Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Model ten może być wykorzystany do badania mechanizmów komórkowych obejmujących patogenezę zapalenia tylnego odcinka błony naczyniowej oka człowieka o podłożu immunologicznym. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku badania translacyjnego zapalenia błony naczyniowej oka u ludzi w monitorowaniu skuteczności nowych leków i dostarczaniu mechanistycznego wglądu w postęp choroby chemicznej. Główną zaletą stosowania tego modelu jest niezawodność indukcji choroby oraz zastosowanie nieinwazyjnych technik endoskopowych, które pozwalają monitorować postęp choroby.

Tutaj opisujemy, jak wywołać chorobę i ocenić patologię za pomocą kilku odczytów Aby przygotować IRBP 1-20 kompletny adiuwant Freunda lub CFA, ponownie zawiesić obliczoną ilość peptydu w minimalnej objętości 100% DMSO. Gdy proszek całkowicie się rozpuści, dodaj małe objętości PBS do probówki, aż osiągniesz ostateczną obliczoną objętość PBS zgodnie z liczbą myszy do wstrzyknięcia, delikatnie mieszając w celu wymieszania roztworu. Po przygotowaniu kompletnego adiuwanta Freunda, delikatnie i często pipetować roztwór, aby utworzyć lepką i równomiernie rozprowadzoną emulsję, dodając roztwór peptydu DMSO PBS kroplami w stosunku jeden do jednego do zawiesiny.

Aby napowietrzyć roztwory, użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów ustawionej na 700 mikrolitrów, aby wielokrotnie pipetować roztwór, aż do uzyskania gęstej, kremowej emulsji. Przed wstrzyknięciem zawiesiny peptydowej umieść każdą mysz do wstrzyknięcia w oddzielnej klatce i za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23 podaj dootrzewnowo 1,5 mikrograma toksyny krztuścowej Bordetella w 100 mikrolitrach pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1% surowicą myszy dla każdego zwierzęcia. Po wstrzyknięciu roztworu toksyny krztuścowej mysz należy trzymać w pozycji przypominającej kark, a skórę uszczypnąć, aby utworzyć strukturę przypominającą namiot z tyłu szyi.

Nawlecz igłę na przestrzeń między palcem a kciukiem i wstrzyknij 200 mikrolitrów emulsji IRBP na skórę namiotu, utrzymując ciśnienie po wstrzyknięciu i obracając główkę igły, aby zamknąć skórę przed wycofaniem. Aby ocenić kliniczną chorobę, w 21 dniu po wstrzyknięciu należy potwierdzić brak odpowiedzi na odruch płatkowy u myszy ze znieczulonym peptydem, której wstrzyknięto tabletkę, i unieruchomić zwierzę w karku. Miejscowo nanosić 1% tropikamidu i 2% fenylefryny na rogówkę każdego oka natychmiast po wstrzyknięciu.

Gdy źrenice całkowicie się rozszerzą, umieść mysz na specjalnie zbudowanym stoliku mikroskopowym. Ustaw mikroskop tak, aby miał pełny dostęp do siatkówki. W razie potrzeby wyreguluj okular przez cały proces obrazowania, aby zobaczyć tarczę nerwu wzrokowego i siatkówkę oraz uzyskać obrazy całego obszaru siatkówki, dostosowując i zakrywając wszystkie rogi obwodu.

Aby zmierzyć nieszczelność naczynia, podaj 100 mikrolitrów 2% fluoresceiny podskórnie z tyłu szyi i zmień położenie myszy tak, aby siatkówka znajdowała się w środku obrazu na żywo. Ustaw fundoskop na filtr wzbudzenia światła niebieskiego o długości od 465 do 490 nanometrów przed uzyskaniem obrazu każdego z nich po 1,5 i siedmiu minutach od wstrzyknięcia fluorescencyjnego. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, dootrzewnowo podaj zastrzyk przeciwuspokajający w celu powrotu do zdrowia i umieść mysz w klatce na rozgrzanej macie z dostępem do mokrej namoczonej diety z monitorowaniem, aż mysz odzyska przytomność.

W celu klinicznej oceny choroby na obrazach należy oprzeć ocenę kliniczną na nasileniu zapalenia tarczy nerwu wzrokowego, mankietu naczyń siatkówki, nacieku tkanki siatkówki i uszkodzenia strukturalnego. Oceń każdy z tych parametrów w skali od jednego do pięciu. Łączna suma jest reprezentatywna dla klinicznej choroby dla całego oka, przy czym maksymalny wynik wynosi 20 punktów na oko.

Po obrazowaniu dna oka w celu uzyskania końcowego klinicznego punktu końcowego badania, należy poddać mysz eutanazji. Do analizy histologicznej rozsuń powieki, aby uzyskać dostęp do całego oka, a następnie umieść zakrzywione kleszcze za kulą ziemską, aby uchwycić tkankę łączną oczodołu i nerw wzrokowy i wyłuszczyć oko. Umieść wyłuszczone oko w jednym do pięciu mililitrów 4% aldehydu glutarowego na co najmniej 15 minut przed przeniesieniem narządu do jednego do pięciu mililitrów 10% formaldehydu na co najmniej 24 godziny.

Po histologicznym barwieniu tkanek, zgodnie ze standardowymi protokołami, przypisano wyniki w skali od zera do trzech w zależności od poziomu naciekania komórek odpornościowych i stopnia uszkodzenia siatkówki. Zmiany dna oka są klasyfikowane w trakcie progresji choroby jako zmiany zapalne, które obejmują zapalenie tkanki siatkówki oraz naczyń krwionośnych i tarczy wzrokowej oraz uszkodzenie strukturalne siatkówki, a także zmiany histologiczne oparte na naciekających komórkach odpornościowych i upośledzeniach strukturalnych. Te zmiany kliniczne i histopatologiczne mogą być oceniane i oceniane w celu oceny progresji choroby i oceny skuteczności interwencji terapeutycznej.

Nietrzymanie naczyń krwionośnych jest również patologiczną cechą modelu i ludzkiego zapalenia błony naczyniowej oka. Jak pokazano w tej analizie, fluoresceina może być używana do wizualizacji przecieku naczyniowego jako kolejny odczyt tego modelu. Dla badaczy ważne jest, aby upewnić się, że emulsja jest przygotowana prawidłowo, bez śladów separacji między roztworami.

Należy je dokładnie wymieszać, a produkt końcowy powinien mieć gładką konsystencję. Procedura ta może być łączona z innymi metodami podawania leków oraz z cytometrią do fenotypowania naciekającego populacje komórek odpornościowych siatkówki.