Name: Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Naucz się projektować specyficzne dla gatunku testy qPCR do analizy DNA środowiskowego. Protokół obejmuje projektowanie sond, testowanie specyficzności in silico i in vitro oraz weryfikację w polowych próbkach wody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alvi Wadud i Trudi Frost, którzy pomogli w rozwoju i testowaniu podkładów. Finansowanie projektu testu opisanego w tym badaniu zostało zapewnione przez Program Strategicznych Badań i Rozwoju Środowiskowego Departamentu Obrony (RC19-1156). Jakiekolwiek użycie nazw handlowych, produktów lub firm służy wyłącznie celom opisowym i nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych. Dane wygenerowane podczas tego badania są dostępne jako https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 publikacji danych USGS.

<ol><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li>
<li>Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology. 10, 5(1992).</li>
<li>Mauvisseau, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+accuracy%2C+repeatability+and+detection+probability+in+the+reliability+of+species-specific+eDNA+based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches.</a> Scientific Reports. 9 (1), 580(2019).</li>
<li>Hernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60+specific+eDNA+qPCR+assays+to+detect+invasive%2C+threatened%2C+and+exploited+freshwater+vertebrates+and+invertebrates+in+Eastern+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+DNA%22%5BJournal%5D)">60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada.</a> Environmental DNA. , (2020).</li>
<li>Klymus, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+the+limits+of+detection+and+quantification+for+environmental+DNA+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+DNA%22%5BJournal%5D)">Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays.</a> Environmental DNA. , (2019).</li>
<li>Thalinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validation+scale+to+determine+the+readiness+of+environmental+DNA+assays+for+routine+species+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Helbing, C. C., Hobbs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+Standardization+Needs+for+Fish+and+Wildlife+Population+Assessments+and+Monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22CSA+Group%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring.</a> CSA Group. , (2019).</li>
<li>Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Environmental+DNA+Methods+Ready+for+Aquatic+Invasive+Species+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management.</a> Trends in Ecology & Evolution. , (2020).</li>
<li>Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+is+a+PCR+efficiency+estimate%3A+Recommendations+for+precise+and+robust+qPCR+efficiency+assessments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).</li>
<li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA%3A+the+importance+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS One. 8 (3), 59520(2013).</li>
<li>Prediger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+design+primers+and+probes+for+PCR+and+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22IDT%22%5BJournal%5D)">How to design primers and probes for PCR and qPCR.</a> IDT. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes">http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes</a> (2020).</li>
<li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+%28qPCR%29+primer+design+using+free+online+software%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).</li>
<li>Owczarzy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDT+SciTools%3A+a+suite+for+analysis+and+design+of+nucleic+acid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers.</a> Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 163-169 (2008).</li>
<li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoCalc%3A+an+online+oligonucleotide+properties+calculator%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 43-46 (2007).</li>
<li>Taylor, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ultimate+qPCR+Experiment%3A+Producing+Publication+Quality%2C+Reproducible+Data+the+First+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time.</a> Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (134), 11(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Local+Alignment+Search+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic Local Alignment Search Tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+Vol.+5279%22">Bio-Rad Vol. 5279</a>. , ed Bio-Rad (2020).</li>
<li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+Vol.+6894%22">Bio-Rad Vol. 6894</a>. , Bio-Rad (2020).</li>
<li>Eurogentec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eurogentec.+Vol.+0708-V2%22">Eurogentec. Vol. 0708-V2</a>. , ed Eurogentec (2020).</li>
<li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+primer+design+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li>
<li>Hoorfar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+design+of+internal+amplification+controls+for+diagnostic+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).</li>
<li>Goldberg, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+considerations+for+the+application+of+environmental+DNA+methods+to+detect+aquatic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).</li>
<li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+%28eDNA%29+Assays+for+Invasive+Populations+of+Black+Carp+in+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Fisheries+Society%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America.</a> Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).</li>
<li>Mosher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+molecular+detection+studies+require+clear+communication+among+diverse+research+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Ecology+and+the+Environment%22%5BJournal%5D)">Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners.</a> Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).</li>
<li>Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+DNA+barcoding%3A+low+species+coverage+and+numerous+unidentified+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cladistics%22%5BJournal%5D)">An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences.</a> Cladistics. 28, 6(2012).</li>
<li>Rees, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REVIEW%3A+The+detection+of+aquatic+animal+species+using+environmental+DNA+-+a+review+of+eDNA+as+a+survey+tool+in+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Ecology%22%5BJournal%5D)">REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology.</a> Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).</li>
<li>Evans, N. T., Lamberti, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshwater+fisheries+assessment+using+environmental+DNA%3A+A+primer+on+the+method%2C+its+potential%2C+and+shortcomings+as+a+conservation+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research%22%5BJournal%5D)">Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool.</a> Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Sengupta, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+for+improved+detection+and+environmental+surveillance+of+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).</li>
<li>Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+eDNA+shedding+rates+from+invasive+bighead+carp+Hypophthalmichthys+nobilis+and+silver+carp+Hypophthalmichthys+molitrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Conservation%22%5BJournal%5D)">Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix.</a> Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Sponsorzy finansujący nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; lub w decyzji o publikacji wyników.

Podobnie jak w przypadku każdego badania, zdefiniowanie pytania, na które należy odpowiedzieć, jest pierwszym krokiem, a projekt testu eDNA zależy od zakresu badania26. Na przykład, jeśli celem badań lub ankiety jest wykrycie jednego lub kilku gatunków, najlepszy jest ukierunkowany test oparty na sondzie. Jeśli jednak celem jest ocena większego zestawu lub zbiorowiska gatunków, lepiej nadają się testy metabarcodingu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Po ustaleniu, jakie podejście należy przyjąć, zaleca się przeprowadzenie badania pilotażowego obejmującego zaprojektowanie testu, testowanie i optymalizację24. Projekt testu rozpoczyna się od wykazu gatunków zgodnie z opisem na rysunku 1. Wykaz ten będzie podstawą do zrozumienia, jak dobrze test działa pod względem swoistości i zakresu geograficznego, do którego można go zastosować. Zachęca się do zaprojektowania testu dla określonego obszaru geograficznego, co umożliwi projektantowi lepsze przetestowanie testu pod kątem reaktywności krzyżowej z innymi gatunkami na tym obszarze oraz uświadomienie sobie ograniczeń, jakie niesie to ze sobą w odniesieniu do rozszerzenia testu na inne obszary, na których może występować gatunek docelowy24. Gdy lista jest kompletna, sekwencje można pobrać z publicznych genetycznych baz danych. Ponieważ te bazy danych są niekompletne27, należy zsekwencjonować jak najwięcej gatunków w wykazie we własnym zakresie, aby uzupełnić lokalną referencyjną bazę danych sekwencji, które zostaną wykorzystane w projekcie testu. Priorytetowo traktuj współwystępujące blisko spokrewnione gatunki, ponieważ są to najbardziej prawdopodobne gatunki niebędące celami, które się wzmocnią. Skupienie się na wszystkich gatunkach należących do tego samego rodzaju lub rodziny co gatunek docelowy jest dobrym punktem wyjścia. Porównania z blisko spokrewnionymi gatunkami pomogą zidentyfikować regiony sekwencji unikalne dla gatunku docelowego. Może to pomóc w ustaleniu, jak test może działać w innych systemach lub lokalizacjach. Regiony mitochondrialne są zwykle wybierane do opracowywania testów, ponieważ więcej informacji o sekwencji z szerszej gamy gatunków jest dostępnych w genach mitochondrialnych, które zostały wykorzystane w projektach kodu kreskowego życia, a także dlatego, że mitochondrialne DNA jest obecne w znacznie większym stężeniu w kopiach / komórkę niż DNA jądrowe 24,28,29. Wiele regionów genów powinno zostać ocenionych w celu dalszego rozwoju testu, ponieważ pokrycie sekwencji różni się w zależności od taksonów w bazach danych repozytorium genetycznego. Po utworzeniu tej lokalnej bazy danych sekwencji referencyjnych, do projektowania testów starter/sonda wykorzystuje się kombinację ręcznej wizualizacji wyrównanych danych sekwencji i programów komputerowych. Nie należy polegać wyłącznie na oprogramowaniu, aby określić, które testy należy przetestować. Ważne jest, aby wizualnie zweryfikować ustawienia, w których startery i sondy znajdują się na celach i poza celami, aby lepiej zrozumieć, jak mogą one działać w PCR. Wreszcie, badania przesiewowe i optymalizacja testów obejmują trzy poziomy (in silico, in vitro i in situ)6,7,24,25. Projektowanie i testowanie in silico jest ważne dla stworzenia krótkiej listy testów z dużą szansą na sukces, ale badania empiryczne (in vitro) mają kluczowe znaczenie dla wyboru testu o najlepszej rzeczywistej wydajności. Optymalizacja i testowanie testów in vitro obejmuje pomiar wydajności reakcji oraz określenie czułości i swoistości testu. Granice wykrywalności i oznaczania ilościowego to dwa parametry często pomijane przy opracowywaniu testów, ale ważne dla interpretacji danych. Przeprowadzając wiele powtórzeń krzywych wzorcowych dla testu, LOD i LOQ można łatwo zmierzyć 1,5,30. Niewiele badań omawia wyniki w odniesieniu do LOD lub LOQ testu, ale Sengupta i in. (2019) włączają LOD i LOQ swojego testu do interpretacji danych i grafiki, aby lepiej zrozumieć ich wyniki31. Wewnętrzne kontrole dodatnie powinny być również multipleksowane do zaprojektowanego testu. Bez przeprowadzenia testów na inhibicję PCR w próbkach mogą wystąpić wyniki fałszywie ujemne24,32. Proponujemy zastosowanie multipleksowanego testu IPC z testem docelowym jako najprostszą metodą testów hamowania PCR23. Wreszcie, konieczne jest przeprowadzenie badania in situ testu z próbek pobranych w terenie i pobranych w laboratorium, aby zapewnić amplifikację docelową w próbkach środowiskowych24.
Istnieją ograniczenia w stosowaniu specyficznych dla gatunku, opartych na sondzie testów qPCR z próbkami eDNA. Na przykład projektowanie wielu testów do testowania może być ograniczone dostępnością sekwencji, a kompromis może być konieczny w odniesieniu do aspektów wydajności testu. Wybory te muszą być podyktowane celami badania i muszą być raportowane wraz z wynikami26. Na przykład, jeśli celem jest wykrycie rzadkiego gatunku i spodziewanych jest niewiele wyników pozytywnych, można zastosować test o niedoskonałej swoistości (tj. amplifikacji gatunków niedocelowych), jeśli wszystkie wykrycia zostaną zweryfikowane przez sekwencjonowanie. Jeśli celem jest monitorowanie zasięgu geograficznego gatunku, a dane dotyczące stężenia eDNA nie są potrzebne, można zastosować test o niedoskonałej wydajności, a dane podać tylko jako procent wykrywalności. Ponadto, dopóki wszystkie potencjalne współplemieńce nie zostaną przetestowane w laboratorium, co jest rzadko możliwe, nie można poznać z absolutną pewnością prawdziwej swoistości testu. Na przykład test został zaprojektowany i przetestowany na kilku gatunkach małży słodkowodnych w rzece Clinch. Aby użyć tego testu w innym systemie rzecznym, musielibyśmy przetestować go na zestawie gatunków w nowej lokalizacji. Zmienność genetyczna w obrębie gatunku lub populacji, która nie jest badana podczas opracowywania testu, może również wpływać na swoistość. Wreszcie, nawet jeśli test został zweryfikowany jako posiadający wysoką wydajność techniczną; Warunki zmieniają się podczas pracy w terenie. Warunki niezwiązane z testem, takie jak przepływ wody, pH i zachowanie zwierząt, mogą zmienić wykrywalność eDNA, podobnie jak wykorzystanie różnych protokołów pobierania i ekstrakcji eDNA. Stosowanie testów, które są zoptymalizowane i dobrze opisane, ułatwi zrozumienie wpływu takich parametrów na wykrywanie eDNA.
Dziedzina eDNA dojrzewa poza etap analizy eksploracyjnej do coraz większej standaryzacji metod i technik. Osiągnięcia te poprawią naszą wiedzę na temat technik, możliwości i ograniczeń eDNA. Proces optymalizacji, który opisaliśmy powyżej, poprawia czułość, swoistość i odtwarzalność testu. Ostatecznym celem tego udoskonalenia i standaryzacji metod eDNA jest poprawa zdolności badaczy do wyciągania wniosków na podstawie danych eDNA, a także zwiększenie zaufania użytkowników końcowych i interesariuszy do wyników.

Badacze i menedżerowie coraz bardziej interesują się wykorzystaniem środowiskowych testów DNA do wykrywania gatunków. Przez trzy dekady ilościowy lub rzeczywisty PCR (qPCR/rtPCR) był stosowany w wielu dziedzinach do specyficznego dla sekwencji wykrywania i kwantyfikacji kwasów nukleinowych1,2. W stosunkowo nowej dziedzinie badań nad eDNA stosowanie tych testów ze standardową krzywą do ilościowego oznaczania kopii docelowego DNA na objętość lub masę próbki eDNA stało się obecnie rutynową praktyką. Sekwencje mitochondrialnego DNA są na ogół ukierunkowane w testach eDNA, ponieważ genom mitochondrialny jest obecny w tysiącach kopii na komórkę, ale możliwe są również testy dla sekwencji jądrowego DNA lub RNA. Ważne jest, aby zrozumieć, że opublikowane testy próbek eDNA nie zawsze są równe pod względem wydajności. Wiarygodność testu w wykrywaniu tylko DNA gatunku docelowego (tj. swoistość) i wykrywaniu małych ilości docelowego DNA (tj. czułość) może się znacznie różnić ze względu na różnice w sposobie zaprojektowania, selekcji, optymalizacji i testowania testu. Raportowanie ilościowych miar wydajności testów było wcześniej w dużej mierze pomijane, ale ostatnio pojawiają się standardy mające na celu poprawę przejrzystości w opracowywaniu testów3,4,5,6,7,8.
Optymalizacja i raportowanie pomocy w testach w projektowaniu badań i interpretacji wyników badań eDNA. Testy, które reagują krzyżowo z DNA gatunków niebędących gatunkami docelowymi, mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wykryć, podczas gdy testy o niskiej czułości mogą nie wykrywać DNA gatunku docelowego, nawet jeśli jest ono obecne w próbce (wyniki fałszywie ujemne). Zrozumienie czułości i selektywności testu pomoże w określeniu nakładu pracy związanego z pobieraniem próbek w celu wykrycia rzadkich gatunków. Ponieważ istnieje wiele naturalnych źródeł zmienności w eDNA, badania muszą w jak największym stopniu ograniczyć kontrolowane źródła zmienności, w tym w pełni zoptymalizować i scharakteryzować test eDNA3.
Warunki, które bezpośrednio wpływają na specyficzność lub czułość testu, zmienią jego działanie. Może się to zdarzyć w różnych warunkach laboratoryjnych (tj. różne odczynniki, użytkownicy, maszyny itp.). W związku z tym protokół ten powinien zostać ponownie przeanalizowany przy stosowaniu testu w nowych warunkach. Nawet testy dobrze scharakteryzowane w literaturze powinny być testowane i optymalizowane, gdy zostaną przyjęte przez nowe laboratorium lub przy użyciu różnych odczynników (np. roztwór master-mix)5,9. Swoistość testu może ulec zmianie w przypadku zastosowania do innego regionu geograficznego, ponieważ test jest stosowany do próbek z nowej społeczności biotycznej, która może obejmować gatunki niebędące przedmiotem zwalczania, na których test nie został przetestowany, i może wystąpić zmienność genetyczna u gatunku docelowego. Ponownie, test powinien zostać ponownie oceniony, gdy jest używany w nowej lokalizacji. Warunki polowe różnią się od warunków laboratoryjnych, ponieważ w terenie istnieje większe prawdopodobieństwo, że inhibitory PCR będą obecne w próbkach. Inhibitory PCR bezpośrednio wpływają na reakcję amplifikacji, a tym samym wpływają na wydajność testu. Z tego powodu podczas opracowywania testu eDNA wymagana jest wewnętrzna kontrola pozytywna.
Na koniec, warunki środowiskowe w terenie mogą wpływać na cząsteczki DNA gatunku docelowego i ich przechwytywanie poprzez degradację, transport i zachowanie DNA. Co więcej, różne protokoły pobierania i ekstrakcji DNA różnią się pod względem skuteczności i zdolności do zatrzymywania DNA. Należy jednak zauważyć, że procesy te wpływają na wykrywalność eDNA, ale nie na wydajność testów molekularnych. W związku z tym wykrywalność DNA od gatunków docelowych w próbkach terenowych jest funkcją zarówno parametrów technicznych testu qPCR, jak i warunków terenowych oraz protokołów pobierania, przechowywania i ekstrakcji. Korzystając z dobrze scharakteryzowanego i wysoce wydajnego testu, użytkownicy mogą czuć się pewni jego możliwości; dzięki czemu naukowcy mogą teraz skupić się na zrozumieniu zewnętrznych czynników testowych (tj. zmiennych środowiskowych, różnic w protokołach wychwytywania lub ekstrakcji) wpływających na wykrywanie eDNA.
Tutaj skupiamy się szczególnie na wydajności technicznej testów poprzez rygorystyczne projektowanie i optymalizację. Demonstrujemy protokół za pomocą testu opartego na sondzie opracowanego do wykrywania małża słodkowodnego, mukleta (Actinonaias ligamentina), z wody pobranej w rzece Clinch w USA. Niedawno Thalinger i in. (2020) przedstawili wytyczne dotyczące walidacji celowanych testów eDNA. Projekt testu zgodny z naszym protokołem przyniesie test na poziomie 4 Thalingera i in. oraz dodatkowy krok w kierunku poziomu 56. W tym momencie wydajność techniczna testu zostanie zoptymalizowana i będzie on gotowy do regularnego stosowania w zastosowaniach laboratoryjnych i terenowych. Dalsze wykorzystanie testu w eksperymentach laboratoryjnych, mezokosmicznych i terenowych może następnie odpowiedzieć na pytania dotyczące wykrywania eDNA i czynników wpływających na wykrywalność, co jest ostatnim krokiem walidacji na poziomie 56.

<table><tbody><tr><td>96 Miejsce Regały dwustronne z pokrowcami</td><td>Globe Scientific</td><td>456355AST</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice do czyszczenia (np. lateks, nitryl itp.)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>43431, 55090</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 2,0 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>2681332</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do PCR z twardą skorupą, niskoprofilowe, cienkościenne, z listwą przypodłogową, białe/ przezroczyste</td><td>startery</td><td></td> do przodu i do tyłu Bio-Rad#HSP9601 <td></td></tr><tr><td>IPC</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>brak</td><td>produkt niestandardowy</td></tr><tr><td>Sondy IPC PrimeTime qPCR</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>brak</td><td>produkt niestandardowy</td></tr><tr><td>IPC Ultramer DNA Oligo syntetyczny szablon</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>brak</td><td>produktu niestandardowego</td></tr><tr><td>Labnet MPS 1000 Kompaktowa mini wirówka do płytek PCR</td> Maszyna do mikrowirówek <td>Labnet</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Różne-Każda</td><td></td> <td>mikrowirówka, która mieści probówki 1,5 ml i 2,0 ml, jest zazwyczaj w porządku.</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca Microseal 'B' PCR, klej, optyczna</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)</td>Końcówki do pipet <td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>GP LTS 1000 i mikro; L F 768A/8</td><td>Końcówki</td> do pipet <td>30389272</td><td></td>Rainin</tr><tr><td>GP LTS 20 &micro; L F 960A/10</td> Końcówki do pipet <td>30389274</td><td></td><td>Rainin</td></tr><tr><td>GP LTS 200 &micro; L F 960A/10</td><td>Pipety 30389276</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rainin Rainin</td><td>Różne</td><td>W zależności od preferencji laboratoryjnych pipety ręczne lub elektroniczne mogą być używane przy różnych maksymalnych objętościach.</td></tr><tr><td>TaqMan Environmental Master Mix 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4396838</td><td></td></tr><tr><td>Docelowe startery do przodu i do tyłu</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>brak</td><td>produkt niestandardowy</td></tr><tr><td>Target PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>brak</td><td>produkt niestandardowy</td></tr><tr><td>Docelowy syntetyczny fragment genu gBlock</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>brak</td><td>produktu niestandardowego. używany do serii standardowych rozcieńczeń qPCR</td></tr><tr><td>Bufor TE</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER</td><td>Fisher Scientific</td><td>50728002</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów pcr do zastosowań środowiskowych dna

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

Opracowywane są nowe, nieinwazyjne metody wykrywania i monitorowania obecności gatunków, które pomagają w zarządzaniu rybołówstwem i ochroną dzikiej przyrody. Wykorzystanie próbek środowiskowego DNA (eDNA) do wykrywania makrobioty jest jedną z takich metod, która szybko staje się popularna i jest wdrażana w krajowych programach zarządzania. W tym miejscu skupiamy się na opracowaniu specyficznych dla gatunku testów celowanych do zastosowań ilościowych PCR (qPCR) opartych na sondzie. Stosowanie qPCR opartego na sondzie zapewnia większą specyficzność niż jest to możliwe w przypadku samych starterów. Co więcej, możliwość ilościowego określenia ilości DNA w próbce może być przydatna w naszym zrozumieniu ekologii eDNA i interpretacji wzorców wykrywania eDNA w terenie. Przy opracowywaniu i testowaniu tych testów należy starannie rozważyć, aby zapewnić czułość i swoistość wykrywania gatunków docelowych w próbce środowiskowej. W tym protokole określimy kroki potrzebne do zaprojektowania i przetestowania testów opartych na sondach w celu wykrycia gatunku docelowego; w tym tworzenie baz danych sekwencji, projektowanie testów, wybór i optymalizacja testów, testowanie wydajności testów i walidacja w terenie. Wykonanie tych kroków pomoże uzyskać wydajny, czuły i specyficzny test, który może być używany z pewnością. Demonstrujemy ten proces za pomocą naszego testu przeznaczonego dla populacji błotnika (Actinonaias ligamentina), gatunku małża słodkowodnego występującego w rzece Clinch w USA.

Środowiskowe testy DNA wymagają rygorystycznego projektowania, testowania, optymalizacji i walidacji przed rozpoczęciem zbierania danych terenowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który przeprowadza użytkowników przez każdy etap projektowania specyficznego dla gatunku, opartego na sondzie testu qPCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA gatunku docelowego z próbek środowiskowych.

Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

Dobrze zoptymalizowane testy są niezbędne do prawidłowej interpretacji środowiskowych danych DNA. Protokół ten opisuje niezbędne kroki projektowania i testowania w celu opracowania takiego testu. Ogólnie rzecz biorąc, środowiskowe DNA jest nieinwazyjną metodą wykrywania określonego gatunku lub zestawu gatunków.Może obniżyć koszty i być bardziej czuły w porównaniu z konwencjonalnymi metodami pomiarowymi. Metoda ta może pomóc w ochronie przyrody i zarządzaniu dziką przyrodą poprzez wykrywanie DNA gatunku będącego przedmiotem zainteresowania, co pozwala potencjalnie wywnioskować obecność tego gatunku na badanym obszarze. Ze względu na dużą czułość ilościowego PCR, do zanieczyszczenia może dojść łatwo, a kontrole ujemne są potrzebne do zidentyfikowania etapów, na których wprowadzono zanieczyszczenie.eDNA to dziedzina zaśmiecona żargonem i skrótami myślowymi. Dla tych, którzy nie mają doświadczenia w biologii molekularnej lub qPCR, demonstracje wizualne mogą pomóc w planowaniu projektu eksperymentalnego od konceptualizacji po generowanie danych. Procedurę zademonstrują Dannise Ruiz Ramos, biolog z naszego laboratorium, oraz Trudi Frost, pomoc laboratoryjna studentki.Aby rozpocząć, wyszukaj i pobierz sekwencje z wielu regionów genów dla interesujących gatunków, korzystając z bazy danych nukleotydów NCBI. Wybierz wszystkie sekwencje, które pasują do specyfikacji, a następnie wybierz opcję Wyślij do. Wybierz opcję Complete Record, File, Download Format (Format pobierania) jako GenBank lub FASTA, a następnie Create File (Utwórz plik). Te sekwencje są teraz zapisywane na komputerze.Powtórz te kroki dla wszystkich interesujących Cię gatunków. Sekwencje dla każdego regionu genu należy przechowywać w osobnym pliku, ponieważ będą one analizowane oddzielnie. Aby wyrównać sekwencje z każdego regionu genu osobno, zaimportuj pobrane pliki sekwencji do programu do wyrównywania sekwencji, takiego jak oprogramowanie Geneious Prime.Utwórz osobne foldery dla każdego regionu genu, a następnie zaznacz wszystkie sekwencje w folderze zawierającym sekwencje z jednego regionu genu. Użyj narzędzia Wielokrotne wyrównanie, aby utworzyć wyrównanie nukleotydów, takie jak Geneious lub MUSCLE wybranych sekwencji. Wybierz obiecujące regiony do zaprojektowania testu dzięki wizualizacji wyrównanych danych sekwencji.Wybierz region, w którym dostępnych jest wiele danych sekwencyjnych dla interesujących gatunków, jest wysoce rozbieżny między gatunkami i wykazuje niską zmienność w obrębie gatunku. Następnie zaprojektuj startery testowe i sondę. Użyj oprogramowania do projektowania testów qPCR, aby zaprojektować pięć zestawów testów qPCR.Wklej wybraną sekwencję w polu Wpis sekwencji. Jeśli wyrównanie utworzyło odstępy, usuń je z sekwencji. Wybierz sondę starterów qPCR 2 w opcji Wybierz swój projekt, a następnie pobierz zalecane testy.Skopiuj sekwencje ze startera do przodu pierwszego testu i wyszukaj tę sekwencję startera w wcześniej utworzonym wyrównaniu. Jeśli używasz Geneious Prime, użyj narzędzia Annotate Predict (Opisz przewidywanie), aby dodać region startera do wyrównania. Zrób to dla wszystkich kombinacji startera i sondy.Należy sprawdzić te obszary wyrównania pod kątem zmienności w obrębie gatunków docelowych, jak również w obrębie gatunków współwystępujących. Przetestuj podkłady in silico za pomocą NCBI Primer-BLAST. Wklej podkłady do mojego własnego pudełka z podkładami w sekcji Parametry podkładu.W opcjach Parametry sprawdzania specyficzności pary starterów wybierz NR jako bazę danych i wpisz porządek taksonomiczny lub rodzinę organizmu będącego przedmiotem zainteresowania w polu Organizm. Upewnij się, że wybrane startery prawdopodobnie nie wzmocnią gatunków niedocelowych. Przetestuj skuteczność testu in vitro, tworząc krzywą wzorcową i określając wydajność krzywej oraz zakres liniowy.Zbadać co najmniej sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń syntetycznego wzorca DNA zawierającego sekwencję docelową, w ilości około od jednej do miliona kopii na reakcję. Użyj oprogramowania qPCR, aby wykreślić wartość CQ każdego wzorca na osi Y, a logarytm o podstawie 10 początkowego stężenia wzorca w kopiach na reakcję na osi X. Oprogramowanie qPCR powinno automatycznie uruchomić regresję liniową.Oblicz wydajność na podstawie nachylenia regresji. Sprawdź wzrokowo krzywą standardową pod kątem odchylenia lub słabej wydajności, mierzonej wydajnością i wartościami R kwadrat. Należy zastosować wewnętrzną kontrolę dodatnią w celu zbadania zahamowania PCR rzeczywistych próbek terenowych, co może prowadzić do zmniejszenia czułości i wyników fałszywie ujemnych.Określić granice wykrywalności i kwantyfikacji dla każdego testu. Przetestuj testy na gatunkach niedocelowych, aby zweryfikować swoistość i upewnić się, że test działa dobrze z multipleksem IPC. Testy o dobrej czułości, swoistości i skuteczności mogą przejść do kolejnych etapów.Aby przeprowadzić badanie in situ testu, należy pobrać wiele próbek wody i przetworzyć je do qPCR. Uruchom ilościowy test PCR i porównaj stężenie eDNA i częstotliwość wykrywania ze znanymi różnicami w występowaniu i liczebności miejsc. Potwierdź wszystkie wykrycia przez sekwencjonowanie.Dostępne sekwencje wszystkich gatunków Unionidae w rzece Clinch zostały pobrane i wyrównane. Po zaprojektowaniu wielu testów, do wyrównania dodano pięć zestawów starterów i sondy w celu oceny wizualnej. Zestawy starterów i sond zostały przetestowane in silico i in vitro.W laboratorium wszystkie testy zostały przetestowane przy użyciu ekstrakcji DNA 27 dostępnych gatunków w celu zweryfikowania swoistości. W jednym z testów udało się amplifikować tylko gatunki docelowe. Udany test z dobrą wydajnością i wartościami R kwadrat jest pokazany tutaj.LOD i LOQ dla wybranego testu wynosiły po pięć kopii na reakcję. W przeciwieństwie do tego, testy, które dały standardową krzywą o słabej wydajności, zostały odrzucone. W jakościowym qPCR wzorcowe rozcieńczenia amplifikują się przy równomiernie rozłożonych wartościach ilościowych cyklu wynoszących około 3,3 cykli na każdą dziesięciokrotną różnicę stężenia.W przypadku słabego qPCR wzorce mogą wykazywać nierównomierne różnice w wartościach kwantyfikacji cyklu między rozcieńczeniami. Amplifikację IPC dla nieznanych próbek należy porównać z wynikami IPC kontroli matrycy ujemnej. Jeżeli w próbkach nie ma żadnych inhibitorów, wszystkie amplifikacje IPC powinny mieć ścisłe grupowanie na wykresie, z wartościami kwantyfikacji cyklu prawie takimi samymi jak w przypadku kontroli bez matrycy.Do celów badań in situ testu, lokalizacje obejmowały dno dna łoża małży w strumieniu, dno dna dna mięśni w pobliżu brzegu, 100 metrów w dół dna w strumieniu, 500 metrów w dół dna w strumieniu i 500 metrów w dół dna w pobliżu brzegu. Ilościowe testy PCR dla środowiskowego DNA mogą pomóc w monitorowaniu zarówno gatunków inwazyjnych, jak i zagrożonych, a także poprawić nasze zrozumienie przestrzennych i czasowych zmian w wykrywaniu gatunków bez konieczności fizycznego uchwycenia poszczególnych organizmów.

development-testing-species-specific-quantitative-pcr-assays-for

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Przedstawiona tutaj metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania DNA

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Ten film pokazuje użyteczność cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów w próbkach DNA. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na komory, które działają jako niezależne reakcje PCR, a wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych ze amplifikowanych celów w komorach służy do obliczenia częstotliwości wariantu allelu w próbce.

Cyfrowy PCR oparty na chip-in-a-tube do ilościowego oznaczania wariantów pojedynczych nukleotydów

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Niezawodne i dokładne formy analizy DNA w terenie są kluczowe dla wielu branż. Niniejszy artykuł oferuje dwie metody analizy mikroorganizmów środowiskowych w terenie: 1) izolację DNA mikroorganizmów z próbek środowiskowych za pomocą zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej oraz 2) analizę DNA za pomocą jednostki qPCR w terenie.

Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Protokół ten opisuje ustandaryzowany sposób zbierania próbek DNA środowiskowego waleni (eDNA) z jednostek obserwatorów wielorybów. Priorytetem jest wykonalność dla badaczy i wykwalifikowanych naukowców-obywateli, natomiast warunki środowiskowe, czas filtracji, mętność oraz logistyka pokładowa wyznaczają praktyczne ograniczenia zastosowania.

Pobieranie próbek DNA środowiskowych z jednostek obserwatorskich wielorybów w celu monitorowania waleni

Przedstawiono solidne i elastyczne podejście do potwierdzania odporności na herbicydy w populacjach chwastów. Protokół ten pozwala na określenie poziomów odporności na herbicydy i zastosowanie ich do szerokiej gamy gatunków chwastów i herbicydów z niewielkimi dostosowaniami.

Protokoły solidnych testów odporności na herbicydy u różnych gatunków chwastów

Naucz się projektować specyficzne dla gatunku testy qPCR do analizy DNA środowiskowego. Protokół obejmuje projektowanie sond, testowanie specyficzności in silico i in vitro oraz weryfikację w polowych próbkach wody.

Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA

Przeglądaj więcej filmów