Name: Prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania całego przekroju żywicy wielkości nasion i jej zastosowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj prostą metodę cięcia na sucho całych ziaren w żywicy LR White do analizy morfologii komórek, ziaren skrobi i ciał białkowych w jądrach kukurydzy. Technika umożliwia szczegółowe badania jakości nasion.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32071927), Projekt Talentów Uniwersytetu w Yangzhou oraz Priorytetowy Program Rozwoju Akademickiego Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu.

1. Przygotowanie ziarna zatopionego w żywicy (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Związać sześć dojrzałych ziaren kukurydzy w 10 ml 2,5% buforowanego fosforanem aldehydu glutarowego (0,1 M, pH 7,2) w temperaturze 4 °C przez 48 godzin. Naukowcy mogą wybrać inne mieszaniny utrwalające, stężenia utrwalające i warunki utrwalania zgodnie z celami badawczymi i typami tkanek.</li>
	<li>Wyjmij ziarna i pokrój je wzdłuż lub poprzecznie na grubość 2-3 mm za pomocą ostrego dwustronnego ostrza, a następnie umieść je w 10 ml 2,5% buforowanego fosforanem aldehydu glutarowego (0,1 M, pH 7,2) ponownie przez 48 godzin.</li>
	<li>Przemyć próbki trzykrotnie 10 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,2) przez 30 minut za każdym razem.</li>
	<li>Odwodnić próbki w roztworze wodnym etanolu o rosnących stopniach (10 ml) od 30% do 50%, 70%, 90% raz i 100% trzy razy przez 30 minut za każdym razem.</li>
	<li>Próbki należy infiltrować w 10 ml roztworu żywicy LR White rozcieńczonego etanolem od 25% do 50%, 75% raz i 100% dwukrotnie w temperaturze 4 °C przez 12 godzin za każdym razem.</li>
	<li>Przygotuj cokoły na próbki przed osadzeniem. Dodać 0,25 ml 100% białej żywicy LR do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml i polimeryzować w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Kolejno dodawać czystą żywicę LR White (0,5 ml) i infiltrowaną próbkę do probówki wirówkowej z cokołem. Wyprostować próbki za pomocą anatomicznej igły i polimeryzować je w temperaturze 60 °C w piecu przez 48 godzin.</li>
</ol>
2. Podział na sucho w celu przygotowania sekcji o wielkości całego ziarna (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Wyjmij osadzone ziarna z probówki wirówkowej i odetnij nadmiar żywicy wokół próbki za pomocą ostrego ostrza.</li>
	<li>Zacisnąć blok żywicy w uchwycie próbki ultramikrotomu (EM UC7) i odciąć zbędną żywicę na powierzchni próbki i wokół próbki za pomocą ostrza.</li>
	<li>Dokładnie wypoleruj powierzchnię próbki szklanym nożem, aż będzie można uformować cały przekrój.</li>
	<li>Przed cięciem umieść mały miedziany haczyk około 2 mm nad krawędzią ostrza i pokrój próbkę na odcinek 2 μm. Rolą haczyka jest uniknięcie zwijania się sekcji do góry.</li>
	<li>Umieść hak pod sekcją, aby ją podeprzeć, gdy sekcja stanie się długa.</li>
	<li>Dodaj 100 μl wody na niepoddane wcześniej obróbce szkiełko i ostrożnie przenieś cały i nieuszkodzony fragment do wody za pomocą pęsety.</li>
	<li>W celu wygładzenia pomarszczonego przekroju podgrzać i wysuszyć próbkę na stole do spłaszczania w temperaturze 50 °C przez noc.
	<ol>
		<li>Jeśli przekrój kruszy się lub rozrywa, należy wydłużyć czas każdej infiltracji próbki żywicą z 12 godzin do 24 godzin lub 48 godzin.</li>
		<li>Jeśli sekcja ma kilka linii równoległych do noża, mocno zacisnąć blok próbki. Jeśli sekcja ma jakieś linie pionowe do noża, użyj nowego noża.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie i obserwacja przekroju
UWAGA: Aby obserwować strukturę tkankową i morfologię komórek, granulek skrobi i ciał białkowych, zabarwić skrawki specyficznymi barwnikami zgodnie z celem badań. Tutaj używamy rozjaśniacza fluorescencyjnego 28, roztworu jodu i błękitu brylantowego Coomassie R250 do barwienia ścian komórkowych, granulek skrobi i ciał białkowych.
<ol>
	<li>W celu obserwacji morfologii komórek należy zabarwić wycinek 40 ml 0,1% (w/v) roztworu wodnego rozjaśniacza fluorescencyjnego 28 w kompaktowym szklanym słoiku do barwienia o pojemności 70 ml w temperaturze 45 °C przez 10 minut, a następnie płukać go bieżącą wodą przez 5 minut. Obserwuj i fotografuj wycinek pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę CCD.</li>
	<li>W celu obserwacji morfologii granulek skrobi należy zabarwić skrawek 40 μl roztworu jodu (0,07% (m/v) I2 i 0,14% (m/v) KI w 25% (v/v) glicerolu) przez 1 minutę i przykryć próbkę zawierającą roztwór jodu szkiełkiem nakrywkowym. Obejrzyj i sfotografuj próbkę pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kamerę CCD.</li>
	<li>W celu obserwacji morfologii ciał białkowych należy zanurzyć skrawek z 40 ml 10% (v/v) kwasu octowego w kompaktowym szklanym słoiku do barwienia o pojemności 70 ml na 10 minut w temperaturze 45 °C, a następnie zabarwić go w 40 ml 1% (w/v) błękitu brylantowego Coomassie R250 w 25% (v/v) izopropanolu i 10% (v/v) kwasie octowym przez 15 minut w temperaturze 45 °C. Umyć poplamione fragmenty pod bieżącą wodą przez 5 minut i wysuszyć. Obserwuj i fotografuj przekrój pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kamerę CCD.</li>
</ol>
4. Ilościowa analiza parametrów morfologicznych
<ol>
	<li>Przetwarzaj i analizuj ilościowo sfotografowane obrazy pod kątem obszaru, długiej/krótkiej osi i okrągłości komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion za pomocą oprogramowania do analizy morfologii (oprogramowanie Image-Pro Plus 6.0) zgodnie z procedurami Zhao et al.9 dokładnie.</li>
</ol>

<ol><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+structure+and+spatial+distribution+in+endosperm+of+high-amylose+rice+starch+granules+with+different+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+defective+effect+of+starch+branching+enzyme+IIb+from+weak+to+strong+induces+the+formation+of+biphasic+starch+granules+in+amylose-extender+maize+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm.</a> Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradually+decreasing+starch+branching+enzyme+expression+is+responsible+for+the+formation+of+heterogeneous+starch+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules.</a> Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dek35+encodes+a+PPR+protein+that+affects+cis-splicing+of+mitochondrial+nad4+intron+1+and+seed+development+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize.</a> Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).</li>
<li>Hu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+structure+characteristics+to+form+ultrahigh+oil+content+in+rapeseed%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed.</a> PLoS One. 8 (4), 62099(2013).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+VKS1+regulates+mitosis+and+cytokinesis+during+early+endosperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development.</a> Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).</li>
<li>Xu, A., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+comparison+and+applications+of+different+sections+in+investigating+the+microstructure+and+histochemistry+of+cereal+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels.</a> Plant Methods. 16, 8(2020).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li>
<li>Zhao, L., Cai, C., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+processing+method+for+investigating+the+morphology+of+cereal+endosperm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells.</a> Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).</li>
<li>Borisjuk, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+architecture+shapes+embryo+metabolism+in+oilseed+rape%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).</li>
<li>Lott, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+bodies+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Nordic+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Protein bodies in seeds.</a> Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).</li>
<li>Jing, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+endosperm+cells+and+starch+granules+in+common+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Development of endosperm cells and starch granules in common wheat.</a> Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasiona są najważniejszym zasobem odnawialnym dla żywności, pasz i surowców przemysłowych oraz są bogate w materiały magazynujące, takie jak skrobia i białko. Morfologia i ilość komórek oraz zawartość i konfiguracja materiałów magazynujących wpływają na masę i jakość nasion 7,12. Chociaż technologia stereologii i analizy obrazu może mierzyć rozmiar i ilość komórek w regionie tkanki, brakuje ich w wielu laboratoriach. Sekcje parafiny i żywicy dają dwuwymiarowy (2D...

Nasiona roślin zawierają materiały magazynujące, takie jak skrobia i białko, i dostarczają ludziom energii i składników odżywczych. Kształt, rozmiar i ilość komórek i materiałów magazynujących decyduje o wadze i jakości nasion. Komórki i materiały magazynujące w różnych regionach nasion mają znacznie różną morfologię, szczególnie w przypadku niektórych upraw zbóż o wysokiej zawartości amylozy z hamowaniem enzymu rozgałęziającego skrobię IIb1,2,3. Dlatego bardzo ważne jest zbadanie morfologii komórek i materiałów magazynujących w różnych regionach nasion.
Sekcja parafiny jest dobrą metodą do przygotowania całego przekroju nasion i może pokazać strukturę tkankową nasion oraz nagromadzenie materiału magazynującego w różnych regionach nasion4,5,6. Jednak sekcje parafinowe mają zwykle grubość 6-8 μm o niskiej rozdzielczości; W związku z tym bardzo trudno jest wyraźnie zaobserwować i ilościowo przeanalizować morfologię komórek i materiałów magazynujących. Sekcje żywicy mają zwykle grubość 1-2 μm i wysoką rozdzielczość i są bardzo odpowiednie do obserwacji i analizy morfologii komórek i materiałów magazynujących7. Jednak rutynowa metoda cięcia żywicy ma trudności z przygotowaniem całego przekroju nasion, szczególnie w przypadku nasion o dużej objętości i wysokiej zawartości skrobi; W związku z tym nie ma możliwości obserwowania i analizowania morfologii komórek i materiałów magazynujących w różnych regionach nasion. Żywica LR White jest żywicą akrylową i wykazuje niską lepkość i dużą przepuszczalność, co prowadzi do jej dobrych zastosowań w przygotowaniu sekcji żywicznej nasion, szczególnie w przypadku dojrzałych ziaren zbóż o dużej objętości i wysokiej zawartości skrobi. Ponadto próbka zanurzona w żywicy LR White może być łatwo barwiona wieloma barwnikami chemicznymi, aby wyraźnie pokazać morfologię komórek i materiałów magazynujących pod mikroskopem świetlnym lub fluorescencyjnym7. W naszym poprzednim artykule opisaliśmy metodę dzielenia na sucho w celu przygotowania całych sekcji dojrzałych ziaren zbóż zatopionych w żywicy LR White. Metoda ta może również przygotować całą porcję rozwijającego się, kiełkującego i ugotowanego ziarna zboża8. Uzyskany przekrój o wielkości całego ziarna ma wiele zastosowań w obserwacji i analizie mikromorfologicznej, szczególnie do przejrzystego przeglądania i ilościowej analizy różnic morfologicznych komórek i materiałów magazynujących w różnych regionach seed8,9.
Ta technika jest odpowiednia dla badaczy, którzy chcą obserwować mikrostrukturę tkanki oraz kształt i rozmiar komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion za pomocą mikroskopu świetlnego. Obrazy całych odcinków nasion wybarwionych specjalnie do wystawiania komórek, granulek skrobi i ciał białkowych mogą być analizowane za pomocą oprogramowania do analizy morfologicznej w celu ilościowego pomiaru parametrów morfologicznych komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion. W celu wykazania możliwości zastosowania technicznego i zastosowania całych przekrojów nasion, zbadaliśmy dojrzałe nasiona kukurydzy i rzepaku oraz rozwijające się, kiełkujące i gotowane ziarna ryżu w tym badaniu. Protokół zawiera cztery procesy. W tym przypadku używamy dojrzałego ziarna kukurydzy, które jest najtrudniejsze w przygotowaniu całych sekcji nasion ze względu na dużą objętość i wysoką zawartość skrobi, jako próbkę do pokazania procesów krok po kroku.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A501931</tr><tr><td>Kompaktowy szklany słoik do barwienia (5 miejsc)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E678013</tr><tr><td>Coomassie brylantowy niebieski R-250</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A100472</tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>F518211</tr><tr><td>Dwustronne ostrze</td><td>Gillette Shanghai Co., Ltd.</td><td>74-S</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A500737</tr><tr><td>Stół do spłaszczania</td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>BX60</td><td></td></tr><tr><td>Rozjaśniacz fluorescencyjny 28</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>910090</td><td></td></tr><tr><td>Paski szklane</td><td>Leica</td><td>840031</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 50% roztwór w wodzie</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A600875</tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A600232</tr><tr><td>Iodine</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A500538</tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A507048</tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>LR Agar z białej żywicy</td><td>Scientific AGR1281A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co., Ltd.</td><td>9023A</td><td></td></tr><tr><td>Jodek potasu</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A100512</tr><tr><td>Slide</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>F518101</tr><tr><td>Pęseta</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>F519022</tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy dwunastowodny</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A607793</tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A502805</tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania całego przekroju żywicy wielkości nasion i jej zastosowania

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

Morfologia, rozmiar i ilość komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w nasionach decydują o wadze i jakości nasion. Różnią się one znacznie w różnych regionach nasion. Aby wyraźnie zobaczyć morfologię komórek, granulek skrobi i ciał białkowych oraz dokładnie przeanalizować ilościowo ich parametry morfologiczne, potrzebna jest sekcja o wielkości całego ziarna. Chociaż sekcja parafinowa o wielkości całych nasion może badać nagromadzenie materiałów magazynujących w nasionach, bardzo trudno jest ilościowo przeanalizować parametry morfologiczne komórek i materiałów magazynujących ze względu na niską rozdzielczość grubego przekroju. Cienka sekcja żywicy ma wysoką rozdzielczość, ale rutynowa metoda cięcia żywicy nie jest odpowiednia do przygotowania całej sekcji dojrzałych nasion o dużej objętości i wysokiej zawartości skrobi. W niniejszej pracy przedstawiono prostą metodę cięcia na sucho w celu przygotowania przekroju żywicy o wielkości całych nasion. Technika ta pozwala przygotować krzyżowe i podłużne sekcje całych nasion rozwijających się, dojrzałych, kiełkujących i ugotowanych zatopionych w żywicy LR White, nawet w przypadku dużych nasion o wysokiej zawartości skrobi. Cała sekcja nasion może być barwiona fluorescencyjnym rozjaśniaczem 28, jodem i błękitem brylantowym Coomassie R250, aby wyraźnie pokazać morfologię komórek, granulek skrobi i ciał białkowych. Uzyskany obraz może być również analizowany ilościowo w celu pokazania parametrów morfologicznych komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion.

Prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania przekroju o rozmiarze całego nasiona 
Opracowaliśmy prostą metodę cięcia na sucho do przygotowywania przekrojów o rozmiarze całego nasiona zatopionego w żywicy LR-white (Rysunek 1). Metoda ta pozwala na przygotowanie poprzecznych i podłużnych przekrojów o rozmiarze całego nasiona o grubości 2 µm (Rysunki 2-5, Rysunki uzupełniające 1-4). Przykładowo, ...

Ta technika pozwala na szybkie i proste przygotowanie sekcji żywicy o rozmiarach całych nasion do obserwacji i analizy komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion.

Prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania całego przekroju żywicy wielkości nasion i jej zastosowania

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Morfologia, nauka i jakość komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w jądrze decydują o masie i jakości nasion. W tym badaniu przedstawiamy jako prostą populację całego ziarna zatopionego w żywicy LR White i ustalamy prostą metodę odsysania całych ziaren na sucho. Wybieramy żywicę LR White jako medium do zabudowy z dwóch głównych powodów.Po pierwsze, charakteryzuje się niską lepkością i silną przepuszczalnością, co prowadzi do dobrych zastosowań w przygotowywaniu tych potężnych sekcji nasion, szczególnie w przypadku dojrzałych ziaren zbóż o dużej objętości i wysokiej zawartości skrobi. Po drugie, próbkę osadzoną w żywicy LR White można łatwo zabarwić wieloma barwnikami chemicznymi, aby wyraźnie pokazać morfologię próbek pod światłem za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Przygotowane skrawki mogą być specjalnie barwione, aby wyraźnie uwidocznić komórki, granulki skrobi i ciała białkowe podczas wyłaniania się całego ziarna, a parametry morfologiczne mogą być również analizowane ilościowo.Metoda zawiera badania. W tym przypadku używamy dojrzałych ziaren kukurydzy o większej objętości i wysokiej zawartości skrobi jako próbki, aby krok po kroku pokazać procesy. Na początek przycina ziarna do prostej butelki.Dodaj około 10 milimetrów 2,5% buforowanego fosforanem aldehydu glutarowego. jeszcze jeden pH 7,2 i umieść go w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 48 godzin, aby je naprawić. Następnie wyjmij te ziarna i pokrój je wzdłuż lub poprzecznie, o grubości od dwóch do trzech milimetrów.Potrzebujesz ostrego dwustronnego ostrza. I napraw je przez kolejne 48 godzin. Następnie przemyj próbki trzykrotnie około 10 milimetrami, czyli 0,1 M buforem fosforanowym, pH 7,2 przez 30 minut za każdym razem.Aby uwodnić próbki krok po kroku, najpierw namocz je w około 10 milimetrach 30% wodnego roztworu etanolu na 30 minut, a następnie namocz je w 10 milimetrach, czyli 50%70%90%raz i 100%trzy razy. Aby infiltrować próbkę krok po kroku, kolejno pobieraj ją za pomocą 10 milimetrów roztworu żywicy LR White rozcieńczonego etanolem w ilości 25%50%75% raz i 100%dwa razy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin za każdym razem. Przed zasadzeniem musimy przygotować postumenty na próbki.Dodaj 250 mikrolitrów czystej żywicy LR White do dwumilimetrowej probówki wirówkowej i polimeryzuj ją w temperaturze sześciu stopni Celsjusza przez 48 godzin. Następnie należy kolejno dodać 500 mikrolitrów czystej żywicy LR White i naciekazać próbkę do probówki wirówkowej z postumentem. Po wyprostowaniu próbek za pomocą anatomicznej igły umieść żywicę w temperaturze sześciu stopni Celsjusza w piekarniku na 48 godzin.Wyjmij te osadzone ziarna z probówki wirówkowej i wytnij nadmiar żywicy wokół próbki za pomocą ostrego ostrza. Umieść blok żywicy w uchwycie na próbkę w mikrotonach i odetnij zbędną żywicę na powierzchni próbki i wokół próbki za pomocą ostrza. Na koniec wypoleruj powierzchnię próbki szklanym nożem, aż będzie można uformować cały przekrój.Teraz nadszedł czas, aby przygotować ten niesamowity przekrój o grubości dwóch mikronów. Przed krojeniem umieść małą miedzianą szprychę około dwóch milimetrów nad krawędzią ostrza, aby zapobiec zwijaniu się sekcji. W miarę wydłużania się sekcji umieść szprychę pod sekcją, aby ją podeprzeć.Następnie dodaj 100 mikrolitrów wody na niewystającą zjeżdżalnię i ostrożnie przenieś całą i nieprzerwaną sekcję do wody z zabiegaczami. Podgrzej i wysusz je w temperaturze 50 stopni Celsjusza, aby wygładzić pomarszczoną sekcję. Na koniec należy zwrócić uwagę na dwie ważne wskazówki.Po pierwsze, jeśli sekcja kruszy się lub rozrywa, wydłuż czas każdej infiltracji żywicy próbki. Po drugie, jeśli sekcja ma kilka linii równoległych do noża, mocno zaciśnij blok próbki. Jeśli sekcja ma jakieś linie pionowe do noża, użyj nowego noża.Aby zaobserwować morfologię komórek, granulek skrobi i ciał białkowych, możemy zabarwić skrawki odpowiednio rozjaśniaczem fluorescencyjnym 28, roztworem jodu i błękitem brylantowym Coomassie R250. W przypadku innych konkretnych plam oprzyj się na badaniach propozycji. Tutaj jako przykład używamy roztworu jodu do barwienia granulek skrobi.Dodaj 40 mikrolitrów roztworu jodu, aby zanurzyć sekcję. I trzymaj go w słoiku przez minutę. A następnie przykryj próbkę rękawem osłonowym.I zetrzyj nadmiar roztworu środka wokół niego. Natychmiast obserwować i fotografować próbkę pod oświetlonym mikroskopem wyposażonym w kamerę CCTV. Możemy przetwarzać i analizować ilościowo sfotografowane obrazy pod kątem obszaru, długiego lub krótkiego dostępu oraz okrągłości komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach ziarna za pomocą oprogramowania do analizy morfologicznej.Ustalamy prostą metodę cięcia na sucho, aby zachować całe sekcje wielkości ziarna w żywicy LR White. Metoda pozwala na przygotowanie przekrojów poprzecznych i podłużnych całego ziarna o wielkości dwóch mikronów. lub Na przykład, dojrzałe całe nasiona rzepaku mogą być dzielone poprzecznie i wzdłużnie.Z powodzeniem można również przygotować kawałki dojrzałego całego ziarna kukurydzy o większej objętości. Ponadto za pomocą tej metody można również zbadać rozwijające się jądro, ugotowane jądro i kiełkujące jądro. Przygotowane sekcje całych jąder mają poniższe zastosowania.Po pierwsze, skrawki całego ziarna można wykorzystać do obserwacji struktury tkankowej nasion. Na przykład skrawki całego zarodka rzepaku zabarwione safraniną mogą wyraźnie wskazywać na to, że jest to radykalny, hiper przypadkowy, wewnętrzny i zewnętrzny skrawki całego jądra mogą być używane do obserwacji i analizy morfologii komórek. Na przykład przekroje poprzeczne całego zarodka rzepaku są barwione rozjaśniaczem fluorescencyjnym 28, a olejki komórkowe są barwione w sposób specyficzny.Mikromorfologia komórek w dowolnych regionach całego zarodka może być wyświetlana w dużym powiększeniu. Parametry morfologiczne komórek miąższowych mogą być analizowane ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy morfologicznej i wykazują pewne różnice w różnych regionach zarodka. Przekroje poprzeczne całego ziarna kukurydzy barwione rozjaśniaczem fluorescencyjnym 28 mogą również występować jako morfologia komórek, a parametry morfologiczne komórek są różne w różnych regionach bielma.Skrawki całego ziarna można zabarwić roztworem jodu, aby pokazać jego morfologię granulek skrobi, na przykład przekroje poprzeczne i podłużne ziaren kukurydzy barwione jodem mogą wyraźnie wykazywać morfologię granulek skrobi. Granulki skrobi w różnych regionach wykazują znacznie różną morfologię, rozmiar i ilość w komórkach bielma. Tak więc analiza ilościowa parametrów morfologicznych granulek skrobi pokazuje, że są one znacząco różne w różnych regionach bielma.Przekroje mogą być wykorzystywane do obserwacji i analizy morfologii ciał białkowych. Na przykład białko skrobi jest barwione na niebiesko przy użyciu błękitu brylantowego Coomassie R250. Rozkład przestrzenny białka skrobiowego w całym zarodku rzepaku można zaobserwować w jego małym powiększeniu, a mikrostruktura może być wyraźnie widoczna przy dużym powiększeniu.Ponadto można również analizować ilościowo liczby, indeks błędów i parametry morfologiczne ciał białkowych w wybranych regionach. Technika ta zapewnia pierwsze i proste przygotowanie kawałków żywicy całych ziaren z rozwijających się i dojrzałych nasion. Zastosowania przekrojowe w strukturze tkankowej całego ziarna, a następnie badanie morfologii komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach całego ziarna.Uzyskane obrazy można analizować ilościowo w celu pokazania parametrów morfologicznych komórek, granulek skrobi i ciał białkowych, a następnie porównywać je w różnych regionach całego ziarna.

a-simple-dry-sectioning-method-for-obtaining-whole-seed-sized-resin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i obrazowania w trzech wymiarach tkanki mózgowej zatopionej w żywicy przy użyciu skupionej wiązki jonów oraz skaningowego mikroskopu elektronowego.

Frezowanie wiązką jonową (FIB) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak pobierać próbki z drewnianych próbek w celu ogólnej oceny ich struktur wzrostu. Opisano makro- i mikroskopowe techniki preparacji i wizualizacji niezbędne do wygenerowania dobrze odwzorowanych i wysoce rozdzielczych zbiorów danych anatomicznych i dendroekologicznych drewna.

Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Ten protokół opisuje prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut, która jest przydatna dla opornych tkanek roślinnych. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania anatomiczne i inne badania biologiczne, w tym hybrydyzację in situ (ISH).

Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

To badanie przedstawia niezawodne i łatwe procedury uzyskiwania seryjnych ultracienkich odcinków mikroorganizmu bez drogiego sprzętu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół mający na celu poprawę podziału parafiny. Metoda ta łączy cięcie i pływanie za pomocą prostej studzienki termostatycznej, aby uniknąć procesu przenoszenia wymaganego przez metodę konwencjonalną. W rezultacie znacznie poprawiła się wydajność i liczba nienaruszonych skrawków parafiny.

Metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia

Ten protokół pozwala na przygotowanie przekrojów nasion zbóż (np. ryżu) do analizy morfologii bielma i granulek skrobi za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Przekroje poprzeczne dojrzałego ryżu (Oryza sativa L.) Ziarna do obrazowania w skaningowej mikroskopii elektronowej z wykorzystaniem końcówek do pipet jako wspomagania immobilizacji

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ocena różnic anatomicznych między przekrojami poprzecznymi liści C3 i C4 pomaga zrozumieć efektywność fotosyntezy. W artykule opisano przygotowanie i badanie przekrojów poprzecznych liści z wolnej ręki i półcienkiej, wraz z zastrzeżeniami dotyczącymi przygotowania dla gatunków roślin uprawnych Triticum aestivum i Zea mays.

Ocena cech strukturalnych Triticum aestivum i Zea mays dla różnicowania fotosyntetycznego C3 i C4 przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich

Poznaj prostą metodę cięcia na sucho całych ziaren w żywicy LR White do analizy morfologii komórek, ziaren skrobi i ciał białkowych w jądrach kukurydzy. Technika umożliwia szczegółowe badania jakości nasion.

Prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania całego przekroju żywicy wielkości nasion i jej zastosowania

Przeglądaj więcej filmów