Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji
12 stycznia 2021
Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z próbek krwi i biopsji jelitowych, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR do sekwencjonowania nowej generacji, wykonywania przebiegu NGS i podstawowej analizy danych.
Metoda ta umożliwia eksplorację specyficznych limfocytów T i B na poziomie nukleotydów lub aminokwasów, a tym samym może identyfikować dynamiczne zmiany w populacjach limfocytów i parametry różnorodności w różnych zaburzeniach. Zaletą sekwencjonowania nowej generacji jest możliwość identyfikacji unikalnych klonów limfocytów T lub B i śledzenia ich w różnych miejscach anatomicznych lub u różnych osób. Ma to potencjał w zakresie identyfikacji nowych biomarkerów w różnych chorobach.
Tę procedurę zademonstruje Naomi Salamon, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Zacznij od przeprowadzenia trawienia i lizy komórek w biopsjach jelitowych. Pobrać biopsje jelitowe świeżo pobrane lub przechowywane w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza.
Jeśli używasz zamrożonych biopsji, rozmroź je na lodzie. Dodaj 600 mikrolitrów roztworu do lizy jąder do sterylnej 1,7-mililitrowej probówki wirówkowej, schłodzonej na lodzie. Następnie umieść biopsję w probówce i inkubuj ją w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut.
Dodaj 17,5 mikrolitra proteinazy K o stężeniu 20 miligramów na mililitr i inkubuj probówkę przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Po inkubacji pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez pięć minut. W celu wyizolowania DNA z krwi delikatnie kołysz probówką, aż zostanie dokładnie wymieszana.
Następnie przenieś krew do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej dziewięć mililitrów roztworu do lizy komórek. Odwróć probówkę kilka razy podczas 10-minutowego okresu inkubacji w temperaturze pokojowej. Wirować przy 600 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie wyrzuć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając widocznej białej osadki. Energicznie obracaj probówkę przez 15 sekund, aż do całkowitego ponownego zawieszenia. Dodaj trzy mililitry roztworu do lizy jąder i kilkakrotnie pipetuj pipetą, powodując, że roztwór stanie się lepki.
Dodać białkowy bufor wytrącający się do próbki. Następnie energicznie wiruj przez 20 sekund i inkubuj go na lodzie przez pięć minut. Wirować przy 16 000 g przez cztery minuty, aby utworzyć szczelny osad zawierający wytrącone białka.
Ostrożnie przenieś supernatant bez naruszania osadu do nowej probówki o pojemności 1,7 mililitra. Dodaj jeden mililitr 2-propanolu do probówki zawierającej supernatant i delikatnie wymieszaj, odwracając. DNA powinno stać się widoczne jako biała unosząca się substancja.
Odwirować przy 16 000 g przez jedną minutę i całkowicie usunąć supernatant. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć rurkę. Odwirować go w temperaturze 16 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.
Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant. Powtórz płukanie etanolem. Następnie pozostaw osad DNA do wyschnięcia na powietrzu przez 10 do 15 minut.
Dodaj 50 mikrolitrów ultraczystej wody do DNA i przeprowadź kwantyfikację DNA zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Użyj 150 nanogramów DNA, aby przygotować bibliotekę do sekwencjonowania. Umieść pipety i końcówki w kapturze ze światłem UV na 15 minut, aby rozbić resztki DNA.
W międzyczasie pozwól, aby różne probówki indeksujące i polimeraza DNA rozmroziły się na lodzie. W kapturze biologicznym dodaj 45 mikrolitrów z różnych probówek indeksowych do probówek PCR, uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Następnie dodaj 0,2 mikrolitra polimerazy DNA i pięć mikrolitrów przygotowanego DNA do probówek PCR.
Uruchom PCR za pomocą wstępnie ustawionego programu zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj kulek magnetycznych do usunięcia nadmiaru starterów, nukleotydów i enzymów. Podgrzej kulki do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut i przygotuj wystarczającą ilość świeżego 80% etanolu na 400 mikrolitrów na próbkę.
Dodaj kulki do każdej probówki do PCR i wymieszaj, pipetując 10 razy. Inkubować probówki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umieść zmieszaną próbkę na stojaku magnetycznym na pięć minut.
Następnie zassać klarowny płyn i wyrzucić. Zassać pozostałą ciecz za pomocą końcówki o pojemności 10 mikrolitrów. Dodaj 200 mikrolitrów 80% etanolu do każdej próbki i inkubuj przez 30 sekund.
Odessać 195 mikrolitrów etanolu i wyrzucić. Następnie odessać pozostały płyn za pomocą końcówki o pojemności 10 mikrolitrów. Powtórz płukanie etanolem.
Następnie otwórz nakrętki probówek i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut. Po pięciu minutach wyjmij próbki ze stojaka magnetycznego i dodaj 25 mikrolitrów buforu elucyjnego. Mieszać pipetując do uzyskania jednorodnej konsystencji i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.
Umieść probówki na stojaku magnetycznym na pięć minut. Następnie przenieś 22 mikrolitry do nowej probówki PCR i zmierz stężenie DNA. Określ ilościowo amplikon zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.
Po obliczeniu końcowego stężenia DNA i wielkości piku produktu w parach zasad, należy przygotować nową mieszaninę rozcieńczeń dla każdej próbki i przenieść jej dwa mikrolitry do nowej mieszanki pulowej. Przygotuj świeży roztwór 0,2 normalnego wodorotlenku sodu i dodaj 10 mikrolitrów do rozcieńczonej biblioteki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby zdenaturować dwuniciowe DNA.
Następnie dodaj 980 mikrolitrów wstępnie schłodzonego buforu z zestawu do probówki zawierającej DNA i krótko zwiruj. Załaduj 600 mikrolitrów końcowej biblioteki na wyznaczony wkład i umieść próbki w maszynie. Aby przeprowadzić analizę sekwencjonowania, pobierz metryki sekwencjonowania z sekwencera i sprawdź, czy dane mieszczą się w odpowiednich zakresach.
Powtórzyć przebieg dla próbek, które nie spełniają kryteriów. Protokół ten został wykorzystany do przeprowadzenia podstawowej analizy reprezentatywnych autologicznych próbek krwi i odbytnicy pacjenta z niedoborem receptora IL10 i ciężkim IBD o początku w dzieciństwie w wywiadzie. Próbki oznaczono zarówno pod kątem repertuaru TCR-beta, jak i IGH.
Wszystkie klony można zidentyfikować na podstawie ich unikalnej sekwencji na poziomie nukleotydów lub aminokwasów. Sekwencje te mogą być porównywane między różnymi pacjentami w poszukiwaniu wspólnych klonów lub u tego samego pacjenta między różnymi miejscami anatomicznymi. Poniżej przedstawiono pięć najczęściej występujących klonów dla każdej próbki.
Obrazy TreeMap zostały wygenerowane w celu uzyskania szerokiego przeglądu repertuaru. Każdy kolorowy kwadrat reprezentuje inny klon, a rozmiar jest skorelowany z jego częstotliwością. Te obrazy TreeMap pokazują klonalną ekspansję w jelitowym repertuarze IGH.
Natomiast w repertuarze TCR-beta obserwuje się wyraźną ekspansję klonalną we krwi w porównaniu z jelitem autologicznym. Na poziomie genu NGS dostarcza informacji dotyczących użycia V, D i J na poziomie genu, rodziny lub allelu. Co więcej, specyficzne kombinacje VDJ można wywnioskować z danych dotyczących repertuaru TCR-beta i IGH, ujawniając zróżnicowane wzorce wykorzystania genów w różnych warunkach.
Protokół ten może być stosowany zarówno do DNA, jak i RNA i może być używany do generowania repertuarów TCR-alfa, TCR-gamma i IGL. Jest również kompatybilny z innymi narządami po niewielkich modyfikacjach trawienia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji DNA z próbek krwi oraz biopsji jelita, tworzenia bibliotek PCR TCR尾 i IGH do sekwencjonowania nowej generacji (NGS) oraz przeprowadzania podstawowej analizy danych. Umożliwia on badanie dynamiki komórek T i B na poziomie nukleotydów lub aminokwasów, co ułatwia identyfikację unikalnych klonów w różnych miejscach anatomicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Genomika
- Sekwencjonowanie nowej generacji
Wstęp
- Sekwencjonowanie następnej generacji umożliwia szczegółową analizę populacji limfocytów.
- Metoda ta może ujawnić dynamiczne zmiany w odpowiedziach immunologicznych w różnych schorzeniach.
- Identyfikacja unikalnych klonów limfocytów T lub B może prowadzić do odkrycia nowych biomarkerów.
- Procedura jest prezentowana przez asystenta badawczego w laboratorium.
Cel badania
- Izolacja DNA z próbek biologicznych w celu przeprowadzenia sekwencjonowania.
- Analiza różnorodności limfocytów T i B w różnych jednostkach chorobowych.
- Śledzenie klonów komórek odpornościowych w różnych lokalizacjach anatomicznych.
Zastosowane metody
- Izolacja DNA z krwi i biopsji jelita.
- Generowanie bibliotek PCR dla TCR i IGH.
- Przeprowadzenie sekwencjonowania nowej generacji (NGS).
- Podstawowa analiza danych z wyników sekwencjonowania.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja DNA z próbek.
- Generowanie bibliotek odpowiednich do NGS.
- Identyfikacja unikalnych klonów limfocytów T i B.
- Wnioski dotyczące różnorodności limfocytów w różnych schorzeniach.
Wnioski
- Metoda ta pogłębia zrozumienie dynamiki odpornościowej.
- Stanowi ona podstawę do identyfikacji biomarkerów w chorobach.
- Podejście to można dostosować do różnych zastosowań badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza repertuaru receptorów limfocytów T i B za pomocą sekwencjonowania nowej generacji dostarcza działom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym obraz dynamiki odporności adaptacyjnej o wysokiej rozdzielczości, co umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesach walidacji celów terapeutycznych i odkrywania biomarkerów. Dzięki ilościowemu określeniu klonalności, wykorzystania genów oraz różnorodności repertuaru w różnych stanach chorobowych, metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w fazie wczesnego odkrywania leków i podejmowania decyzji translacyjnych. Możliwość ta znajduje bezpośrednie zastosowanie w projektach ukierunkowanych na immunologię, których celem jest powiązanie odpowiedzi immunologicznej z efektami terapeutycznymi w chorobach zapalnych, zakaźnych, onkologicznych i autoimmunologicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez śledzenie klonów limfocytów T i B specyficznych dla antygenu w różnych miejscach anatomicznych i punktach czasowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia rozdzielczość na poziomie nukleotydów lub aminokwasów w obrębie repertuarów immunologicznych, co pozwala wyjaśnić funkcjonalne zaangażowanie celu i zmniejszyć ryzyko biologiczne.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację populacji poddanych ekspansji klonalnej, które korelują z fenotypem choroby lub odpowiedzią na leczenie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje zestandaryzowane, ilościowe profile repertuaru immunologicznego, odpowiednie do standaryzacji testów i oceny powtarzalności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych z krwi i tkanek do dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Wartość techniczna: Dostarcza wskaźników klonalności i różnorodności, które służą jako wiarygodne odczyty w kampaniach przesiewowych związków chemicznych lub leków biologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez śledzenie dynamiki klonalnej w systemach istotnych dla danej choroby.
- Zgodność z biomarkerami: Ułatwia identyfikację wspólnych lub rozszerzonych klonów u różnych pacjentów, wspierając odkrywanie translacyjnych biomarkerów w zaburzeniach immunologicznych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspomaga podejmowanie decyzji go/no-go poprzez ujawnianie różnic w wykorzystaniu genów VDJ oraz wzorców ekspansji klonalnej powiązanych z patofizjologią.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne, szczególnie w ramach programów immunologii i immuno-onkologii, gdzie minimalizacja ryzyka związanego z mechanizmami immunologicznymi ma kluczowe znaczenie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ujawnianie napędzanej antygenem selekcji klonalnej i ekspansji w populacjach limfocytów T i B.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzowanemu przygotowaniu bibliotek oraz sekwencjonowaniu repertuarów TCR i IGH z wyizolowanego DNA.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, w tym klonalności, wykorzystania rodzin genów (V, D, J) oraz śledzenia unikalnych klonów w celu analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie podłużnego śledzenia klonów immunologicznych w krwi i tkankach.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku platforma możliwa do zastosowania w wielu obszarach chorobowych i typach próbek po adaptacji protokołu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów pośredniczonych immunologicznie poprzez bezpośredni pomiar dynamiki repertuaru.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanym procesom izolacji DNA, przygotowania bibliotek oraz przepływom pracy NGS.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną identyfikację immunologicznie aktywnych klonów, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez powiązanie zmian w repertuarze immunologicznym z mechanizmami choroby i interwencją terapeutyczną.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunogenomiki, przygotowywania bibliotek NGS oraz analizy bioinformatycznej danych repertuaru immunologicznego.
- Zależne od dostępu do sekwenatorów NGS, systemów oczyszczania opartych na kuleczkach magnetycznych oraz kontrolowanych warunków laboratoryjnych do pracy z DNA.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w jednostkach immunologii, genomiki i nauki o danych w celu zapewnienia spójnej analizy repertuaru.
- Wymaga adaptacji protokołów trawienia tkanek dla organów poza układem jelitowym, przy jednoczesnym zachowaniu wydajności i integralności DNA.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wymagania dotyczące ilości wejściowego DNA oraz potencjalną stronniczość wynikającą z amplifikacji PCR podczas przygotowywania bibliotek.
