Polaryzacja ludzkich komórek pochodzących z monocytów M1 i M2 oraz analiza za pomocą cytometrii przepływowej po zakażeniu Mycobacterium tuberculosis

Protokół ten daje możliwość śledzenia polaryzacji immunologicznej ludzkich komórek pochodzących z monocytów w oparciu o wizualizację i głęboką charakterystykę Mtb znakowanego zielonym fluorescencyjnym białkiem w różnych podzbiorach makrofagów przy użyciu 10-kolorowej cytometrii przepływowej. Jest to skuteczna i powtarzalna metoda badania odpowiedzi na zakażenie Mtb w spolaryzowanych makrofagach M1 lub M2, w tym ocena fenotypu i funkcji przed i po zakażeniu. Aby wyizolować PBMC z ludzkich kożuchów kożuchowych, użyj pipety, aby powoli nałożyć 15 mililitrów krwi kożucha po boku 50-mililitrowej probówki na 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości i oddzielić komórki przez odwirowanie.

Użyj sterylnej pipety Pasteura, aby usunąć górną warstwę osocza i ostrożnie przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj pożywkę RPMI bez surowicy do komórek do końcowej objętości 50 mililitrów i delikatnie odwróć probówkę kilka razy przed odwirowaniem. Następnie ponownie zawieś komórki w 20 mililitrach pożywki bez surowicy w celu zliczenia.

Aby zainicjować różnicowanie makrofagów, rozcieńczyć komórki do 5 razy 10 do 6 komórek na mililitr stężenia pożywki bez surowicy i zasiać dwa mililitry komórek w pojedynczych dołkach sześciodołkowej płytki. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na dwie do trzech godzin, aby komórki przylgnęły do dna studzienki. Pod koniec inkubacji przemyć studzienki trzykrotnie jednym mililitrem pożywki wolnej od surowicy na przemycie i dodać dwa mililitry kompletnej pożywki RPMI uzupełnionej 50 nanogramami na mililitr GM-CSF lub 50 nanogramami na mililitr M-CSF dla różnicowania M1 lub M2 odpowiednio do każdej studzienki przylegających komórek.

Trzy dni po rozpoczęciu polaryzacji ostrożnie zastąp jeden mililitr supernatantu z każdej studzienki jednym mililitrem świeżej, kompletnej pożywki uzupełnionej odpowiednimi czynnikami wzrostu. W szóstym dniu hodowli dodać 50 nanogramów na mililitr interferonu gamma i 10 nanogramów na mililitr LPS do studzienek traktowanych GM-CSF i 20 nanogramów na mililitr IL-4 do studzienek poddanych działaniu M-CSF. Regularnie sprawdzaj morfologię kultur komórkowych pochodzących z monocytów za pomocą mikroskopii świetlnej, aby upewnić się, że mniejsze monocyty różnicują się w większe komórki podobne do makrofagów.

Aby założyć hodowlę Mtb, w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego III, wymieszaj jednomililitrową porcję rozmrożonej zawiesiny bakterii z dziewięcioma mililitrami TB kompletnej pożywki w 50-mililitrowej probówce z filtrowaną nakrętką do 24-godzinnej inkubacji w probówce w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia zbierz bakterie przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 15 do 20 mililitrach świeżej kompletnej pożywki TB w nowej 50-mililitrowej probówce do hodowli z filtrowaną nasadką przed powrotem bakterii do inkubatora do hodowli komórkowych. Po siedmiu do 10 dniach hodowli przemyj bakterie dwa razy w 35 do 40 mililitrach sterylnego buforu do płukania na pranie, ponownie zawieszając bakterie w jednym mililitrze pożywki RPMI bez surowicy po drugim praniu.

Dodaj kolejne dziewięć mililitrów bezsurowicowej pożywki RPMI do bakterii i poddaj bakterie sonikacji w kąpieli wodnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zmierz gęstość optyczną jednego mililitra zawiesiny bakteryjnej o długości fali 600 nanometrów w spektrofotometrze umieszczonym w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Aby zainfekować komórki pochodzące z monocytów, rozcieńczyć bakterie do 5 razy 10 do 6 jednostek tworzących kolonię na mililitr stężenia w pożywce bez surowicy i zastąpić supernatant w każdym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej jednym mililitrem świeżej pożywki bez surowicy i jednym mililitrem zawiesiny bakterii na studzienkę, aby uzyskać wielokrotność infekcji wynoszącą pięć.

Po czterogodzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych przemyć każdą studzienkę trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego buforu do płukania na mycie, ostrożnie przechylając płytkę, aby po każdym przemyciu usunąć całą objętość buforu z rogów studzienek. Następnie ponownie zawiesić zakażone Mtb komórki pochodzące z monocytów w dwóch mililitrach kompletnej pożywki bez antybiotyków. Aby wybarwić komórki do cytometrii przepływowej, inkubuj zakażone komórki z jednym mililitrem buforu FACS uzupełnionego 0,5 milimolowym EDTA na studzienkę przez co najmniej 30 minut.

Pod koniec inkubacji zebrać oderwane komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść je do pojedynczych probówek do mikrowirówek z nakrętką w celu odwirowania. Ponownie zawiesić komórki w około 50 mikrolitrach koktajlu przeciwciał anty-ludzkich sprzężonych z fluorochromem i barwnika żywotności będącego przedmiotem zainteresowania i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Po umyciu utrwalić komórki 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego buforu utrwalającego przez 30 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.

Po utrwaleniu i umyciu ponownie zawieś komórki w 400 mikrolitrach buforu FACS i przenieś komórki do jednomililitrowych probówek wirówek. Aby przeanalizować komórki, użyj kulek kompensacyjnych, aby skompensować sygnał fluorescencyjny dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem w koktajlu i użyj niebarwionych komórek, aby ustawić bramę dla ujemnej populacji komórek. Następnie należy pobrać co najmniej 50 000 komórek na próbkę.

Zarówno komórki pochodzące z monocytów M1, jak i M2 wykazują pionowe przesunięcie do wyższej ziarnistości i zmniejszonego rozmiaru komórki po zakażeniu Mtb. Zwiększoną śmierć komórek obserwuje się również w komórkach M1 i M2 zakażonych Mtb przy wielokrotności infekcji wynoszącej pięć w porównaniu z niezakażonymi komórkami M0. Warto zauważyć, że znacznie wyższą ekspresję Mtb GFP obserwuje się w komórkach M2 po czterech godzinach infekcji w porównaniu z komórkami M1.

Niezakażone komórki M1 i M2 można scharakteryzować odpowiednio ich receptorem CD64 i CD86 lub CD200 oraz współekspresją CD163. Po czterech godzinach od zakażenia Mtb obserwuje się zwiększoną częstość komórek dodatnich receptora CD200 w spolaryzowanych komórkach M1 Mtb GFP, podczas gdy ekspresja CD163 jest zmniejszona w komórkach M2. Bakterie Mtb GFP można również zaobserwować w komórkach M1 CD64 dodatnich i komórkach M2 CD163 dodatnich za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Analiza UMAP pokazuje, że cztery godziny infekcji Mtb nie wystarczą, aby wpłynąć na polaryzację makrofagów, podczas gdy 24 godziny infekcji powodują wyraźnie oddzielone skupiska niezakażonych i zakażonych komórek M1 i M2, które wyrażają odrębne profile ekspresji markerów powierzchniowych. Co więcej, analiza PhenoGraph pokazuje, że 24 różne klastry o różnych rozmiarach są unikalnie rozmieszczone wśród komórek niezakażonych M1 i M2 oraz zakażonych Mtb. Skuteczność polaryzacji M1 lub M2 lub zakaźności Mtb może się znacznie różnić między dawcami ludzkimi.

Dlatego zaleca się włączenie co najmniej dwóch dawców do każdego eksperymentu w celu zmniejszenia różnic eksperymentalnych. Model ten umożliwia jednoczesną ocenę ludzkich makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej, mikroskopii konfokalnej, analizy ekspresji mRNA, multipleksowych testów czynników rozpuszczalnych oraz kwantyfikacji bakterii przy użyciu ekspresji GFP lub jednostek tworzących kolonie.