Name: Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka u myszy przy użyciu peptydu IRBP 1-20. Technika umożliwia nieinwazyjne monitorowanie postępu choroby i ocenę skuteczności nowych leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JG otrzymał stypendium UCL Impact Scholarshipship i fundusze Rosetrees Trust na wsparcie CB. VC otrzymał grant badawczy od Akari Therapeutics Inc. Chcielibyśmy podziękować UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit, a w szczególności Pani Alison O'Hara i jej zespołowi za wsparcie techniczne.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku oraz wytycznymi Organu ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etycznej (AWERB).
1. Obudowa myszy C57BL/6J
<ol>
	<li>Myszy domowe w określonym środowisku wolnym od patogenów, w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność, z pożywieniem i wodą dostępną ad libitum.</li>
	<li>Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić na dorosłej kobiecie C57BL/6J (preferowane są kobiety, ponieważ częstość występowania kobiet i mężczyzn wynosi 1,4 do 1 u pacjentów z zapaleniem błony naczyniowej oka). Losowo dobieraj samice myszy C57BL/6J w wieku od 6 do 8 tygodni według wagi i wieku. Trzymaj myszy w indywidualnie wentylowanych klatkach (IVC) w grupach po 5-6 myszy w klatce.</li>
</ol>
2. Immunizacja myszy C57BL/6
<ol>
	<li>IRBP1-20 - Preparat emulsji CFA 
	UWAGA: Przygotowanie emulsji ma zasadnicze znaczenie dla odtwarzalności i występowania choroby; W związku z tym należy dołożyć wszelkich starań, aby zachować spójność w całym procesie przygotowania i między eksperymentami. Podczas przygotowywania emulsji należy wcześniej uwzględnić ubytki w obliczeniach wszystkich odczynników. Strata ta może być około 1,5 raza (lub 50% więcej przygotowanej objętości), w zależności od liczby myszy planowanych do szczepienia. Zapoznaj się z poniższym przykładem. Aby uodpornić 10 myszy, przygotuj 15 myszy i użyj 400 μg (peptyd na 20 g myszy) x 15 myszy = 6 mg. Każda mysz powinna otrzymać 200 μl do immunizacji (łącznie 3 ml). Końcowa objętość zawiera stosunek 1:1 roztworu peptydu i CFA, stąd 1,5 ml roztworu peptydu i 1,5 ml CFA.
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie sterylne roztwory w komorze z przepływem laminarnym, stosując techniki aseptyczne.</li>
		<li>Odważ żądaną ilość (400 μg na 20 g myszy) ludzkiego liofilizowanego peptydu IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT). Rozpuść peptyd w 100% DMSO. Przechowywać bulion w postaci liofilizowanej w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Aby upewnić się, że proszek jest całkowicie rozpuszczony, każdy płatek musi najpierw zetknąć się z DMSO i nie wykazywać śladów pozostałości ciał stałych. Dodawaj PBS małymi porcjami, aby osiągnąć ostateczną objętość. Nie mieszać z wirem, zamiast tego delikatnie mieszać pipetą. Końcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 1% całkowitej objętości preparatu peptydowego. Przygotowanie emulsji w plastikowej tubie o pojemności 20 ml ze zwężającym się dnem powinno umożliwić lepszy dostęp DMSO do liofilizowanego proszku.</li>
		<li>Dodać roztwór peptydu DMSO-PBS w stosunku 1:1 v/v do CFA, który został już uzupełniony o 1,5 mg/ml zabitych Mycobacterium tuberculosis, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 mg/ml. Dodawać kroplami, delikatnie i często pipetując, aby uzyskać lepką i równomiernie rozprowadzoną emulsję.</li>
		<li>Napowietrzaj roztwór peptydu i CFA za pomocą pipety o pojemności 1000 μl (ustawionej na 700 μl, aby zapobiec dalszej utracie) i pipety, aby uzyskać kremową, gęstą konsystencję. Technika ta polega na wielokrotnym zasysaniu pipetą w górę i w dół, aż do osiągnięcia pożądanej grubości. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy upewnić się, że roztwór antygenu i adiuwant są dokładnie wymieszane przed wstrzyknięciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dootrzewnowe wstrzyknięcie toksyny krztuścowej
	<ol>
		<li>Zawiesić 1,5 μg toksyny Bordetella pertussis w 100 μl pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1% surowicą mysią11.</li>
		<li>Wykonać wstrzyknięcie i.p. za pomocą sterylnej strzykawki i igły 23G. 
		UWAGA: W celu uniknięcia zaburzeń w miejscu wstrzyknięcia, przed wstrzyknięciem antygenu należy podać toksynę krztuścową.</li>
		<li>Tymczasowo przenieś każdą mysz do osobnej klatki, aby otrzymać pojedyncze wstrzyknięcie 100 μl i.p. toksyny Bordetella pertussis.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podskórne wstrzyknięcie emulsji IRBP
	<ol>
		<li>Następnie należy wstrzyknąć emulsję IRBP podskórnie. Proces ten wymaga dwóch opiekunów zwierząt, odpowiednio ubranych w środki ochrony zgodnie z przepisami BHP.</li>
		<li>Niech jedna wyszkolona osoba lekko przytrzyma mysz na klatce w pozycji przypominającej kark, z brzuchem skierowanym w dół, podczas gdy druga wyszkolona osoba szczypie skórę, tworząc strukturę przypominającą namiot z tyłu szyi, w którą można włożyć igłę, aby wsunąć ją między palec a kciuk. 
		UWAGA: Istnieje niebezpieczeństwo zranienia igłą.</li>
		<li>Po umieszczeniu igły wstrzyknąć 200 μl emulsji IRBP. Podczas wyjmowania igły należy obrócić główkę igły, aby zamknąć skórę przed wyciągnięciem, a następnie wycisnąć nacisk na miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec cofaniu się emulsji. 
		UWAGA: Emulsja nie może stykać się ze skórą lub sierścią myszy, ponieważ może to spowodować podrażnienie, a w cięższych przypadkach rozwój zmiany chorobowej. W takim przypadku obszar należy natychmiast i dokładnie wytrzeć przy użyciu 70% etanolu, a następnie wysuszyć. 
		UWAGA: Jeśli drenujące węzły chłonne są potrzebne do badania pod koniec badania, miejsce wstrzyknięcia będzie inne. W takim przypadku należy wstrzyknąć podskórnie 100 μl po obu stronach boku. Spowoduje to silniejszą reakcję w drenujących pachwinowych węzłach chłonnych, które można wyciąć w czasie zbioru. Jeśli jednak zamierzonym wynikiem jest wyłącznie rozwinięcie się EAU, preferowane jest pojedyncze wstrzyknięcie 200 μl w tylną część szyi, aby uniknąć dyskomfortu związanego z wieloma miejscami wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena kliniczna - badanie dna oka myszy
UWAGA: Kliniczna choroba ma być oceniana za pomocą badania dna oka, poprzez obrazowanie na żywo w jasnym polu za pomocą fundoskopu i oprogramowania Discover używanego do wizualizacji.
<ol>
	<li>Na początku choroby (dzień 12-14) uspokajaj myszy w znieczuleniu ogólnym, stosując kombinację ketaminy (50 mg / ml) i Domitora (medetomidyna; 1 mg / ml). Rozcieńczyć 1-składnikową domitor; 1,5 części ketaminy i 2,5 części sterylnej wody do wstrzykiwań, a następnie wstrzyknąć 100 μl na 30 g dootrzewnowo. Do powyższej kombinacji znieczulenia należy użyć sterylnych strzykawek o pojemności 1 ml i igieł 23G.</li>
	<li>Następnie monitoruj mysz, aby upewnić się, że wszystkie odruchy zostały utracone i że nie reaguje na bodźce.</li>
	<li>Natychmiast po otrzymaniu wstrzyknięcia dożylnego, gdy mysz jest nadal trzymana w karku, należy zastosować miejscowo 1% tropikamidu i 2,5% fenylefryny do każdego oka w celu rozszerzenia źrenicy. Staraj się całkowicie pokryć rogówkę obydwoma roztworami rozszerzającymi. Może minąć kilka minut, zanim źrenica zostanie w pełni rozszerzona.</li>
	<li>Następnie obficie nałóż na oko maść lepką i utrzymuj przez cały proces obrazowania, aby oko było w pełni nawilżone i nawilżone.</li>
	<li>W międzyczasie otwórz oprogramowanie (np. Discover) i ustaw fundoskop (np. Micron) tak, aby robił zdjęcia w jasnym polu. Przydziel każdej myszy folder i oznacz obrazy literą R lub L zgodnie z każdym sfotografowanym okiem.</li>
	<li>Zamontuj mysz na specjalnie zaprojektowanym stoliku do wizualizacji na żywo i ustaw mikroskop, aby uzyskać pełny dostęp do siatkówki.</li>
	<li>Aby uzyskać dokładne odwzorowanie choroby, wykonaj zdjęcia całego obszaru siatkówki, obejmującego wszystkie rogi obwodu oprócz tarczy nerwu wzrokowego. Aby to osiągnąć, wyreguluj okular w całym tekście. Bardzo ważne jest, aby oko pozostawało w pełni nawilżone przez cały czas trwania procesu obrazowania; Upewnij się to, uzupełniając maść do oczu w stałym tempie.</li>
	<li>Na tym etapie należy zapoznać się z sekcją 4 (poniżej), aby wykonać angiografię fluoresceinową.</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich badań obrazowych rozcieńczyć środek przeciwuspokajający odwracający działanie znieczulające (5 mg/ml Antisedan) w wodzie do wstrzykiwań i podać w dawce 0,1 mg/kg i.p. Umieść mysz z powrotem w klatce i umieść ją na wstępnie podgrzanej macie z dostępem do mokrej diety do czasu wyzdrowienia. Całkowita regeneracja charakteryzuje się ruchem całego ciała i chodzeniem po klatce miarowym krokiem, zwykle trwającym kilka godzin.</li>
	<li>W wyznaczonym eksperymentalnym punkcie końcowym (np. w dniach 21-23) powtórz kroki 4.1-4.5 i ponownie wykonaj zdjęcia całego obszaru siatkówki, pokrywając tarczę nerwu wzrokowego i wszystkie rogi obwodu, aby uchwycić dokładne odwzorowanie choroby.</li>
</ol>
4. Angiografia fluoresceinowa
<ol>
	<li>Aby zmierzyć nieszczelność naczyń krwionośnych u tych zwierząt, będąc pod narkozą, należy wstrzyknąć każdej myszy 2% fluoresceiny podskórnie z tyłu szyi i ustawić tak, aby siatkówka była wyśrodkowana w środku obrazu na żywo.</li>
	<li>Ustaw fundoskop na filtr wzbudzenia światła niebieskiego o długości fali 465-490 nm. Światło wychwycone przez wzbudzoną fluoresceinę ma długość fali 520-530 nm.</li>
	<li>Po 1,5 minuty od wstrzyknięcia fluoresceiny zrób zdjęcie każdej siatkówki i powtórz ponownie po 7 minutach. 
	UWAGA: Czas ma kluczowe znaczenie dla tych zdarzeń, jeśli nie można uchwycić obu, wystarczy zobrazować jedno oko.</li>
</ol>
5. Kliniczna ocena chorób
<ol>
	<li>Oprzyj ocenę kliniczną na nasileniu następujących kryteriów: zapalenie tarczy nerwu wzrokowego, naciął naczyń siatkówki, naciek tkanki siatkówki i uszkodzenie strukturalne.</li>
	<li>Każdemu z tych parametrów należy przyznać ocenę w skali od 0 do 5, a łączna suma jest reprezentatywna dla klinicznej choroby dla całego oka, przy czym maksymalny wynik wynosi 20 punktów na oko. Tabela 1 może służyć jako przewodnik dla kryteriów punktacji.</li>
</ol>
6. Histologia i punktacja histologiczna
<ol>
	<li>Po eutanazji myszy przez zwichnięcie szyjki macicy, wyłuszczenie oczu, rozsuwając powieki, aby uzyskać łatwy dostęp do całego oka.</li>
	<li>Następnie umieść zakrzywione kleszcze za kulą ziemską z zamiarem uchwycenia oczodołowej tkanki łącznej i nerwu wzrokowego. Uważaj, aby nie ściskać kuli ziemskiej.</li>
	<li>W celu utrwalenia umieść oko w 4% aldehydzie glutarowym na co najmniej 15 minut, aby zminimalizować odwarstwienie siatkówki, a następnie przenieś do 10% formaldehydu na co najmniej 24 godziny. 1-2 ml utrwalacza dałoby wystarczającą objętość, aby pokryć dwoje oczu.</li>
	<li>Wykonaj zatapianie w parafinie, cięcie na mikrotomie i barwienie zgodnie ze standardowymi protokołami. Grubość przekroju 3-4 μm jest zalecana dla każdego rodzaju barwienia.</li>
	<li>Wykonaj badanie histologiczne oczu przy użyciu standardowych protokołów barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E).</li>
	<li>Przypisz punkty w skali od 0 do 4, zgodnie z kryteriami punktacji EAU, w oparciu o stopień naciekania komórek odpornościowych w siatkówce i naczyniówce, przerwanie warstw siatkówki, stopień powstania ziarniniaka i stopień odwarstwienia siatkówki, wskazując na uszkodzenie siatkówki, jak opisano wcześniej (Agarwal 2013) i podsumowano w tabeli 211.</li>
</ol>

<ol><li>Lyu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMP778%2C+a+selective+inhibitor+of+RORgammat%2C+suppresses+experimental+autoimmune+uveitis+development%2C+but+affects+both+Th17+and+Th1+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations.</a> The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).</li>
<li>Klaska, I. P., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Mouse models of autoimmune uveitis.</a> Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).</li>
<li>Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+Bromodomain+Proteins+Suppresses+Retinal+Inflammatory+Disease+and+Downregulates+Retinal+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells.</a> The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).</li>
<li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+and+clinical+study+of+FK506+in+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis.</a> Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).</li>
<li>Nguyen, Q. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+Sirolimus+for+the+Treatment+of+Noninfectious+Uveitis%3A+Evolution+through+Preclinical+and+Clinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies.</a> Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).</li>
<li>Leal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-TNF+Drugs+for+Chronic+Uveitis+in+Adults-A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104(2019).</li>
<li>Chen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinct+IFN-%3F%2B+IL-17A%2B+Th+cells+in+experimental+autoimmune+uveitis%3A+T-cell+heterogeneity%2C+migration%2C+and+steroid+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response.</a> European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+grading+system+for+retinal+inflammation+in+the+chronic+model+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+using+digital+fundus+images%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images.</a> Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).</li>
<li>Copland, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+time-course+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+using+topical+endoscopic+fundal+imaging+with+histologic+and+cellular+infiltrate+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).</li>
<li>Dick, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doyne+lecture+2016%3A+intraocular+health+and+the+many+faces+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation.</a> Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).</li>
<li>Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+experimental+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rodent models of experimental autoimmune uveitis.</a> Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).</li>
<li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+look+at+autoimmunity+and+inflammation+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clininical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A look at autoimmunity and inflammation in the eye.</a> Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).</li>
<li>Caspi, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+experimental+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of experimental autoimmune uveitis.</a> Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+chronic+experimental+autoimmune+uveitis+%28EAU%29+of+the+C57BL%2F6+mouse+induced+by+adoptive+transfer+of+IRBP1-20-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells.</a> Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).</li>
<li>Horai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota-Dependent+Activation+of+an+Autoreactive+T+Cell+Receptor+Provokes+Autoimmunity+in+an+Immunologically+Privileged+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site.</a> Immunity. 43, 343-353 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+induced+vs.+spontaneous+models+of+autoimmune+uveitis+targeting+the+interphotoreceptor+retinoid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein.</a> PLoS One. 8, 72161(2013).</li>
<li>Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+coherence+tomography+and+electroretinography+to+evaluate+retinal+pathology+in+a+mouse+model+of+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis.</a> PLoS One. 8, 63904(2013).</li>
<li>Harry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+autoimmune+retinal+disease+by+lovastatin+does+not+require+Th2+cytokine+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction.</a> Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby zadeklarować w związku z tą pracą.

Eksperymentalne modele zwierzęce są niezbędnymi narzędziami do badania patogenezy chorób i badań przedklinicznych nowych paradygmatów terapeutycznych. W obecnym protokole omówiliśmy metodologię wywoływania, monitorowania i oceniania EAU, eksperymentalnego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten model EAU ma ponad 95% częstości występowania choroby, gdy wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z opisanym tutaj protokołem, i powoduje rozwój przewlekłego, jednofazowego EAU. Aby osiągnąć ten poziom czę...

Ten protokół pokaże, jak wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU) u myszy C57BL/6J poprzez pojedyncze podskórne wstrzyknięcie antygenu siatkówki w zemulgowanym adiuwantu. Metody monitorowania i oceny postępu choroby zostaną szczegółowo opisane za pomocą obrazowania dna oka i badania histologicznego, z określonymi w nich parametrami pomiarowymi. Ponadto omówiona zostanie angiografia fluoresceinowa, czyli technika badania struktury i przepuszczalności naczyń krwionośnych siatkówki.
Ten model EAU podsumowuje główne cechy niezakaźnego zapalenia tylnego odcinka błony naczyniowej oka u ludzi w odniesieniu do cech kliniczno-patologicznych oraz podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych, które napędzają chorobę. W EAU pośredniczą podzbiory Th1 i / lub Th17 samoreaktywnych limfocytów T CD4 +, jak pokazano w eksperymentach z transferem adoptywnym i u myszy zubożonych w IFNγ1. Duża część naszej wiedzy na temat potencjalnej roli tych komórek w zapaleniu błony naczyniowej oka pochodzi z badania EAU2, gdzie zarówno komórki Th1, jak i Th17 są wykrywane w tkankach siatkówki3. Często EAU jest używany jako model przedkliniczny do oceny użyteczności nowych terapii w łagodzeniu choroby. Podejścia terapeutyczne, które z powodzeniem modulowały chorobę EAU, wykazały pewną skuteczność w klinice i osiągnęły status zatwierdzony przez FDA. Przykładami są grupy leków immunoregulacyjnych, takie jak terapie ukierunkowane na limfocyty T: cyklosporyna, FK-506 i rapamycyna4,5,6. Ostatnio w tym modelu zbadano również interwencje ukierunkowane na nowe szlaki, aby zbadać zarówno mechanizm, jak i wpływ na wynik choroby. Obejmują one ukierunkowaną regulację transkrypcji za pomocą czytnika chromatyny, białek Bromodomain Extra-Terminal (BET) i inhibitorów P-TEFb3. Co więcej, bardziej konwencjonalne podejścia, takie jak inhibitor VLA-4, wykazały ostatnio supresję w EAU poprzez modulację efektorowych limfocytów T CD4 + 7. Ponadto stwierdzono również, że celowanie w komórki Th17 za pomocą TMP778, odwrotnego agonisty RORγt, znacznie tłumi EAU8. Co więcej, model ten daje możliwość badania przewlekłego autoimmunologicznego zapalenia siatkówki i towarzyszących mu mechanizmów leżących u jego podstaw, takich jak pobudzanie limfocytów.
Podstawowe odczyty dla badań przedklinicznych EAU to ocena kliniczna poprzez wykonanie obrazowania dna siatkówki i rzadziej, poprzez ocenę integralności siatkówki za pomocą optycznej tomografii koherentnej (OCT). Ocena histopatologiczna siatkówki i immunofenotypowanie komórek siatkówki za pomocą cytometrii przepływowej są następnie przeprowadzane po zakończeniu. Fundoskopia to łatwy w użyciu system obrazowania na żywo, który pozwala na szybką i powtarzalną ocenę kliniczną całej siatkówki. W przypadku ocen immunohistochemicznych techniki opierają się na przygotowaniu skrawków siatkówki, które pozwalają nam badać architekturę tkanki pod kątem stopnia stanu zapalnego i uszkodzeń strukturalnych9. Kryteria oceny i konwencjonalne systemy punktacji, dla wszystkich stosowanych technik, zostaną przedstawione w niniejszym protokole. Rozległość uszkodzeń zarejestrowanych za pomocą obrazowania dna oka często jest ściśle skorelowana ze zmianami histologicznymi. To podwójne podejście do monitorowania i oceny ciężkości choroby zapewnia większą czułość i bardziej wiarygodne wyniki pomiarów.
EAU jest dobrze znanym, powszechnie używanym modelem do badań przedklinicznych i badań nad chorobami oczu o podłożu immunologicznym. Model ten jest wiarygodny i powtarzalny z >95% częstością występowania choroby i generuje kompleksowe dane, które można wykorzystać do walidacji lub odrzucenia nowych terapii w leczeniu wewnątrzgałkowej choroby zapalnej, która stanowi główną przyczynę ślepoty w wieku produkcyjnym na całym świecie10.

<table><tbody><tr><td>antisedan</td><td>ZOETIS, USA</td><td></td><td>za obudzenie</td></tr><tr><td>Complete Freund' s Adiuwant; CFA</td><td>Sigma, UK</td><td>F5881</td><td>do szczepień&nbsp;</td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Orion Pharma, Finlandia</td><td></td><td>do znieczulenia</td></tr><tr><td>Flourescein</td><td>Sigma, UK</td><td>F2456</td><td>do angiografii</td></tr><tr><td>IRBP1-20</td><td>peptyd Chamberidge, peptyd brytyjski</td><td></td><td>; antygen&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Orion Pharma, Finlandia</td><td></td><td>do znieczulenia</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research, USA</td><td></td><td>do badania dna oka</td></tr><tr><td>Mouse Serum</td><td>Sigma, UK</td><td>M5905</td><td>do immunizacji&nbsp;</td></tr><tr><td>Mycobacterium terberculosis</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>344289</td><td>do szczepień&nbsp;</td></tr><tr><td>Toksyna krztuścowa</td><td>Sigma, UK</td><td>P2980</td><td>do szczepień&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorowodorek fenylefryny 2,5%&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb Wielka Brytania&nbsp;</td><td>PHEN25</td><td>do dylatacji&nbsp;</td></tr><tr><td>Tropicamid 1%</td><td>SANDOZ</td><td></td><td>do rozszerzania&nbsp;</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>WELDRICKS Pharmacy, Wielka Brytania</td><td>2082642</td><td>do smarowania oczu</td></tr></tbody></table>

eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU) jest napędzane przez komórki odpornościowe reagujące na własne antygeny. Wiele cech tego niezakaźnego, wewnątrzgałkowego modelu choroby zapalnej podsumowuje fenotyp kliniczny zapalenia tylnego odcinka błony naczyniowej oka dotykającego ludzi. EAU został niezawodnie wykorzystany do badania skuteczności nowych leków przeciwzapalnych, ich sposobu działania oraz do dalszego badania mechanizmów leżących u podstaw progresji choroby w zaburzeniach wewnątrzgałkowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół indukcji EAU u myszy C57BL/6J - najczęściej stosowanego organizmu modelowego z podatnością na tę chorobę. Kliniczna ocena ciężkości i progresji choroby zostanie przedstawiona za pomocą dna oka, badania histologicznego i angiografii fluoresceinowej. Procedura indukcji polega na podskórnym wstrzyknięciu emulsji zawierającej peptyd (IRBP1-20) z białka białka oka międzyfotoreceptorowego białka wiążącego retinoidy (znanego również jako białko wiążące retinol 3), Complete Freund's Adjuvant (CFA) i uzupełnionego zabitymi prątkami prątków gruźlicy. Po wstrzyknięciu tej lepkiej emulsji na kark następuje pojedyncze wstrzyknięcie dootrzewnowe toksyny krztuścowej Bordetella. Na początku objawów (12-14 dzień) i w znieczuleniu ogólnym wykonuje się obrazy dna oka w celu oceny postępu choroby poprzez badanie kliniczne. Dane te można bezpośrednio porównać z danymi w późniejszych punktach czasowych i szczycie choroby (dzień 20-22) z analizowanymi różnicami. Jednocześnie protokół ten pozwala badaczowi ocenić potencjalne różnice w przepuszczalności i uszkodzeniu naczyń za pomocą angiografii fluoresceinowej. EAU może być indukowany w innych szczepach myszy - zarówno dzikich typach, jak i genetycznie modyfikowanych - i łączony z nowymi terapiami oferującymi elastyczność w badaniu skuteczności leków i/lub mechanizmów chorobowych.

W niniejszym protokole opisujemy metodę krok po kroku indukowania modelu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka (EAU) poprzez immunizację myszy uveitogennym peptydem siatkówki pochodzącym z IRBP. Omówiono ocenę choroby z zastosowaniem powszechnie stosowanych i łatwo dostępnych podejść, choć nie wyczerpują one wszystkich możliwości i mogą być uzupełnione lub częściowo zastąpione innymi technikami obrazowania. Pierwsze oznaki EAU u myszy C57BL/6J można wykryć dwa tygodnie po immunizacji, a s...

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

Model ten może być wykorzystany do badania mechanizmów komórkowych obejmujących patogenezę zapalenia tylnego odcinka błony naczyniowej oka człowieka o podłożu immunologicznym. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku badania translacyjnego zapalenia błony naczyniowej oka u ludzi w monitorowaniu skuteczności nowych leków i dostarczaniu mechanistycznego wglądu w postęp choroby chemicznej. Główną zaletą stosowania tego modelu jest niezawodność indukcji choroby oraz zastosowanie nieinwazyjnych technik endoskopowych, które pozwalają monitorować postęp choroby.Tutaj opisujemy, jak wywołać chorobę i ocenić patologię za pomocą kilku odczytów Aby przygotować IRBP 1-20 kompletny adiuwant Freunda lub CFA, ponownie zawiesić obliczoną ilość peptydu w minimalnej objętości 100% DMSO. Gdy proszek całkowicie się rozpuści, dodaj małe objętości PBS do probówki, aż osiągniesz ostateczną obliczoną objętość PBS zgodnie z liczbą myszy do wstrzyknięcia, delikatnie mieszając w celu wymieszania roztworu. Po przygotowaniu kompletnego adiuwanta Freunda, delikatnie i często pipetować roztwór, aby utworzyć lepką i równomiernie rozprowadzoną emulsję, dodając roztwór peptydu DMSO PBS kroplami w stosunku jeden do jednego do zawiesiny.Aby napowietrzyć roztwory, użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów ustawionej na 700 mikrolitrów, aby wielokrotnie pipetować roztwór, aż do uzyskania gęstej, kremowej emulsji. Przed wstrzyknięciem zawiesiny peptydowej umieść każdą mysz do wstrzyknięcia w oddzielnej klatce i za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23 podaj dootrzewnowo 1,5 mikrograma toksyny krztuścowej Bordetella w 100 mikrolitrach pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1% surowicą myszy dla każdego zwierzęcia. Po wstrzyknięciu roztworu toksyny krztuścowej mysz należy trzymać w pozycji przypominającej kark, a skórę uszczypnąć, aby utworzyć strukturę przypominającą namiot z tyłu szyi.Nawlecz igłę na przestrzeń między palcem a kciukiem i wstrzyknij 200 mikrolitrów emulsji IRBP na skórę namiotu, utrzymując ciśnienie po wstrzyknięciu i obracając główkę igły, aby zamknąć skórę przed wycofaniem. Aby ocenić kliniczną chorobę, w 21 dniu po wstrzyknięciu należy potwierdzić brak odpowiedzi na odruch płatkowy u myszy ze znieczulonym peptydem, której wstrzyknięto tabletkę, i unieruchomić zwierzę w karku. Miejscowo nanosić 1% tropikamidu i 2% fenylefryny na rogówkę każdego oka natychmiast po wstrzyknięciu.Gdy źrenice całkowicie się rozszerzą, umieść mysz na specjalnie zbudowanym stoliku mikroskopowym. Ustaw mikroskop tak, aby miał pełny dostęp do siatkówki. W razie potrzeby wyreguluj okular przez cały proces obrazowania, aby zobaczyć tarczę nerwu wzrokowego i siatkówkę oraz uzyskać obrazy całego obszaru siatkówki, dostosowując i zakrywając wszystkie rogi obwodu.Aby zmierzyć nieszczelność naczynia, podaj 100 mikrolitrów 2% fluoresceiny podskórnie z tyłu szyi i zmień położenie myszy tak, aby siatkówka znajdowała się w środku obrazu na żywo. Ustaw fundoskop na filtr wzbudzenia światła niebieskiego o długości od 465 do 490 nanometrów przed uzyskaniem obrazu każdego z nich po 1,5 i siedmiu minutach od wstrzyknięcia fluorescencyjnego. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, dootrzewnowo podaj zastrzyk przeciwuspokajający w celu powrotu do zdrowia i umieść mysz w klatce na rozgrzanej macie z dostępem do mokrej namoczonej diety z monitorowaniem, aż mysz odzyska przytomność.W celu klinicznej oceny choroby na obrazach należy oprzeć ocenę kliniczną na nasileniu zapalenia tarczy nerwu wzrokowego, mankietu naczyń siatkówki, nacieku tkanki siatkówki i uszkodzenia strukturalnego. Oceń każdy z tych parametrów w skali od jednego do pięciu. Łączna suma jest reprezentatywna dla klinicznej choroby dla całego oka, przy czym maksymalny wynik wynosi 20 punktów na oko.Po obrazowaniu dna oka w celu uzyskania końcowego klinicznego punktu końcowego badania, należy poddać mysz eutanazji. Do analizy histologicznej rozsuń powieki, aby uzyskać dostęp do całego oka, a następnie umieść zakrzywione kleszcze za kulą ziemską, aby uchwycić tkankę łączną oczodołu i nerw wzrokowy i wyłuszczyć oko. Umieść wyłuszczone oko w jednym do pięciu mililitrów 4% aldehydu glutarowego na co najmniej 15 minut przed przeniesieniem narządu do jednego do pięciu mililitrów 10% formaldehydu na co najmniej 24 godziny.Po histologicznym barwieniu tkanek, zgodnie ze standardowymi protokołami, przypisano wyniki w skali od zera do trzech w zależności od poziomu naciekania komórek odpornościowych i stopnia uszkodzenia siatkówki. Zmiany dna oka są klasyfikowane w trakcie progresji choroby jako zmiany zapalne, które obejmują zapalenie tkanki siatkówki oraz naczyń krwionośnych i tarczy wzrokowej oraz uszkodzenie strukturalne siatkówki, a także zmiany histologiczne oparte na naciekających komórkach odpornościowych i upośledzeniach strukturalnych. Te zmiany kliniczne i histopatologiczne mogą być oceniane i oceniane w celu oceny progresji choroby i oceny skuteczności interwencji terapeutycznej.Nietrzymanie naczyń krwionośnych jest również patologiczną cechą modelu i ludzkiego zapalenia błony naczyniowej oka. Jak pokazano w tej analizie, fluoresceina może być używana do wizualizacji przecieku naczyniowego jako kolejny odczyt tego modelu. Dla badaczy ważne jest, aby upewnić się, że emulsja jest przygotowana prawidłowo, bez śladów separacji między roztworami.Należy je dokładnie wymieszać, a produkt końcowy powinien mieć gładką konsystencję. Procedura ta może być łączona z innymi metodami podawania leków oraz z cytometrią do fenotypowania naciekającego populacje komórek odpornościowych siatkówki.

experimental-autoimmune-uveitis-an-intraocular-inflammatory-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje metodę generowania modelu myszy, który naśladuje bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej - infekcję wewnątrzgałkową wynikającą z inwazji bakterii do jamy ciała szklistego oka - poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka. Ten mysi model pomaga badać mechanizm choroby i oceniać terapie dla niej.

Mysi model bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej: metoda generowania bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka myszy

Ten film demonstruje metodę wywoływania zapalenia powierzchni oka i dysfunkcji gruczołów Meiboma w modelu mysim. Stymulacja układu odpornościowego myszy za pomocą immunogenu, a następnie ponowna stymulacja tym samym immunogenem sprzyja zapaleniu powierzchni oka, które powoduje zatkanie wydzielania gruczołów Meiboma przez aggNET wytwarzane przez neutrofile i prowadzi do zespołu suchego oka.

Metoda wywoływania stanu zapalnego powierzchni oka w modelu mysim

Ten film pokazuje indukcję ogólnoustrojowego stanu zapalnego u znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie zapasów antygenu prątkowego z adiuwantem wyzwala uwalnianie cytokin i miejscowy stan zapalny. Naczynia limfatyczne otwierają się, umożliwiając wnikanie komórek odpornościowych do węzłów chłonnych i aktywację limfocytów T, które uwalniają cytokiny prozapalne, prowadząc do rozległego stanu zapalnego.

Podskórne wstrzyknięcie antygenu bakteryjnego w celu wywołania ogólnoustrojowego stanu zapalnego w modelu mysim

Ten film demonstruje metodę generowania mysiego modelu mysiego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Po indukcji PMU przez wstrzyknięcie do ciała szklistego zabitych termicznie Mycobacterium tuberculosis u myszy uprzednio uodpornionej tym samym immunogenem, postęp przewlekłego stanu zapalnego w oku jest analizowany za pomocą obrazowania i badania...

Mysi model prątkowego zapalenia błony naczyniowej oka do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten film demonstruje technikę obrazowania in vivo do wykrywania i ilościowego określania stanu zapalnego oka w mysim modelu poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Technika ta, znana jako optyczna tomografia koherentna (OCT), generuje obrazy przekroju poprzecznego oka o wysokiej rozdzielczości w celu oceny postępu choroby.

Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii do oceny zapalenia błony naczyniowej oka w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

Ten raport opisuje metodę wywoływania przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego suchego oka u szczurów Lewisa poprzez immunizację emulsją ekstraktu z gruczołu łzowego szczura, albuminy jaja kurzego i kompletnego adiuwantu Freunda, a następnie wstrzyknięcie ekstraktu z gruczołu łzowego i albuminy jaja kurzego do otworu podspojówkowego i gruczołów łzowych sześć tygodni później.

Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej

Opisujemy tutaj metodę iniekcji doszklistkowej i późniejszej oceny ilościowej bakterii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Protokół ten można rozszerzyć o pomiar odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz ekspresji genów bakteryjnych i gospodarza.

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Ten protokół opisuje kroki do wywołania Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) u myszy. Ta metoda przedstawia kroki, które pomogą w wytworzeniu niezawodnego i solidnego zapalenia oka w systemie modelu mysiego. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy oczy błony naczyniowej oka i nieobjęte stanem zapalnym inne oczy od pojedynczych zwierząt w celu dalszej oceny za pomocą testów immunologicznych, transkryptomicznych i proteomicznych.

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Poznaj metodę indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka u myszy przy użyciu peptydu IRBP 1-20. Technika umożliwia nieinwazyjne monitorowanie postępu choroby i ocenę skuteczności nowych leków.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Przeglądaj więcej filmów