Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

In vitro lub skonstruowany model ludzkiego naskórka został po raz pierwszy opracowany w latach dziewięćdziesiątych, a jego głównym celem było opracowanie alternatywnych metod testowania dla eksperymentów na zwierzętach. Te modele naskórka 3D są obecnie powszechnie używane do testowania zarówno bezpieczeństwa, jak i skuteczności składników kosmetycznych. Podczas gdy można go kupić u kilku dostawców tkanek, możliwość odtworzenia modelu 3D w laboratorium zapewnia większą elastyczność w punkcie końcowym.

Istnieje kilka artykułów naukowych opisujących pokrótce protokół rekonstytucji modelu 3D naskórka, ale do tej pory nie było dostępnego filmu pokazującego krytyczne etapy procesu rekonstytucji. To jest powód publikacji tego artykułu wideo. Przygotowanie we własnym zakresie zrekonstruowanego ludzkiego naskórka pozwala na dużą swobodę w procesie hodowli, takim jak zmiany w składzie pożywki hodowlanej, wyzwalacze stresu prozapalnego lub oksydacyjnego, wyciszanie interesujących genów oraz hamowanie lub stymulacja niektórych procesów biologicznych.

Na początek rozmrozić fiolkę z 1 milionem kriokonserwowanych normalnych ludzkich keratynocytów naskórka lub NHEK w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zanurzając część fiolki w wodzie. Inkubować fiolkę przez jedną do dwóch minut w łaźni wodnej, aż będzie widoczny tylko mały kawałek lodu. Ponownie zawiesić komórki bardzo ostrożnie, pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy.

Przenieść zawiesinę komórek do dwóch kolb T75 zawierających łącznie 15 mililitrów wstępnie ostrzeżonej pożywki do rozmrażania, co daje gęstość wysiewu 6,7 razy 10 do czwartej komórki na centymetr kwadratowy. Wstępnie napełnij 24-dołkowe płytki 1,5 mililitra zanurzonego podłoża, najlepiej za pomocą pipety dozownika. Po wyhodowaniu komórek do 80% konfluencji, są one gotowe do wysiewu we wkładkach do hodowli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka, czyli RHE.

Usunąć podłoże podstawowe z kolb T75 za pomocą NHEKs. Przepłukać komórki, dodając pięć mililitrów wstępnie podgrzanego PBS do każdej kolby T75, a następnie usunąć PBS z kolb. Dodaj dwa do trzech mililitrów wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA do każdej kolby, upewniając się, że roztwór trypsyny jest równomiernie rozprowadzony na obszarze hodowli komórkowej kolby.

Umieścić kolby w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery minuty, a następnie sprawdzić, czy komórki odrywają się za pomocą mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu. Uderzyć kolbę, aby pomóc komórkom uwolnić się z powierzchni kolby. Po odłączeniu wszystkich komórek dodać równą objętość wstępnie podgrzanego inhibitora trypsyny do każdej kolby T75 i przenieść zawiesinę komórek z kolb do probówki wirówkowej.

Przepłukać kolby pięcioma mililitrami wstępnie podgrzanego PBS i przenieść je do probówki wirówkowej zawierającej zawiesinę komórek. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 400 razy G przez pięć minut. Ostrożnie wyrzucić większość supernatantu, pozostawiając około 100 do 200 mikrolitrów w probówce.

Delikatnie przesuń rurkę palcami, aby ostrożnie poluzować granulkę. Delikatnie zawiesić osad komórek w małej objętości zanurzonego podłoża, pipetując w górę i w dół od 5 do 10 razy, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek. Zacznij od małej objętości, aby uniknąć tworzenia się agregatów komórkowych i dodaj do jednego mililitra zanurzonego podłoża na początkową kolbę T75.

Policz komórki w zawiesinie, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego. Rozcieńczyć zawiesinę komórek dodatkowym zanurzonym podłożem, aby osiągnąć stężenie 3,525 razy 10 do piątej komórki na mililitr, stosując pierwsze równanie podane w manuskrypcie tekstowym. Przeprowadzić drugie zliczanie komórek rozcieńczonego roztworu i użyć drugiego równania z rękopisu tekstowego, aby obliczyć objętość zawiesiny komórkowej, która ma zostać wysiana do wkładki hodowlanej.

Zawieś 24-dołkowe wkładki hodowlane w najwyższym miejscu płytki nośnej i przenieś płytkę nośną na 24-dołkową płytkę wstępnie napełnioną zanurzonym podłożem. Dodać określoną objętość zawiesiny komórek do każdej wkładki, uważając, aby nie dotknąć wkładki. Po wysianiu inkubować 24-dołkowe płytki przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zniwelować efekt krawędzi.

W tym czasie nie przesuwaj talerzy. Przenieś płytki do inkubatora do hodowli komórkowych i pozostaw je w zanurzeniu na trzy dni. Po trzydniowej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych należy wystawić komórki, które przylgnęły do powierzchni błony, na granicę faz powietrze-ciecz lub ALI, usuwając zanurzone podłoże z komory wierzchołkowej za pomocą systemu aspiracji i szklanej pipety Pasteura.

Napełnij nowe 24-dołkowe płytki 1,5 mililitra świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki ALI i przenieś płytki nośne z wkładkami hodowlanymi na nowe płytki wielodołkowe. Przenieść płytki wielodołkowe z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Odświeżaj pożywkę ALI co dwa do trzech dni przez 14 dni.

Keratynocyty w hodowli 2D wykazują tradycyjną morfologię o spójnym wielokątnym kształcie. Po 15 dniach w ALI zrekonstruowany ludzki naskórek tworzy w pełni rozwarstwioną tkankę, na co wskazują jej cztery główne warstwy naskórka. Analiza ultrastrukturalna zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w różnych punktach czasowych protokołu rekonstytucji ujawnia proces rogowacenia, ze zwiększoną liczbą warstw rogówki w czasie.

Keratynocyty w naskórku wykazują różne profile ekspresji białek w zależności od etapu ich różnicowania. Ekspresja inwolukryny występuje głównie w warstwie SG, podczas gdy ekspresja filagryny i lorykryny znajduje się w górnych warstwach. Ekspresję keratyny-10 stwierdzono we wszystkich żywotnych warstwach z wyjątkiem warstwy SB.

Zrekonstruowany naskórek ludzki wykazuje funkcjonalne połączenia desmosomalne, na co wskazuje ekspresja Desmogleiny-1 w przestrzeni międzykomórkowej żywotnych warstw naskórka. Właściwości barierowe zrekonstruowanego modelu naskórka badano, oceniając żywotność tkanek po miejscowym leczeniu znanym czynnikiem zaburzającym barierę oraz oceniając integralność tkanki. Integralność tkanek określono po 15 dniach, mierząc TEER za pomocą woltomierza.

Badano reakcję naskórka na lipopolisacharydy i czynnik martwicy nowotworów alfa. Zarówno leczenie LPS, jak i TNF alfa było nietoksyczne. w stosunku do sterowania Triton X-100.

Uwalnianie interleukiny-1 alfa i interleukiny-8 w pożywce RHE określono ilościowo za pomocą lizy IL. Leczenie LPS skutkowało statystycznie istotną regulacją w górę w uwalnianiu interleukiny-1 alfa i interleukiny-8. Leczenie TNF alfa skutkowało statystycznie istotną regulacją w górę tylko w uwalnianiu interleukiny-1 alfa.

Jednak wyraźną tendencję do zwiększonego poziomu interleukiny-8 zaobserwowano również po stymulacji TNF alfa. Zgodnie z tym protokołem, TEER może być mierzony jako wartość integralności bariery. Żywotność lub cytotoksyczność można zmierzyć na przykład za pomocą testu MTT lub LDH.

Supernatant może być używany do pomiaru wydzielania cytokin lub innych białek. Ponadto tkanka może być wykorzystana do badania ekspresji białek lub genów będących przedmiotem zainteresowania.