Name: Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę analizy repertuaru receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Technika ta umożliwia identyfikację unikalnych klonów komórek immunologicznych w różnych tkankach i zastosowanie w badaniach biomarkerów chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną w Sheba Medical Center, a wszyscy uczestniczący w nim uzyskali świadomą pisemną zgodę.
1. Izolacja i kwantyfikacja DNA
<ol>
	<li>Trawienie i liza komórek w biopsjach jelitowych
	<ol>
		<li>Pobrać biopsje jelit, zarówno świeżo pobrane, jak i przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Jeśli używasz biopsji mrożonej, rozmrozić na lodzie.</li>
		<li>Dodać 600 μl roztworu do lizy jąder do sterylnej probówki mikrowirówki o pojemności 1,7 ml, schłodzonej na lodzie.</li>
		<li>Umieścić biopsję w probówce mikrowirówkowej z roztworem do lizy i inkubować w temperaturze 65 °C przez 15-30 minut.</li>
		<li>Dodać 17,5 μl 20 mg/ml proteinazy K i inkubować przez noc w temperaturze 55 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 5 minut przed przejściem do kroku 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza komórek krwi pełnej
	<ol>
		<li>Uzyskać 3 ml krwi pełnej w probówce zawierającej EDTA, heparynę lub cytrynian.</li>
		<li>Delikatnie kołysz probówkę, aż dokładnie się wymiesza, i przenieś krew do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml roztworu do lizy komórek. Odwrócić kilka razy w ciągu 10-minutowego okresu inkubacji w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić jak najwięcej supernatantu, nie naruszając widocznego białego osadu. Pozostanie około 50–100 μl pozostałej cieczy.</li>
		<li>Energicznie obracaj rurkę przez 15 s, aż do całkowitego zawieszenia. Dodać 3 ml roztworu do lizy jąder i kilkakrotnie odpipetować. Roztwór powinien stać się lepki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie białek
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl buforu do wytrącania białek do tkanki lub 1 ml do krwi. Wirować energicznie przez 20 s i inkubować na lodzie przez 5 minut. Po wirowaniu mogą być widoczne małe grudki białka.</li>
		<li>Wirować przy 16 000 x g przez 4 min. Powinien powstać zwarty osad zawierający wytrącone białka.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść supernatant, nie naruszając osadu, do nowej probówki o pojemności 1,7 ml. 
		UWAGA: Jeśli osad nie jest szczelny, rozważ inną wirówkę o sile 16 000 x g przez 4 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie i rehydratacja DNA
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml 2-propanolu do probówki zawierającej supernatant i delikatnie wymieszać przez odwrócenie. DNA powinno stać się widoczne jako biała substancja unosząca się na wodzie.</li>
		<li>Wirować przy 16 000 x g przez 1 min. Całkowicie usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
		<li>Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć probówkę. Wirować przy 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Powtórz krok 1.4.3.</li>
		<li>Umieść otwartą rurkę odwróconą na czystym bibułze chłonnym na 10-15 minut. Ponownie odwróć probówkę i potwierdź całkowite nawodnienie. W razie potrzeby pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez dodatkowe 10-15 minut. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest, aby pellet całkowicie wyschł.</li>
		<li>Dodać 50 μl ultraczystej wody (UPW). W razie potrzeby DNA można bardziej rozcieńczyć po kwantyfikacji.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę na bloku grzewczym w temperaturze 65 °C w celu ponownego nawodnienia DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja DNA 
	UWAGA: DNA oznaczono ilościowo za pomocą fluorometru i wyznaczonych odczynników, jak określono w tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Doprowadź wzorce do temperatury pokojowej i przygotuj zestaw, w tym wyznaczone probówki o pojemności 0,5 ml.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę i barwników w probówce o pojemności 15 ml, w zależności od liczby próbek. Dodać 200 μl buforu i 1 μl barwnika na próbkę. Dołącz 2 próbki do standardów. Zaleca się obliczenie dodatkowej próbki, aby uniknąć sytuacji, w której bufor nie będzie wystarczający.
		<ol>
			<li>Dla 2 wzorców umieść 190 μl wyżej przygotowanej mieszanki w probówce o pojemności 0,5 ml. Dodać 10 μl wzorca.</li>
			<li>Dla każdej próbki umieścić 199 μl wyżej przygotowanej mieszanki w probówce o pojemności 0,5 ml. Dodać 1 μl DNA.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapoznaj się z próbkami. Wynik wskazuje stężenie DNA w próbce.</li>
		<li>Jeśli próbki przekraczają limit, rozcieńczyć DNA w stosunku 1:10 za pomocą UPW i powtórzyć odczyt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie biblioteki
UWAGA: Obecny protokół wykorzystuje multipleksowy, oparty na PCR zestaw testowy kompatybilny z sekwencerami NGS. Zestaw zawiera 24 różne indeksy, z których każdy jest ukierunkowany na regiony konserwatywne w regionachβ V i Jβ. Umożliwia to jednoetapową reakcję PCR i łączenie różnych próbek. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Przygotuj próbki DNA. Uzyskać 150 ng DNA i dodać UPW, co daje w sumie 5 μl. 
	UWAGA: Możliwe jest użycie mniej niż 150 ng DNA do przygotowania biblioteki, przy minimalnym stężeniu 10 ng/μL.</li>
	<li>Umieść pipety i końcówki w kapturze ze światłem UV na 15 minut, aby rozbić resztki DNA. W międzyczasie pozwól, aby różne probówki indeksujące (do przygotowania biblioteki) i polimeraza DNA rozmroziły się na lodzie.</li>
	<li>W kapturze biologicznym dodaj 45 μl z różnych probówek indeksowych do probówek PCR. Następnie dodaj 0,2 μl polimerazy DNA i 5 μl DNA przygotowanego w kroku 2.1 do probówek PCR.</li>
	<li>Uruchom reakcję PCR za pomocą wcześniej ustawionego programu, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie i kwantyfikacja amplikonu
<ol>
	<li>Użyj kulek magnetycznych do usunięcia nadmiaru starterów, nukleotydów i enzymów.
	<ol>
		<li>Podgrzej koraliki co najmniej 30 minut do temperatury pokojowej. Przygotować wystarczającą ilość świeżego 80% etanolu na 400 μl na próbkę.</li>
		<li>Dodać 50 μl (IGH) lub 35 μL (TCRβ) kulek do każdej probówki PCR i wymieszać pipetując 10 razy. Inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść zmieszaną próbkę na stojaku magnetycznym na 5 minut.</li>
		<li>Odessać 95 μl (IGH) lub 80 μL (TCRβ) klarownej cieczy i wyrzucić. Odessać pozostałą ciecz za pomocą końcówki o pojemności 10 μl.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 200 μl 80% etanolu. Inkubować 30 s. Odessać 195 μl etanolu i wyrzucić. Odessać pozostałą ciecz za pomocą końcówki o pojemności 10 μl.</li>
		<li>Powtórz krok 3.1.5. Otwórz nakrętki tubek i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.</li>
		<li>Natychmiast po upływie 5 minut zdjąć ze stojaka magnetycznego i dodać 25 μl buforu elucyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 8,0). Mieszać pipetując do uzyskania jednorodnej konsystencji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
		<li>Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 5 minut. Przenieś 22 μl do nowej probówki PCR. Zmierzyć stężenie DNA (krok 1.5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja amplikonów 
	UWAGA: Obecny protokół wykorzystuje zautomatyzowaną maszynę do elektroforezy do kontroli jakości stężenia, rozmiaru i integralności DNA. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Umieść odczynniki i taśmę sitową w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut.</li>
		<li>W nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml rozcieńczyć 1 ng/μl próbki DNA oznaczone ilościowo w kroku 3.1.8 za pomocą ultraczystej wody dla całkowitej objętości co najmniej 3 μl.</li>
		<li>Rozcieńczone DNA Vortex przed użyciem. Umieścić 2 μl buforu wraz z 2 μl rozcieńczonego DNA we wstępnie znakowanych specjalistycznych paskach PCR (dostarczonych w zestawie) i umieścić nakrętki. Umieść na shakerze na 1 minutę, a następnie odwiruj paski PCR. 
		UWAGA: Ze względu na lepkość buforu, upewnij się, że nadmiar buforu został usunięty z końcówki przed przeniesieniem do probówek z próbką.</li>
		<li>Umieść w maszynie taśmę sitową i paski PCR bez nakrętek. Otwórz pokrywę pudełka na końcówki wewnątrz urządzenia. Przypisz pozycję za pomocą odpowiednich etykiet. Uruchom maszynę. 
		UWAGA: Histogram wyjściowy powinien być pojedynczym pikiem o pożądanym rozmiarze amplikonów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). W próbkach o niskiej jakości będą obserwowane dodatkowe piki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B), wskazujące na słabe czyszczenie ściegów lub tworzenie się dimerów starterowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sekwencjonowanie nowej generacji
<ol>
	<li>Kwantyfikacja i łączenie bibliotek
	<ol>
		<li>Obliczyć końcowe stężenie DNA w nM, używając wartości DNA z kroku 3.1.8 oraz wielkości piku produktu w parach zasad (bp), uzyskanej z wyników maszyny do elektroforezy (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Dla każdej próbki obliczyć objętość DNA, którą należy pobrać dla końcowego stężenia 4 nM, w końcowej objętości 10-20 μl buforu elucyjnego.</li>
		<li>Przygotować nową mieszaninę rozcieńczania dla każdej próbki i pobrać z niej 2 μl do nowej mieszanki zbiorczej. 
		UWAGA: W przypadku próbek, które mają mniej niż 4 nM, należy dodać maksymalną możliwą ilość próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przebieg NGS library 
	UWAGA: Obecny protokół wykorzystuje platformę sekwencera laboratoryjnego. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Przygotować świeży roztwór 0,2 N NaOH. Dodać 10 μl 0,2 N NaOH do rozcieńczonej biblioteki przygotowanej w kroku 4.1.3. Dodaj 5% PhiX do probówki i krótko wiruj. Zakręć rurkę, aby upewnić się, że cały roztwór osiadł na dnie tubki.</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu denaturacji dwuniciowego DNA. Dodać 980 μl wstępnie schłodzonego buforu z zestawu do probówki z DNA i krótko przetrząsnąć.</li>
		<li>Umieść rozcieńczoną bibliotekę na lodzie i przygotuj bibliotekę w następujący sposób. Aby uzyskać mieszaninę 17 pM, dodać 425 μl DNA z kroku 4.2.2 i 575 μl buforu. Odwróć bibliotekę kilka razy i rozkręć w dół. Załaduj 600 μl biblioteki końcowej na wyznaczony wkład i umieść próbki w urządzeniu.</li>
		<li>Uruchom przebieg zgodnie z instrukcjami oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza sekwencjonowania
<ol>
	<li>Pobierz metryki sekwencjonowania z sekwencera i sprawdź, czy dane sekwencjonowania mieszczą się w następujących zakresach (specyficznych dla zestawu używanego w bieżącym protokole). Próbki, które nie spełniają tych kryteriów, poddawane są ponownemu badaniu: 
	Gęstość klastra (gęstość (K / mm2)): 945K - 1800K 
	Procent odczytów przechodzących przez filtr (klastry PF (%)): >90% 
	Wyniki jakości (%>=Q30): >85% 
	Wyrównanie PhiX (wyrównanie%): 1,5% - 10% 
	Wskaźnik błędów PhiX (%): <1.0%</li>
</ol>

<ol><li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).</li>
<li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+Recombination%3A+Mechanism%2C+Errors%2C+and+Fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li>
<li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire%3A+pitfalls+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li>
<li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+questions%2C+new+tools%3A+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li>
<li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li>
<li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109(2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73(2019).</li>
<li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn%27s+Disease+Through+Deep+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li>
<li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn%27s+disease+and+ulcerative+colitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li>
<li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journam+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li>
<li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn%27s+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2FHighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333(2013).</li>
<li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies%3A+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157(2015).</li>
<li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li>
<li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688(2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li>
<li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders%3A+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li>
<li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+towards+personalized+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+System+Biology+and+Applications%22%5BJournal%5D)">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9(2018).</li>
<li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962(2018).</li>
<li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li>
<li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li>
<li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li>
<li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing%3A+Techniques+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638(2018).</li>
<li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zmiany w liczebności i funkcji limfocytów B i T są często spotykane w różnych nowotworach złośliwych18, przewlekłych chorobach zapalnych (np. wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego i reumatoidalnym zapaleniu stawów)10,19 oraz w różnych niedoborach odporności17,20. Obecna metoda wykorzystuje NGS, aby ułatwić dogłębny wgląd w repertuar TCR i BCR, umożliwiając wykrycie subtelnych zmia...

Adaptacyjny układ odpornościowy, składający się z limfocytów T i B, wykorzystuje pamięć immunologiczną do rozpoznawania wcześniej napotkanego antygenu i inicjowania szybkiej odpowiedzi. Limfocyty są wytwarzane w szpiku kostnym i dojrzewają w grasicy (limfocyty T) lub szpiku kostnym (limfocyty B). Zarówno receptor limfocytów T (TCR), jak i receptor limfocytów B (BCR) wykazują unikalne konfiguracje, które umożliwiają rozpoznawanie określonych antygenów. W homeostazie limfocyty T i B stale krążą i badają biliony różnych peptydów prezentowanych na komórkach prezentujących antygen. Ligacja TCR lub BCR specyficznego antygenu o wysokim powinowactwie, wraz z odpowiednią kostymulacją, prowadzi do aktywacji komórek, w wyniku której dochodzi do wydzielania cytokin, ekspansji klonalnej i wytwarzania przeciwciał, w przypadku limfocytów B.
Ogromna liczba różnych limfocytów T lub B jest zbiorczo określana jako repertuar immunologiczny, umożliwiający rozpoznawanie niezliczonych różnych epitopów. Aby wygenerować tak szeroki repertuar, zachodzi złożony proces losowego składania różnych segmentów genów, tworzący niemal nieskończone kombinacje receptorów, które mogą wiązać unikalne antygeny1. Proces ten, zwany rekombinacją V(D)J, obejmuje rearanżacje różnych genów zmiennych (V), różnorodności (D) i łączenia (J), którym towarzyszą losowe delecje i insercje nukleotydów w złączach2.
Architektura adaptacyjnego układu odpornościowego od wielu dziesięcioleci interesuje naukowców z różnych dziedzin. W przeszłości sekwencjonowanie Sangera, komplementarne spekkratyzowanie regionu 3 (CDR3) i cytometria przepływowa były używane do charakteryzowania repertuaru immunologicznego, ale zapewniały niską rozdzielczość. W ciągu ostatniej dekady postępy w metodach sekwencjonowania nowej generacji (NGS) umożliwiły dogłębny wgląd w charakterystykę i skład indywidualnego repertuaru TCR i BCR3,4. Te wysokoprzepustowe systemy (HTS) sekwencjonują i przetwarzają jednocześnie miliony przegrupowanych produktów TCR lub BCR i umożliwiają analizę w wysokiej rozdzielczości określonych limfocytów T i B na poziomie nukleotydów lub aminokwasów. NGS zapewnia nową strategię badania repertuaru immunologicznego zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Badania z wykorzystaniem HTS wykazały zmieniony repertuar TCR i BCR w chorobach autoimmunologicznych5, primary immunodeficiencys6,7 i nowotworach złośliwych, takich jak ostra białaczka szpikowa8. Korzystając z NGS, my i inni wykazaliśmy oligoklonalną ekspansję specyficznych klonów komórek T i B u pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), w tym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i chorobą Leśniowskiego-Crohna9,10,11,12,13,14. Ogólnie rzecz biorąc, badania z różnych dziedzin sugerują, że zmiany w repertuarze odgrywają kluczową rolę w patogenezie zaburzeń o podłożu immunologicznym.
Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z biopsji jelita i krwi, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR dla NGS oraz wykonywania sekwencjonowania. Zapewniamy również podstawowe kroki w analizie danych z repertuaru immunologicznego. Protokół ten może być również stosowany do generowania bibliotek TCRα, TCRγ i IGL. Metoda jest również kompatybilna z innymi narządami (np. węzłami chłonnymi, nowotworami, płynem maziowym, tkanką tłuszczową itp.), o ile stosowane są protokoły trawienia specyficzne dla tkanek.

<table><tbody><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml mikroprobówki</td><td>wirówkowe Axygen</td><td>8187631104051</td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td><td>Greiner</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Merck</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Amplitaq Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Blok ciepła</td><td>Bioer</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Bufor próbki o wysokiej czułości D1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5603</td><td>Do stacji taśmowej</td></tr><tr><td>Taśma ekranowa o wysokiej czułości D1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>Do stacji taśmowej. Probówki sprzedawane osobno</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania Lymphotrack</td><td>Invivoscribe</td><td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td><td>Każdy zawiera 24 indeksy</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cykl)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td>Zawiera standardowy typ komory przepływowej i wszystkie wymagane odczynniki</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>Paski PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0792</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Invitrogen</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>Zawiera bufor, barwnik, wzorce i specjalistyczne probówki Shaker</td></tr><tr><td></td><td>Biosan</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Tapestation 2100</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>ultra czysta woda</td><td>Bio-lab</td><td>7501</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji DNA Wizard</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Zawiera roztwór do lizy komórek, roztwór do lizy jąder i bufor do wytrącania białek</td></tr></tbody></table>

analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów t i b przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji

T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

Pamięć immunologiczna, cecha charakterystyczna odporności adaptacyjnej, jest zarządzana przez limfocyty T i B. W krążeniu i różnych narządach znajdują się miliardy unikalnych klonów komórek T i B, a każdy z nich może wiązać określony antygen, co prowadzi do proliferacji, różnicowania i/lub wydzielania cytokin. Ogromna heterogeniczność limfocytów T i B jest generowana przez losową rekombinację różnych segmentów genetycznych. Technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS), opracowane w ostatniej dekadzie, umożliwiają bezprecedensowy dogłębny wgląd w repertuar immunologiczny receptorów limfocytów T i B. Badania nad różnymi stanami zapalnymi, niedoborami odporności, infekcjami i nowotworami złośliwymi wykazały wyraźne zmiany w klonalności, wykorzystaniu genów i właściwościach biofizycznych repertuaru immunologicznego, dostarczając ważnych informacji na temat roli adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych w różnych zaburzeniach.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół dla NGS repertuaru immunologicznego limfocytów T i B z krwi i tkanek. Przedstawiamy proces rozwoju począwszy od izolacji DNA, poprzez przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie na sekwenatorze NGS, a skończywszy na podstawowych analizach. Metoda ta umożliwia eksplorację specyficznych limfocytów T i B na poziomie nukleotydów lub aminokwasów, a tym samym może identyfikować dynamiczne zmiany w populacjach limfocytów i parametry różnorodności w różnych chorobach. Technika ta powoli wchodzi do praktyki klinicznej i ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych biomarkerów, stratyfikacji ryzyka i medycyny precyzyjnej.

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji DNA z tkanki jelitowej i krwi, przygotowanie bibliotek do NGS oraz podstawowe etapy procesu sekwencjonowania w celu analizy repertuaru immunologicznego. Proces ten pozwoli na wygenerowanie plików fastq, które mogą zostać następnie przekonwertowane na pliki fasta do wykorzystania na międzynarodowej platformie ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST. To HTS wykonuje i zarządza wieloma analizami dziesiątek tysięcy zreorganizowanych sekwencji TCRβ i IGH na poziomie nukleotydów<sup class...

Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z próbek krwi i biopsji jelitowych, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR do sekwencjonowania nowej generacji, wykonywania przebiegu NGS i podstawowej analizy danych.

Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Metoda ta umożliwia eksplorację specyficznych limfocytów T i B na poziomie nukleotydów lub aminokwasów, a tym samym może identyfikować dynamiczne zmiany w populacjach limfocytów i parametry różnorodności w różnych zaburzeniach. Zaletą sekwencjonowania nowej generacji jest możliwość identyfikacji unikalnych klonów limfocytów T lub B i śledzenia ich w różnych miejscach anatomicznych lub u różnych osób. Ma to potencjał w zakresie identyfikacji nowych biomarkerów w różnych chorobach.Tę procedurę zademonstruje Naomi Salamon, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Zacznij od przeprowadzenia trawienia i lizy komórek w biopsjach jelitowych. Pobrać biopsje jelitowe świeżo pobrane lub przechowywane w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza.Jeśli używasz zamrożonych biopsji, rozmroź je na lodzie. Dodaj 600 mikrolitrów roztworu do lizy jąder do sterylnej 1,7-mililitrowej probówki wirówkowej, schłodzonej na lodzie. Następnie umieść biopsję w probówce i inkubuj ją w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut.Dodaj 17,5 mikrolitra proteinazy K o stężeniu 20 miligramów na mililitr i inkubuj probówkę przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Po inkubacji pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez pięć minut. W celu wyizolowania DNA z krwi delikatnie kołysz probówką, aż zostanie dokładnie wymieszana.Następnie przenieś krew do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej dziewięć mililitrów roztworu do lizy komórek. Odwróć probówkę kilka razy podczas 10-minutowego okresu inkubacji w temperaturze pokojowej. Wirować przy 600 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie wyrzuć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając widocznej białej osadki. Energicznie obracaj probówkę przez 15 sekund, aż do całkowitego ponownego zawieszenia. Dodaj trzy mililitry roztworu do lizy jąder i kilkakrotnie pipetuj pipetą, powodując, że roztwór stanie się lepki.Dodać białkowy bufor wytrącający się do próbki. Następnie energicznie wiruj przez 20 sekund i inkubuj go na lodzie przez pięć minut. Wirować przy 16 000 g przez cztery minuty, aby utworzyć szczelny osad zawierający wytrącone białka.Ostrożnie przenieś supernatant bez naruszania osadu do nowej probówki o pojemności 1,7 mililitra. Dodaj jeden mililitr 2-propanolu do probówki zawierającej supernatant i delikatnie wymieszaj, odwracając. DNA powinno stać się widoczne jako biała unosząca się substancja.Odwirować przy 16 000 g przez jedną minutę i całkowicie usunąć supernatant. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć rurkę. Odwirować go w temperaturze 16 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant. Powtórz płukanie etanolem. Następnie pozostaw osad DNA do wyschnięcia na powietrzu przez 10 do 15 minut.Dodaj 50 mikrolitrów ultraczystej wody do DNA i przeprowadź kwantyfikację DNA zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Użyj 150 nanogramów DNA, aby przygotować bibliotekę do sekwencjonowania. Umieść pipety i końcówki w kapturze ze światłem UV na 15 minut, aby rozbić resztki DNA.W międzyczasie pozwól, aby różne probówki indeksujące i polimeraza DNA rozmroziły się na lodzie. W kapturze biologicznym dodaj 45 mikrolitrów z różnych probówek indeksowych do probówek PCR, uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Następnie dodaj 0,2 mikrolitra polimerazy DNA i pięć mikrolitrów przygotowanego DNA do probówek PCR.Uruchom PCR za pomocą wstępnie ustawionego programu zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj kulek magnetycznych do usunięcia nadmiaru starterów, nukleotydów i enzymów. Podgrzej kulki do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut i przygotuj wystarczającą ilość świeżego 80% etanolu na 400 mikrolitrów na próbkę.Dodaj kulki do każdej probówki do PCR i wymieszaj, pipetując 10 razy. Inkubować probówki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umieść zmieszaną próbkę na stojaku magnetycznym na pięć minut.Następnie zassać klarowny płyn i wyrzucić. Zassać pozostałą ciecz za pomocą końcówki o pojemności 10 mikrolitrów. Dodaj 200 mikrolitrów 80% etanolu do każdej próbki i inkubuj przez 30 sekund.Odessać 195 mikrolitrów etanolu i wyrzucić. Następnie odessać pozostały płyn za pomocą końcówki o pojemności 10 mikrolitrów. Powtórz płukanie etanolem.Następnie otwórz nakrętki probówek i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut. Po pięciu minutach wyjmij próbki ze stojaka magnetycznego i dodaj 25 mikrolitrów buforu elucyjnego. Mieszać pipetując do uzyskania jednorodnej konsystencji i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.Umieść probówki na stojaku magnetycznym na pięć minut. Następnie przenieś 22 mikrolitry do nowej probówki PCR i zmierz stężenie DNA. Określ ilościowo amplikon zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.Po obliczeniu końcowego stężenia DNA i wielkości piku produktu w parach zasad, należy przygotować nową mieszaninę rozcieńczeń dla każdej próbki i przenieść jej dwa mikrolitry do nowej mieszanki pulowej. Przygotuj świeży roztwór 0,2 normalnego wodorotlenku sodu i dodaj 10 mikrolitrów do rozcieńczonej biblioteki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby zdenaturować dwuniciowe DNA.Następnie dodaj 980 mikrolitrów wstępnie schłodzonego buforu z zestawu do probówki zawierającej DNA i krótko zwiruj. Załaduj 600 mikrolitrów końcowej biblioteki na wyznaczony wkład i umieść próbki w maszynie. Aby przeprowadzić analizę sekwencjonowania, pobierz metryki sekwencjonowania z sekwencera i sprawdź, czy dane mieszczą się w odpowiednich zakresach.Powtórzyć przebieg dla próbek, które nie spełniają kryteriów. Protokół ten został wykorzystany do przeprowadzenia podstawowej analizy reprezentatywnych autologicznych próbek krwi i odbytnicy pacjenta z niedoborem receptora IL10 i ciężkim IBD o początku w dzieciństwie w wywiadzie. Próbki oznaczono zarówno pod kątem repertuaru TCR-beta, jak i IGH.Wszystkie klony można zidentyfikować na podstawie ich unikalnej sekwencji na poziomie nukleotydów lub aminokwasów. Sekwencje te mogą być porównywane między różnymi pacjentami w poszukiwaniu wspólnych klonów lub u tego samego pacjenta między różnymi miejscami anatomicznymi. Poniżej przedstawiono pięć najczęściej występujących klonów dla każdej próbki.Obrazy TreeMap zostały wygenerowane w celu uzyskania szerokiego przeglądu repertuaru. Każdy kolorowy kwadrat reprezentuje inny klon, a rozmiar jest skorelowany z jego częstotliwością. Te obrazy TreeMap pokazują klonalną ekspansję w jelitowym repertuarze IGH.Natomiast w repertuarze TCR-beta obserwuje się wyraźną ekspansję klonalną we krwi w porównaniu z jelitem autologicznym. Na poziomie genu NGS dostarcza informacji dotyczących użycia V, D i J na poziomie genu, rodziny lub allelu. Co więcej, specyficzne kombinacje VDJ można wywnioskować z danych dotyczących repertuaru TCR-beta i IGH, ujawniając zróżnicowane wzorce wykorzystania genów w różnych warunkach.Protokół ten może być stosowany zarówno do DNA, jak i RNA i może być używany do generowania repertuarów TCR-alfa, TCR-gamma i IGL. Jest również kompatybilny z innymi narządami po niewielkich modyfikacjach trawienia.

t-b-cell-receptor-immune-repertoire-analysis-using-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten protokół opisuje podejście do badania rekombinowanych regionów VDJ łańcucha ciężkiego immunoglobuliny chłoniaków poprzez głębokie sekwencjonowanie i odzyskanie rearanżacji VDJ i statusu hipermutacji somatycznej w celu nakreślenia klonalnej architektury pojedynczego guza. Porównanie architektury klonalnej między sparowaną diagnozą a próbkami nawrotu chłoniaka ujawnia tryby ewolucji klonalnej nawrotu chłoniaka.

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR).  Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

Tutaj opisujemy połączone sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i protokół budowy biblioteki nowej generacji o niskim wkładzie przeznaczony do generowania wysokiej jakości danych o całym eksomie z komórek Hodgkina Reeda-Sternberga (HRS) klasycznego chłoniaka Hodgkina (CHL).

Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Obecny protokół łączy sekwencjonowanie łańcucha alfa i beta TCR w parach pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych kompatybilnych z ekspresją TCR in vitro i in vivo.

Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Tutaj opisujemy protokoły analizy i wizualizacji struktury i budowy całego repertuaru przeciwciał. Wiąże się to z pozyskiwaniem ogromnych sekwencji RNA przeciwciał za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Identyfikacja repertuaru przeciwciał mysich i ludzkich za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Niniejszy artykuł przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania składu immunologicznego aorty. W pracy zaprezentowano również dodatkową technikę, która umożliwia oddzielne badanie otaczającej osłonki zewnętrznej oraz ściany naczynia. Metoda ta otwiera możliwości przeprowadzania analiz fenotypowych leukocytów aortalnych oraz zastosowania wielu testów immunologicznych w badaniach nad miażdżycą.

Analiza cytometryczna komórek odpornościowych w aortach mysich

Poznaj metodę analizy repertuaru receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Technika ta umożliwia identyfikację unikalnych klonów komórek immunologicznych w różnych tkankach i zastosowanie w badaniach biomarkerów chorób.

Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów