Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA
November 5th, 2020
Środowiskowe testy DNA wymagają rygorystycznego projektowania, testowania, optymalizacji i walidacji przed rozpoczęciem zbierania danych terenowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który przeprowadza użytkowników przez każdy etap projektowania specyficznego dla gatunku, opartego na sondzie testu qPCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA gatunku docelowego z próbek środowiskowych.
Dobrze zoptymalizowane testy są niezbędne do prawidłowej interpretacji środowiskowych danych DNA. Protokół ten opisuje niezbędne kroki projektowania i testowania w celu opracowania takiego testu. Ogólnie rzecz biorąc, środowiskowe DNA jest nieinwazyjną metodą wykrywania określonego gatunku lub zestawu gatunków.
Może obniżyć koszty i być bardziej czuły w porównaniu z konwencjonalnymi metodami pomiarowymi. Metoda ta może pomóc w ochronie przyrody i zarządzaniu dziką przyrodą poprzez wykrywanie DNA gatunku będącego przedmiotem zainteresowania, co pozwala potencjalnie wywnioskować obecność tego gatunku na badanym obszarze. Ze względu na dużą czułość ilościowego PCR, do zanieczyszczenia może dojść łatwo, a kontrole ujemne są potrzebne do zidentyfikowania etapów, na których wprowadzono zanieczyszczenie.
eDNA to dziedzina zaśmiecona żargonem i skrótami myślowymi. Dla tych, którzy nie mają doświadczenia w biologii molekularnej lub qPCR, demonstracje wizualne mogą pomóc w planowaniu projektu eksperymentalnego od konceptualizacji po generowanie danych. Procedurę zademonstrują Dannise Ruiz Ramos, biolog z naszego laboratorium, oraz Trudi Frost, pomoc laboratoryjna studentki.
Aby rozpocząć, wyszukaj i pobierz sekwencje z wielu regionów genów dla interesujących gatunków, korzystając z bazy danych nukleotydów NCBI. Wybierz wszystkie sekwencje, które pasują do specyfikacji, a następnie wybierz opcję Wyślij do. Wybierz opcję Complete Record, File, Download Format (Format pobierania) jako GenBank lub FASTA, a następnie Create File (Utwórz plik). Te sekwencje są teraz zapisywane na komputerze.
Powtórz te kroki dla wszystkich interesujących Cię gatunków. Sekwencje dla każdego regionu genu należy przechowywać w osobnym pliku, ponieważ będą one analizowane oddzielnie. Aby wyrównać sekwencje z każdego regionu genu osobno, zaimportuj pobrane pliki sekwencji do programu do wyrównywania sekwencji, takiego jak oprogramowanie Geneious Prime.
Utwórz osobne foldery dla każdego regionu genu, a następnie zaznacz wszystkie sekwencje w folderze zawierającym sekwencje z jednego regionu genu. Użyj narzędzia Wielokrotne wyrównanie, aby utworzyć wyrównanie nukleotydów, takie jak Geneious lub MUSCLE wybranych sekwencji. Wybierz obiecujące regiony do zaprojektowania testu dzięki wizualizacji wyrównanych danych sekwencji.
Wybierz region, w którym dostępnych jest wiele danych sekwencyjnych dla interesujących gatunków, jest wysoce rozbieżny między gatunkami i wykazuje niską zmienność w obrębie gatunku. Następnie zaprojektuj startery testowe i sondę. Użyj oprogramowania do projektowania testów qPCR, aby zaprojektować pięć zestawów testów qPCR.
Wklej wybraną sekwencję w polu Wpis sekwencji. Jeśli wyrównanie utworzyło odstępy, usuń je z sekwencji. Wybierz sondę starterów qPCR 2 w opcji Wybierz swój projekt, a następnie pobierz zalecane testy.
Skopiuj sekwencje ze startera do przodu pierwszego testu i wyszukaj tę sekwencję startera w wcześniej utworzonym wyrównaniu. Jeśli używasz Geneious Prime, użyj narzędzia Annotate Predict (Opisz przewidywanie), aby dodać region startera do wyrównania. Zrób to dla wszystkich kombinacji startera i sondy.
Należy sprawdzić te obszary wyrównania pod kątem zmienności w obrębie gatunków docelowych, jak również w obrębie gatunków współwystępujących. Przetestuj podkłady in silico za pomocą NCBI Primer-BLAST. Wklej podkłady do mojego własnego pudełka z podkładami w sekcji Parametry podkładu.
W opcjach Parametry sprawdzania specyficzności pary starterów wybierz NR jako bazę danych i wpisz porządek taksonomiczny lub rodzinę organizmu będącego przedmiotem zainteresowania w polu Organizm. Upewnij się, że wybrane startery prawdopodobnie nie wzmocnią gatunków niedocelowych. Przetestuj skuteczność testu in vitro, tworząc krzywą wzorcową i określając wydajność krzywej oraz zakres liniowy.
Zbadać co najmniej sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń syntetycznego wzorca DNA zawierającego sekwencję docelową, w ilości około od jednej do miliona kopii na reakcję. Użyj oprogramowania qPCR, aby wykreślić wartość CQ każdego wzorca na osi Y, a logarytm o podstawie 10 początkowego stężenia wzorca w kopiach na reakcję na osi X. Oprogramowanie qPCR powinno automatycznie uruchomić regresję liniową.
Oblicz wydajność na podstawie nachylenia regresji. Sprawdź wzrokowo krzywą standardową pod kątem odchylenia lub słabej wydajności, mierzonej wydajnością i wartościami R kwadrat. Należy zastosować wewnętrzną kontrolę dodatnią w celu zbadania zahamowania PCR rzeczywistych próbek terenowych, co może prowadzić do zmniejszenia czułości i wyników fałszywie ujemnych.
Określić granice wykrywalności i kwantyfikacji dla każdego testu. Przetestuj testy na gatunkach niedocelowych, aby zweryfikować swoistość i upewnić się, że test działa dobrze z multipleksem IPC. Testy o dobrej czułości, swoistości i skuteczności mogą przejść do kolejnych etapów.
Aby przeprowadzić badanie in situ testu, należy pobrać wiele próbek wody i przetworzyć je do qPCR. Uruchom ilościowy test PCR i porównaj stężenie eDNA i częstotliwość wykrywania ze znanymi różnicami w występowaniu i liczebności miejsc. Potwierdź wszystkie wykrycia przez sekwencjonowanie.
Dostępne sekwencje wszystkich gatunków Unionidae w rzece Clinch zostały pobrane i wyrównane. Po zaprojektowaniu wielu testów, do wyrównania dodano pięć zestawów starterów i sondy w celu oceny wizualnej. Zestawy starterów i sond zostały przetestowane in silico i in vitro.
W laboratorium wszystkie testy zostały przetestowane przy użyciu ekstrakcji DNA 27 dostępnych gatunków w celu zweryfikowania swoistości. W jednym z testów udało się amplifikować tylko gatunki docelowe. Udany test z dobrą wydajnością i wartościami R kwadrat jest pokazany tutaj.
LOD i LOQ dla wybranego testu wynosiły po pięć kopii na reakcję. W przeciwieństwie do tego, testy, które dały standardową krzywą o słabej wydajności, zostały odrzucone. W jakościowym qPCR wzorcowe rozcieńczenia amplifikują się przy równomiernie rozłożonych wartościach ilościowych cyklu wynoszących około 3,3 cykli na każdą dziesięciokrotną różnicę stężenia.
W przypadku słabego qPCR wzorce mogą wykazywać nierównomierne różnice w wartościach kwantyfikacji cyklu między rozcieńczeniami. Amplifikację IPC dla nieznanych próbek należy porównać z wynikami IPC kontroli matrycy ujemnej. Jeżeli w próbkach nie ma żadnych inhibitorów, wszystkie amplifikacje IPC powinny mieć ścisłe grupowanie na wykresie, z wartościami kwantyfikacji cyklu prawie takimi samymi jak w przypadku kontroli bez matrycy.
Do celów badań in situ testu, lokalizacje obejmowały dno dna łoża małży w strumieniu, dno dna dna mięśni w pobliżu brzegu, 100 metrów w dół dna w strumieniu, 500 metrów w dół dna w strumieniu i 500 metrów w dół dna w pobliżu brzegu. Ilościowe testy PCR dla środowiskowego DNA mogą pomóc w monitorowaniu zarówno gatunków inwazyjnych, jak i zagrożonych, a także poprawić nasze zrozumienie przestrzennych i czasowych zmian w wykrywaniu gatunków bez konieczności fizycznego uchwycenia poszczególnych organizmów.
Przegląd
Ten protokół opisuje projektowanie i optymalizację sondowych metod qPCR specyficznych dla gatunków w wykrywaniu środowiskowego DNA (eDNA). Podkreśla znaczenie rygorystycznego opracowywania metod w celu zapewnienia dokładnej interpretacji danych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Analiza środowiskowego DNA
- Ilościowa PCR (qPCR)
- Biologia ochrony przyrody
Tło
- Środowiskowe DNA jest nieinwazyjną metodą wykrywania gatunków.
- Może być bardziej czuła i opłacalna niż tradycyjne metody badawcze.
- Kontaminacja jest istotnym problemem, wymagającym ścisłych kontroli.
- Pomoce wizualne mogą poprawić zrozumienie projektowania metod dla osób niebędących ekspertami.
Cel badania
- Dostarczenie kompleksowego protokołu rozwoju metod qPCR.
- Ułatwienie wykrywania DNA gatunków docelowych z próbek środowiskowych.
- Poprawa praktyk ochrony przyrody i zarządzania dzikim życiem.
Zastosowane metody
- Pobieranie sekwencji z bazy danych nukleotydów NCBI.
- Wyrównanie sekwencji za pomocą oprogramowania takiego jak Geneious Prime.
- Projektowanie sond i primerów qPCR na podstawie wyrównań sekwencji.
- Testowanie efektywności i specyficzności metod in silico i in vitro.
Główne wyniki
- Skuteczne wzmocnienie DNA gatunków docelowych z dużą efektywnością.
- Ustawienie granic wykrywalności i ilościowania dla metod.
- Weryfikacja specyficzności metod względem gatunków niedocelowych.
- Demonstracja skutecznego wykrywania eDNA w próbkach terenowych.
Wnioski
- Dobrze zaprojektowane metody qPCR są kluczowe dla dokładnej analizy eDNA.
- Metody muszą być rygorystycznie testowane pod kątem efektywności i specyficzności.
- Ten protokół służy jako cennym zasobem dla badaczy w tej dziedzinie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Species-specific qPCR assay development enables precise, non-invasive detection of target organisms from environmental samples, supporting early-stage biological hypothesis testing in conservation and toxicology contexts. Rigorous assay validation provides quantitative, reproducible data that improves predictive confidence in species presence/absence calls, reducing false positives and negatives in field monitoring. This approach strengthens translational continuity from discovery to application by delivering scalable, standardized tools for biodiversity assessment and ecological risk evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of species-specific genetic markers to clarify target presence in complex environmental matrices.
- Operational Value: Supports functional validation of ecological targets through sensitive, quantitative detection of low-abundance DNA.
- Predictive Value: Establishes confidence in biomarker-like signals for species occupancy, informing go/no-go decisions in environmental monitoring programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated primer-probe sets with defined limits of detection and quantification for reliable eDNA quantification.
- Operational Value: Ensures assay specificity through empirical testing against non-target species, minimizing cross-reactivity in multiplexed formats.
- Scalability: Standard curve generation enables normalization across batches and sites, supporting longitudinal and comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular detection outputs to ecological outcomes, enabling correlation of eDNA levels with species abundance and distribution.
- Disease-Relevant System: Applicable to pathogen or invasive species surveillance in aquatic systems, supporting early-warning monitoring frameworks.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in environmental sampling by linking DNA signal to biological origin through sequencing confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay development workflow fits within early discovery to translational validation, providing a standardized path from sequence data to field-deployable detection tools for species-specific monitoring.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing regarding species presence, distribution, and ecological interactions through targeted genetic interrogation.
- Screening: Delivers ready-to-use, optimized qPCR assays with defined dynamic range and sensitivity for high-throughput environmental sample analysis.
- Analytics: Generates quantitative Cq data convertible to DNA copy numbers, enabling statistical comparison across conditions and time points.
- Translational Research: Supports extrapolation from lab validation to field application via IPC controls and sequencing verification of positives.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable assay development pipeline applicable to multiple species or gene targets across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic confidence in species detection by linking qPCR signal to specific genetic targets.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows with built-in contamination controls and inhibition monitoring.
- Strategic Value: Improves decision-making in environmental programs by reducing uncertainty in species detection data.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of sampling sites or conservation actions based on validated eDNA signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, sequence alignment, and qPCR optimization.
- Dependent on access to qPCR instrumentation, bioinformatics tools, and synthetic DNA standards.
- Necessitates standardized SOPs for sample processing, DNA extraction, and negative control inclusion.
- Must account for environmental inhibitors through IPC multiplexing in field sample analysis.
- Limited by availability of reference sequences and potential for primer-dimer or off-target amplification in complex backgrounds.
