Name: Hodowla 3D organoidów z nabłonka kosmków jelitowych poddawanego dedyferencjacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj metodę hodowli organoidów 3D z dedyferencjonujących kosmków jelitowych myszy. Technika zachowania mezenchymy umożliwia badanie biologii komórek macierzystych i regeneracji jelit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja została wsparta przez Nagrodę Numer K22 CA218462-03 od NIH National Cancer Institute. Limfocyty HEK293-T eksprymujące R-Spondin1 były hojnym darem od dr Michaela P. Verziego.

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na myszach, w tym stosowanie tamoksyfenu i eutanazja przez zwichnięcie szyjki macicy, uzyskały aprobatę Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie Stevensa w dziedzinie ekhnologii.
1. Myszy
UWAGA: Generacja Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Myszy Villin-CreERT2 zostały wcześniej opisane 3. Wykorzystano dorosłe samice myszy w wieku od ośmiu do dwunastu tygodni.
<ol>
	<li>Indukować mutację Smad4KO:β-kateninaGOF w Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 z dootrzewnowym wstrzyknięciem tamoksyfenu w oleju kukurydzianym przez cztery kolejne dni.</li>
	<li>Poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy dziesięć dni po pierwszym wstrzyknięciu tamoksyfenu.</li>
	<li>Spryskaj brzuch 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się sierści myszy do jamy otrzewnej.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną nożyczkami preparacyjnymi, aby odsłonić jelito. Odizoluj jelito za pomocą nożyczek i kleszczy. 
	UWAGA: Jednoczesna utrata Smad4 wraz z mutacją przyrostu funkcji β-kateniny (Smad4KO; β-kateninaGOF) w nabłonku jelitowym uzyskano przez wstrzyknięcieSmad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Myszy Villin-CreERT2 codziennie przez cztery kolejne dni z 0,05 g tamoksyfenu/kg masy ciała w oleju kukurydzianym. Myszy te są zbierane dziesięć dni po pierwszym wstrzyknięciu tamoksyfenu, aby zapewnić obecność komórek wyrażających markery związane z komórkami macierzystymi w odróżnicowujących się kosmkach.</li>
</ol>
2. Izolacja i przygotowanie dwunastnicy
<ol>
	<li>Wypreparuj bliższą połowę dwunastnicy.</li>
	<li>Przepłukać dwunastnicę 5 ml lodowatego PBS w strzykawce o pojemności 10 ml, aby usunąć zawartość światła.</li>
	<li>Otworzyć dwunastnicę wzdłużnie nożyczkami kątowymi i położyć dwunastnicę płasko na 15 cm płytce Petriego na lodzie ze światłem dwunastnicy skierowanym w stronę operatora.</li>
</ol>
3. Izolacja kosmków przez skrobanie
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem skrobania należy umieścić sitko o oczkach 70 μm w jednym z dołków 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Napełnij wszystkie studzienki 4 ml 1x PBS i umieść 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej na lodzie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Zeskrob kosmki w następujący sposób, używając dwóch mikroskopijnych szkiełek podstawowych: jednego do przytrzymania dwunastnicy, a drugiego do zeskrobywania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B1).
	<ol>
		<li>Dwukrotnie zeskrob świetlistą stronę dwunastnicy powierzchownie w tę iz powrotem, aby usunąć śluz. Zastosuj nacisk tak, aby ten krok usunął warstwę śluzu, ale nie kosmki.</li>
		<li>Ponownie zeskrobać dwunastnicę, dwa razy w tę i z powrotem, wywierając taki sam nacisk jak w 3..1, podczas którego można zobaczyć kosmki zbierające się na szkiełkach (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B2). Jest to optymalne ciśnienie (które musi być określone empirycznie przez operatora), aby uzyskać kosmki bez uwięzi krypt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyć pipety transferowej o pojemności 1 ml zawierającej PBS w celu przeniesienia kosmków (zebranych na szkiełku z kroku 3.2.2) do sitka o oczkach 70 μm umieszczonego w naczyniu 6-dołkowym. Kosmki są zbierane w ten sposób, po każdym zadrapaniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B2).</li>
	<li>Umyć kosmki zebrane w sitku o wielkości 70 μm (od kroku 3.3), przenosząc sitko (wraz z kosmkami) przez szereg dołków w 6-dołkowym naczyniu zawierającym zimny PBS (~ 4 ml/studzienkę). Ma to na celu usunięcie luźnych krypt, jeśli takie istnieją.</li>
	<li>Za pomocą pipety p1000 przenieść zawiesinę kosmków w PBS (~ 3 ml) z sitka o średnicy 70 μm do nowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą 0,1% końcówki pipety p200 z powłoką BSA, na końcu, zassać 50 μl objętości zawiesiny kosmków na szkiełku podstawowym. Policz liczbę kosmków w kropli o objętości 50 μl pod 4-krotnym powiększeniem, aby określić stężenie kosmków w zawiesinie PBS. Na przykład, jeśli w badanej zawiesinie 50 μl znajduje się 10 kosmków, wówczas stężenie kosmków wynosi 0,2 kosmka/μl. Jest to również czas, aby potwierdzić brak krypt na uwięzi.</li>
	<li>Obliczyć objętość zawiesiny kosmków wymaganą do płytki w stężeniu 0,5 kosmka/μl matrycy BME-R1. Dodać dodatkowe 100 μl, aby uwzględnić błąd pipetowania i objętość wymaganą do badania mikroskopowego wymaganego do zapewnienia czystości kosmków. 
	UWAGA: Ciśnienie użyte w pierwszych dwóch zadrapaniach, które usuwa śluz, ale nie kosmki, powinno być stosowane w kolejnych zadrapaniach, podczas których kosmki zostaną uwolnione. Ogranicz liczbę zeskrobywania tam i z powrotem do dwóch po pierwszym zaobserwowaniu uwolnienia kosmków. Środek ten pozwala uniknąć uwolnienia kosmków z uwięzionymi kryptami. Niezbędna jest mikroskopowa ocena kosmków, aby upewnić się, że nie ma krypt na uwięzi.</li>
</ol>
4. Poszycie kosmków na matrycy BME-R1
<ol>
	<li>Używając końcówki pipety p200 pokrytej 0,1% BSA, przenieść do probówki mikrowirówkowej objętość kosmków (z kroku 3.6) wymaganą do płytki o gęstości ~ 6 kosmków na studzienkę w 12,5 μl matrycy BME-R1. Zastosowanie w tym momencie końcówki pokrytej powłoką BSA zapewnia, że kosmki, które są zbyt duże dla spiczastej końcówki, są zasysane bez blokowania lub utraty w wyniku przyklejenia się do boków końcówki.</li>
	<li>Wirować kosmki przez 2 minuty przy 200 x g w wirówce z chłodzeniem (4 °C) i usunąć supernatant.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.2, aby usunąć wszelkie pozostałości PBS i przejść do następnego kroku pod okapem z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić granulki kosmków w wymaganej ilości zimnego BME-R1 rozmrożonego na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą pipety p20 umieść 12,5 μl / studzienkę kosmków w matrycy BME-R1 w 3D na wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić zestalenie matrycy BME-R1.</li>
	<li>Dodaj 125 μl / studzienkę wstępnie podgrzanego podłoża ENR (naskórkowy czynnik wzrostu / Noggin / R-spondyna1): zaawansowane podłoże DMEM F-12, uzupełnione 1x Penicylina: Streptomycyna, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng / ml EGF, 100 ng / ml Noggin, 5% kondycjonowane podłoże z komórek HEK293-T eksprymujących R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylocysteiny i 0,05 mg / ml Primocin.</li>
	<li>Inkubować posiane kosmki w inkubatorze do hodowli tkankowych utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniać pożywkę co drugi dzień.</li>
	<li>Wyrzucić wszystkie studzienki, w których pojawiają się organoidy przed dwoma dniami posiewu, ponieważ najwcześniejszy punkt, w którym spodziewane są organoidy pochodzące z kosmków, to po dwóch dniach. 
	UWAGA: Wszystkie kosmki, które mają połowę lub więcej niż połowę długości kosmków, są liczone jako jeden kosmek. W przeciwieństwie do organoidów pochodzących z krypty, organoidy pochodzące z kosmków nie są oczekiwane w ciągu 24 godzin po posiewie. Wydaje się, że kosmki inicjujące organoidy ciemnieją i kurczą się przed utworzeniem organoidów. W związku z tym wszelkie studnie z organoidami rozwijającymi się w ciągu jednego dnia od posiewu należy wyrzucić, aby uniknąć prawdopodobieństwa, że pochodzą one z prawdopodobnego zanieczyszczenia krypty. Metodologia zastosowana do produkcji kondycjonowanych pożywek jest dostępna na życzenie.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li>
<li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li>
<li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li>
<li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li>
<li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
<li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li>
<li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc%28min%29+mice+downstream+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li>
<li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757(2013).</li>
<li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Metoda ta może potwierdzić zdolność do samoodnawiania się nabłonka kosmków odróżnicowujących, które pozyskują markery komórek macierzystych in vivo. Prawidłowy nabłonek jelitowy może powodować powstawanie organoidów z krypty, ale nie z przedziału kosmków, gdy jest hodowany w 3D ze względu na obecność komórek macierzystych w kryptach1. Tak więc tworzenie organoidów z odróżnicowanego nabłonka kosmków hodowanego w hodowlach 3D potwierdza powstawanie komórek macierzystych w wyniku odwrócenia ...

Krypty jelitowe, ale nie kosmki, tworzą organoidy, gdy są hodowane w matrycy Matrigel lub BME-R1. Te organoidy są samoorganizującymi się strukturami, często określanymi jako "mini-jelita" ze względu na obecność różnych zróżnicowanych linii, komórek progenitorowych i macierzystych obecnych w nabłonku jelitowym in vivo. Potencjał do tworzenia organoidów z krypt przypisuje się obecności komórek macierzystych1. Z drugiej strony kosmki jelitowe składają się tylko ze zróżnicowanych komórek, a zatem nie mogą tworzyć organoidów. Jednak mutacje2 lub warunki, które pozwalają na dedyferencjację nabłonka kosmków, mogą prowadzić do powstania komórek macierzystych w kosmkach 2,3. Ta zmiana losu skutkująca powstaniem łodygi w nabłonku kosmków może być potwierdzona przez posiew nabłonka nabłonka deróżnicującego kosmki w matrycy 3D w celu określenia ich potencjału tworzenia organoidów jako wskaźnika macierzystej łodygi de novo w nabłonku kosmków. Dlatego krytycznym aspektem tej procedury jest zapewnienie braku zanieczyszczenia kryptą.
Warunkowa mutacja Smad4KO:β-kateninyGOF powoduje dedyferencjację w nabłonku jelitowym zaznaczoną ekspresją proliferacji i markerów komórek macierzystych w kosmkach, a ostatecznie tworzenie struktur przypominających krypty w kosmkach określanych jako krypty ektopowe. Obecność komórek macierzystych tych zderóżnicowanych kosmków została określona przez ekspresję markerów komórek macierzystych w kryptach ektopowych (in vivo) oraz zdolność zmutowanych kosmków do tworzenia organoidów po posianiu Matrigel3. Poniższa procedura rozwija metodologię zastosowaną do potwierdzenia macierzystej nabłonka jelitowego odróżnicowującego się u myszy z mutacją Smad4KO β-kateninyGOF. Kluczową cechą tej metodologii izolacji kosmków było zastosowanie skrobania światła jelita, w przeciwieństwie do metody chelatacji EDTA4. W przeciwieństwie do metody chelatacji EDTA, izolacja kosmków przez skrobanie zachowuje większość leżącej pod spodem mezenchymy i pozwala dostosować ciśnienie skrobania w celu uzyskania kosmków bez uwięzionych krypt. Nacisk skrobania jest subiektywny dla operatora, stąd optymalne ciśnienie do uzyskania kosmków bez uwięzionych krypt musi być określone empirycznie przez operatora. Krytycznym aspektem tej procedury jest zapewnienie braku zanieczyszczenia kryptą poprzez badanie mikroskopowe kosmków zarówno przed, jak i po posiewie w matrycy BME-R1.
Kosmki jelitowe są zeskrobywane ze światła jelita za pomocą szkiełek i umieszczane w filtrze 70 μm i przemywane PBS, aby pozbyć się luźnych komórek lub krypt, jeśli takie istnieją, przed posiewem w matrycy BME-R1. Metoda kładzie nacisk na następujące kryteria mające na celu uniknięcie zanieczyszczenia kryptami: a) ograniczenie kosmków do bliższej połowy dwunastnicy, gdzie kosmki są najdłuższe, b) zminimalizowanie liczby zadrapań dających kosmki, c) przemycie filtra zawierającego kosmki przez serię PBS w sześciodołkowym naczyniu oraz d) potwierdzenie braku zanieczyszczenia krypty za pomocą badania mikroskopowego przed i po posiewie w matrycy BME-R1. Izolacja kosmków przez skrobanie, a nie przez chelatację EDTA, zapobiega całkowitej utracie leżącej pod spodem mezenchymy, która może dostarczać sygnały niszowe5, 6, 7, 8, jeśli jest to wymagane, do inicjacji organoidu z nabłonka kosmków.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowane media DMEM F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzydyna</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płyta denna U-bottom</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012932</td><td></td></tr><tr><td>zestaw ABC</td><td>Vector Labs</td><td>&nbsp; PK4001</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki kątowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-999</td><td></td></tr><tr><td>Bezzwierzęcy rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement (50X), bez witaminy A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek bez proteaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD44</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>1030001</tr><tr><td>Przeciwciało Cdx2</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>12306</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70-mikronowy sitko komórkowe</td><td>Nauki biologiczne</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex o zredukowanym czynniku wzrostu, typ R1</td><td>R& D</td><td>3433-005-R1</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-209</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HEK 293-T eksprymujące RSPO-1</td><td>Prezent od dr Michaela Verzi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermoscientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko do miroskopu</td><td>VWR</td><td>89218-844</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>p200 końcówki</td><td>VWR</td><td>46620-642</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (50 mg / ml)</td> <td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik sygnałowy</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>8112L</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla 3d organoidów z nabłonka kosmków jelitowych poddawanego dedyferencjacji

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Klonogenność organoidów z nabłonka jelitowego przypisuje się obecności w nim komórek macierzystych. Nabłonek jelita cienkiego myszy jest podzielony na krypty i kosmki: komórki macierzyste i proliferujące są ograniczone do krypt, podczas gdy nabłonek kosmków zawiera tylko zróżnicowane komórki. W związku z tym normalne krypty jelitowe, ale nie kosmki, mogą powodować powstawanie organoidów w kulturach 3D. Opisana tutaj procedura ma zastosowanie tylko do nabłonka kosmków ulegającego odróżnicowaniu prowadzącemu do macierzystości. Opisana metoda wykorzystuje warunkową zmutowaną mysz Smad4-loss-of-function:β-katenina (Smad4KO:β-kateninaGOF). Mutacja powoduje odróżnicowanie kosmków jelitowych i wytwarzanie komórek macierzystych w kosmkach. Kosmki jelitowe ulegające odróżnicowaniu są zeskrobywane z jelita za pomocą szkiełek podstawowych, umieszczane w sitku o wielkości 70 μm i kilkakrotnie przemywane w celu odfiltrowania wszelkich luźnych komórek lub krypt przed posiewem w matrycy BME-R1 w celu określenia ich potencjału tworzenia organoidów. Zastosowano dwa główne kryteria, aby upewnić się, że powstałe organoidy zostały opracowane z przedziału kosmków deróżnicujących, a nie z krypt: 1) mikroskopowa ocena izolowanych kosmków w celu zapewnienia braku jakichkolwiek krypt na uwięzi, zarówno przed, jak i po posianiu w matrycy 3D, oraz 2) monitorowanie przebiegu w czasie rozwoju organoidów z kosmków. Inicjacja organoidów z kosmków następuje dopiero dwa do pięciu dni po posiewie i wydaje się mieć nieregularny kształt, podczas gdy organoidy pochodzące z krypty z tego samego nabłonka jelitowego są widoczne w ciągu szesnastu godzin od posiewu i wydają się kuliste. Ograniczeniem metody jest jednak to, że liczba utworzonych organoidów i czas potrzebny do inicjacji organoidów z kosmków różnią się w zależności od stopnia odróżnicowania. W związku z tym, w zależności od specyfiki mutacji lub zniewagi powodującej odróżnicowanie, optymalny etap, na którym można zebrać kosmki, aby ocenić ich potencjał tworzenia organoidów, musi zostać określony empirycznie.

Kluczowym czynnikiem warunkującym sukces procedury jest zapobieganie kontaminacji kryptami. Rozwój organoidów z kosmków (a nie z jakichkolwiek zanieczyszczających krypt) zapewnia potwierdzenie czterech głównych kryteriów: 1) zapewnienie czystości pobranych kosmków poprzez badanie mikroskopowe przed i po wysianiu kosmków w BME-R1, 2) wysianie ograniczonej liczby kosmków na dołek, aby umożliwić indywidualną wizualizację wszystkich wysianych kosmków, 3) codzienne monitorowanie rozwoju organoidów; obrazy z przebiegu czasoweg...

Procedura opisuje izolację kosmków od nabłonka jelitowego myszy poddawanego dedyferencjacji w celu określenia ich potencjału do tworzenia organoidów.

Hodowla 3D organoidów z nabłonka kosmków jelitowych poddawanego dedyferencjacji

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Metoda ta może potwierdzić zdolność do tworzenia organoidów przez odróżnicowujący się nabłonek kosmków, które pozyskują markery komórek macierzystych in vivo. Zbieranie kosmków odbywa się za pomocą skrobania, a nie metody chelatacji EDTA, zapobiegając całkowitej utracie leżącej pod spodem mezenchymy, która może dostarczać sygnały niszowe, jeśli jest to wymagane do inicjacji organoidów. Metoda ta ma zastosowanie w tkankach nabłonkowych, w których fizycznie wyznacza się proliferacyjne i zróżnicowane przedziały, a komórki odróżnicowujące się wyrażają markery komórek macierzystych in vivo.Niektóre czynniki w tym protokole należy określić empirycznie, w tym optymalny etap zbioru kosmków i optymalne ciśnienie do skrobania kosmków, co wymaga czasu i praktyki. Indukować nokaut Smad4 i mutację wzmocnienia funkcji beta-kateniny u zmutowanych myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia tamoksyfenu i oleju kukurydzianego przez cztery kolejne dni. Po eutanazji myszy spryskaj brzuch 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się sierści myszy do jamy otrzewnej.Otwórz jamę brzuszną nożyczkami preparacyjnymi, aby odsłonić jelito i wyizolować jelito za pomocą nożyczek i kleszczy. Wypreparuj proksymalną połowę dwunastnicy, a następnie przepłucz dwunastnicę pięcioma mililitrami lodowatego PBS w 10-mililitrowej strzykawce, aby usunąć zawartość światła. Otwórz dwunastnicę wzdłużnie za pomocą kątowych nożyczek i połóż dwunastnicę płasko na 15-centymetrowej szalce Petriego na lodzie ze światłem dwunastnicy skierowanym w stronę operatora.Przed rozpoczęciem skrobania należy umieścić sitko o oczkach o rozmiarze 70 mikrometrów w jednym z dołków sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej. Napełnij wszystkie studzienki czterema mililitrami 1X PBS i umieść talerz na lodzie. Zeskrob kosmki za pomocą dwóch mikroskopijnych szkiełek podstawowych, jednego do przytrzymania dwunastnicy, a drugiego do zeskrobania.Zeskrob świetlistą stronę dwunastnicy powierzchownie dwa razy, aby usunąć śluz bez usuwania kosmków, a następnie zeskrob dwunastnicę jeszcze dwa razy, aby zebrać kosmki na szkiełkach bez wiązania krypt. Użyj jednomililitrowej pipety transferowej zawierającej PBS, aby przenieść kosmki do sitka o siatku o oczkach 70 mikrometrów w sześciodołkowym naczyniu. Zbieraj kosmki po każdym zadrapaniu.Aby usunąć luźne krypty, umyj kosmki zebrane za pomocą sitka o średnicy 70 mikrometrów, przenosząc sitko przez szereg dołków w sześciodołkowym naczyniu zawierającym cztery mililitry lodowatego PBS na studzienkę. Za pomocą pipety P1000 przenieś zawiesinę kosmków w około trzech mililitrach PBS z sitka o pojemności 70 mikrometrów do nowej 15-mililitrowej probówki na lodzie. Użyj 0,1% końcówki do pipety P200 z powłoką BSA, aby przenieść 50 mikrolitrów objętości zawiesiny kosmków na szklane szkiełko.Policz liczbę kosmków w kropli o pojemności 50 mikrolitrów pod 4-krotnym powiększeniem, aby określić stężenie kosmków w zawiesinie PBS i potwierdzić brak krypt na uwięzi. Aby pokryć kosmki kosmkami, użyj końcówki pipety P200 pokrytej 0,1% BSA, aby przenieść kosmki do probówki mikrowirówkowej w celu uzyskania gęstości posiewu sześciu kosmków na studzienkę w 12,5 mikrolitrach matrycy BME-R1. Wiruj kosmki przez dwie minuty w temperaturze 200 razy G w czterech stopniach Celsjusza.Usunąć supernatant i powtórzyć wirowanie w celu usunięcia wszelkich pozostałości PBS. W okapie z przepływem laminarnym delikatnie zawiesić granulki kosmków w wymaganej ilości zimnego BME-R1 rozmrożonego na lodzie. Używając pipety P20, umieść 12,5 mikrolitra kosmków w matrycy BME-R1 na dołek 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza.Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić zestalenie matrycy BME-R1. Do każdej studzienki dodać 125 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki ENR uzupełnionej zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Inkubować posiane kosmki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i zmieniać pożywkę co drugi dzień.Wyrzuć każdą studzienkę, w której pojawią się organoidy przed upływem dwóch dni. Istnieje różnica w wyglądzie organoidów wyłaniających się z krypt w porównaniu z niezróżnicowanym nabłonkiem kosmków z tego samego jelita myszy. Organoidy pochodzące z krypty pojawiają się z dnia na dzień jako kuliste struktury z dobrze zdefiniowanymi granicami.Zbadano kinetykę i wygląd morfologiczny organoidów zainicjowanych z kosmków, które początkowo wydają się mieć nieregularny kształt i potrzebują od dwóch do pięciu dni, zanim będzie można je zobaczyć pod mikroskopem. Pokazano inicjację organoidów z dwóch różnych kosmków. Kosmki o potencjale tworzenia organoidów wydają się gęste, prawdopodobnie z powodu zatrzymywania leżącej pod spodem mezenchymy.Inicjacja organoidów z willi jest widoczna drugiego dnia z jednego z kosmków. Podczas gdy w innych willach, organoid pojawia się czwartego dnia. Bardzo ważne jest, aby podjąć odpowiednie kroki, aby uniknąć zanieczyszczenia kryptami podczas zbierania kosmków i hodowli powstałych organoidów.Po tej procedurze zaobserwowano różnice fenotypowe między organoidami wyłaniającymi się z krypt i kosmków tego samego mutanta, więc można było przeprowadzić dalsze eksperymenty w celu poszukiwania różnic molekularnych między nimi. Protokół ten może być wykorzystany do badania różnic między organoidami powstającymi z endogennych krypt a ektopowymi kryptami powstającymi w wyniku dedyferencjacji, dzięki czemu można by zająć się implikacjami dedyferencjacji.

3d-culturing-organoids-from-intestinal-villi-epithelium-undergoing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Tutaj opisujemy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych. Opisujemy również metodę tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, umożliwiających dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonkowych.

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Protokół łączy technologię organoidów jelitowych człowieka z analizą transkryptomiczną pojedynczej komórki, aby zapewnić znaczący wgląd w wcześniej niezbadaną biologię jelit.

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Poznaj metodę hodowli organoidów 3D z dedyferencjonujących kosmków jelitowych myszy. Technika zachowania mezenchymy umożliwia badanie biologii komórek macierzystych i regeneracji jelit.

Hodowla 3D organoidów z nabłonka kosmków jelitowych poddawanego dedyferencjacji

Przeglądaj więcej filmów