej, jednak gdy posiadają one również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Ta metoda opisuje protokół wysokoprzepustowego przygotowania ekstraktu białkowego z próbek Caenorhabditis elegans i późniejszej koimmunoprecypitacji.

Preparat ekstraktu białkowego i koimmunoprecypitacja z Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę identyfikacji inhibitorów EGFR i RAS wykorzystującą Caenorhabditis elegans do odkrywania leków przeciwnowotworowych. Protokół umożliwia wizualizację efektów terapeutycznych w prostym modelu organizmu.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów