Name: Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj protokół decelularyzacji mysiego serca i płuc w celu uzyskania szkieletów macierzy pozakomórkowej ECM. Ta metoda umożliwia zachowanie integralności strukturalnej tkanek i otwiera drogę do szczegółowych badań biochemicznych oraz anatomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy prof. Ivanie Novak i dr Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), University of Copenhagen) za udostępnienie mikroskopu. Prace te były wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR i JTE); stypendium doktoranckie Fundacji Lundbeck (R286-2018-621; MR); Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych (2017-03389; CDM); Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj i 190007; CDM); Niemiecka Organizacja Pomocy Chorym na Raka (Deutsche Krebshilfe; RR); oraz Duńskie Towarzystwo Onkologiczne (R204-A12454; RR).

Wszystkie procedury zawarte tutaj zostały sprawdzone i zatwierdzone przez komisję etyczną regulującą medycynę eksperymentalną na Uniwersytecie w Kopenhadze i są zgodne z duńskim i europejskim ustawodawstwem. Aby zademonstrować ten protokół, użyliśmy samic myszy BALB/cJ w wieku 8-12 tygodni i samicy myszy MMTV-PyMT w wieku 11 tygodni.
UWAGA: Unikanie skażenia bakteryjnego rusztowania ECM daje najlepsze wyniki obrazowania i pozwala na długotrwałe przechowywanie próbki. Dlatego ważne jest, aby wszystkie kroki były sterylne. W związku z tym wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne, w tym szewy, mikroszwy, roztwory, rurki, łączniki Luer i cewniki, muszą być sterylne. Powierzchnie, w tym tackę z polistyrenu, należy zdezynfekować 70% etanolem, a perfuzję najlepiej przeprowadzić pod okapem z przepływem laminarnym. Wszystkie zabiegi odbywają się w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.
1. Mikrochirurgia pośmiertna
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą komory CO2.
	<ol>
		<li>Umieść mysz w komorze o pojemności 4 l i zacznij napełniać ją 100% CO2, zaczynając od 0,2 l/min przez 2 min, zwiększając aż do osiągnięcia przepływu 0,8 l/min po 3 min. Mysz powinna stracić przytomność w ciągu pierwszych 2 minut, a następnie oddychanie powinno ustać (zwykle około 5 min, ale przepływ można utrzymać w razie potrzeby). Potwierdź śmierć przed przejściem do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogol klatkę piersiową, brzuch i grzbiet myszy maszynką do strzyżenia włosów i zdezynfekuj 70% etanolem. Golenie znacznie zmniejsza liczbę artefaktów spowodowanych obecnością włosów na próbkach do obrazowania lub analizy biochemicznej.</li>
	<li>Przypnij mysz do styropianowej tacy, wysuwając jej przednie i tylne kończyny, a także głowę i ogon. Umieść go pod mikroskopem mikrochirurgicznym.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek Mayo z prostym wzorem ustal dostęp chirurgiczny z nacięciem skóry biegnącym od okolicy podżuchwowej do dolnej części brzucha i wypreparuj podskórnie, aby odsłonić ścianę klatki piersiowej i otrzewną.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych przetnij mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze wzdłuż szóstej przestrzeni międzyżebrowej po obu stronach ściany klatki piersiowej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek o prostym wzorze przetnij mostek wzdłuż poprzednich nacięć, a następnie zakończ sternotomię, przecinając mostek wzdłuż jego długiej osi, a następnie podnieś i przypnij obie strony ściany klatki piersiowej, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy.</li>
	<li>Za pomocą mikrokleszczyków z okrągłą końcówką (lub mikrokleszczyków Dumonta) wyciąć grasicę i otaczającą ją tkankę tłuszczową, delikatnie ściągając je z przyczepów. To ujawni główne statki.</li>
	<li>Za pomocą kauteryzacji kauteryzuj zstępującą żyłę jamy i za pomocą nożyczek o prostym wzorze przetnij przełyk.</li>
	<li>Za pomocą ostrych mikrokleszczy oddziel żyły ramienno-głowowe i tętnice ramienno-głowowe, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową od leżącej poniżej tkanki, aby ułatwić podwiązanie i kauteryzację.</li>
	<li>Za pomocą uchwytu mikroigłowego, ostrych mikrokleszczyków i szwu 9-0 umieść szwy powyżej pojawienia się tętnicy ramienno-głowowej, lewej tętnicy szyjnej wspólnej i lewej tętnicy podobojczykowej.</li>
	<li>Kauteryzuj żyły ramienno-głowowe.</li>
	<li>Oddziel gruczoły ślinowe podżuchwowe wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić mięśnie szyi i tchawicę. Oddziel mięśnie, aby odsłonić więzadło kości sercowej tarczycy. Za pomocą mikronożyczek otwórz wejście, przecinając więzadło.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik 27 G do tchawicy i delikatnie wciskać, aż tchawica rozgałęzi się do oskrzeli (tj. do momentu napotkania oporu cewnika, a następnie wycofaj się o 3 mm). Uważaj, aby nie zakłócić działania oskrzeli. Za pomocą szwu 6-0 umieść 3 szwy wokół tchawicy, aby zabezpieczyć cewnik.</li>
	<li>Przekrój mysz na wysokości 12. kręgu piersiowego. Aorta zstępująca biegnie do przodu kręgosłupa i powinna być tutaj przecięta wraz z kręgosłupem. Rozsuń dolną połowę.</li>
	<li>Wstecznie cewnikuj aortę i popchnij cewnik, aż dotrze do łuku aorty. Za pomocą szwu 9-0 umieść 4 szwy wokół aorty, zaczynając 5 mm poniżej końcówki cewnika.</li>
</ol>
2. Decelularyzacja
<ol>
	<li>Podłącz mysz do systemu pompy za pomocą silikonowych wężyków i złączy Luer. Perfuzja z wodą dejonizowaną w stężeniu 200 μl/min przez 15 min. Utrzymuj to natężenie przepływu podczas decelularyzacji.</li>
	<li>Zmień środek perfuzyjny na 0,5% deoksycholan sodu (DOC) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzuj przez noc.</li>
	<li>Zmienić środek perfuzyjny na 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzjonować przez 8 godzin.</li>
	<li>Perfuzję z wodą dejonizowaną przez noc, aby zmyć SDS i DOC przez 24 godziny.</li>
	<li>Wyciąć pozbawione komórek serce i płuca, dzieląc ich przyczepy do klatki piersiowej za pomocą zakrzywionych nożyczek i przechowywać w sterylnej krioprobówce z dejonizowaną wodą z 1% (v/v) penicyliną-streptomycyną i 0,3 μM azydkiem sodu w temperaturze 4 °C. Rusztowania ECM mogą być przechowywane przez co najmniej 12 tygodni1. Jeśli rusztowanie będzie używane do analizy biochemicznej (np. spektrometrii mas), należy je zamrozić w ciekłym azocie.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Zaplanuj obrazowanie: określ przeciwciało pierwszorzędowe (lub przeciwciała) i kombinację fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał drugorzędowych, aby pasowały do siebie i pasowały do linii laserowych mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Zablokuj próbkę, zanurzając ją w krioprobówce zawierającej 6% (v/v) surowicy osła - 3% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez noc.</li>
	<li>Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem (lub przeciwciałami) w 3% surowicy osła w PBS przez 24 godziny.</li>
	<li>Prać 5 razy przez 1 godzinę za każdym razem w 0,05% tween 20 w PBS (PBST).</li>
	<li>Inkubować próbkę z fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym (lub przeciwciałami) w 3% surowicy osła w PBS przez 24 godziny.</li>
	<li>Prać 5 razy przez 1 godzinę w 0,05% (PBST). Odczekaj 1 godzinę między każdym praniem.</li>
	<li>Dodać wodę dejonizowaną i przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od bezpośredniego światła. W tym momencie rusztowanie jest gotowe do obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Umieść próbkę w naczyniu ze szklanym dnem i zwilż ją dwiema kropelkami roztworu do przechowywania (PBS lub woda dejonizowana).</li>
	<li>Przygotuj cel. Zalecamy korzystanie z obiektywu do zanurzenia w wodzie.</li>
	<li>Zbadać próbkę za pomocą światła fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przełącz się na sterowanie komputerowe. Włącz lasery i dostosuj intensywność lasera, aperturę otworkową, długości fal detektorów, wzmocnienie, rozdzielczość i zoom. Ustaw liczbę i rozmiar kroku dla stosu z i rozpocznij akwizycję. Zalecamy stosowanie wzbudzenia laserem wielofotonowym w celu zwiększenia penetracji tkanek i zminimalizowania rozpraszania światła, wybielania i uszkodzenia tkanek.</li>
</ol>
5. Barwienie hematoksyliną i eozyną
<ol>
	<li>Wyciąć 1 płat płuca od myszy poddanej eutanazji.</li>
	<li>Umieścić w kriomold o wymiarach 10 mm x 10 mm x 5 mm i przykryć około 500 μl związku OCT.</li>
	<li>Zamrażać na suchym lodzie (-70 °C) i utrzymywać próbkę w tej temperaturze.</li>
	<li>Wytnij jeden pozbawiony komórek płat płuc od przetworzonej myszy zgodnie z krokiem 2.5.</li>
	<li>Umieść w kriofordzie największą powierzchnią do dołu i przykryj ją związkiem OCT, jak określono w kroku 5.2.</li>
	<li>Zamrozić na suchym lodzie (-70°C) i utrzymać próbkę w tej temperaturze do czasu, gdy będzie to wymagane. Próbka może być przechowywana przez co najmniej 12 tygodni.</li>
	<li>Zamrożone bloki tkanek należy rozciąć w temperaturze -20 °C w kriostacie o grubości 5 μm, a następnie umieścić skrawki na szkiełkach samoprzylepnych i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Weź szkiełka do temperatury pokojowej, aż wyschną na powietrzu (około 20 min).</li>
	<li>Krótko zanurzyć w PBS i utrwalić, zanurzając szkiełka w 4% paraformaldehydzie w PBS na 15 minut. Umyć raz w PBS przez 5 minut, a następnie dwa razy w wodzie destylowanej przez 5 minut.</li>
	<li>Zanurzyć w roztworze hematoksyliny Mayera na 10 minut. Czas ten można zoptymalizować w zależności od źródła tkanki i przygotowania plamy.</li>
	<li>Myć w słoiku Coplin pod bieżącą wodą destylowaną przez 10 minut.</li>
	<li>Zanurzyć w roztworze eozyny na 7 minut. Czas ten można zoptymalizować w zależności od źródła tkanki i przygotowania plamy.</li>
	<li>Zanurz w 50% etanolu, aby usunąć nadmiar eozyny i odwodnić, zanurzając na krótko w 70% etanolu oraz w 96% i 100% etanolu na 30 sekund. Zanurz kilkakrotnie w ksylenie.</li>
	<li>Nałóż kilka kropli podłoża montażowego DPX i umieść szklane szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc pod kapturem chemicznym.</li>
	<li>Skanowanie slajdów w skanerze slajdów.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Techniki decelularyzacji oparte na mieszaniu tkanek zmieniają strukturę ECM, co czyni je nieodpowiednimi do analizy struktury ECM4. Decelularyzacja perfuzyjna, przy użyciu drogi anatomicznej, takiej jak aorta tchawicy, pozwala dotrzeć do łożyska naczyń włosowatych lub końcowych pęcherzyków płucnych i ułatwia dostarczanie środków decelularyzujących w całym narządzie. Stosowanie detergentów obojczojonowych, anionowych i niejonowych do decelularyzacji tkanek jest zgłaszane <su...

ECM to trójwymiarowa sieć złożona z białek i glikanów, która mieści wszystkie komórki w organizmie wielokomórkowym, nadając narządom ich kształt i regulując zachowanie komórek przez całe życie1. Od zapłodnienia komórki jajowej budują i przebudowują ECM, a z kolei są przez niego ściśle kontrolowane. Celem tego protokołu jest otwarcie drogi do analizy i mapowania ECM myszy, ponieważ myszy są najczęściej używanym organizmem modelowym w patofizjologii ssaków.
Rozwój tej metody był spowodowany potrzebą scharakteryzowania i wyizolowania natywnego ECM2. Ponieważ guzy nie mają odpowiedniego unaczynienia anatomicznego, a myszy są stosunkowo małymi organizmami, zabiegi mikrochirurgiczne zostały zaprojektowane tak, aby wstecznie cewnikować aortę, jednocześnie izolując krążenie głównego naczynia prowadzącego do guza (np. Żył płucnych), skupiając w ten sposób przepływ odczynnika i umożliwiając decelularyzację guza. Ta metoda wytwarza rusztowania ECM o konserwatywnej strukturze2, które mogą być barwione immunologicznie i obrazowane, co pozwala na mapowanie struktury ECM w szczegółach submikronowych. Aby przeprowadzić ten protokół, konieczne jest nabycie umiejętności chirurgicznych i mikrochirurgicznych (rozwarstwienie, mikroszycie i cewnikowanie), które mogą stanowić potencjalne ograniczenie w jego stosowaniu. Zgodnie z naszą wiedzą, metoda ta reprezentuje najnowocześniejsze podejście do analizy natywnego obrazowania struktury ECM2,3.

<table><tbody><tr><td>MICROSURGERY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 szew, igła o przekroju trójkątnym (Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 mikroszew (Safil)</td>B Kleszczyki <td>Braun</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>Adson</td><td>Narzędzia Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson z zębami</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikroigłowy Castroviejo</td><td>Fine Science Tools</td><td>nr 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 komora wentylacyjna do eutanazji myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana (Milli-Q IQ 7000, system ultraczystej wody laboratoryjnej)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa tacka polistyrenowa (~30 & razy; 50 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny (Greenough, z dwuramienną gęsią szyją)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna mikroszpatułka</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze Dumont (dwa)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze Dumont z 45&deg; końcówki (dwa)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów</td><td>Oster</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły Halsey (ze szczękami z węglika wolframu)</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik dożylny o rozmiarze 24 (Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik dożylny o rozmiarze 26 (Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR+DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki majonezowe (twarde, proste)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze z końcówkami z pierścieniami (dwa)</td><td>Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki mikrosprężynowe (Vannas, zakrzywione)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Minicutter</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Molt Periostotome</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>Igły (rozmiar 27; Microlance)</td><td>BD</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy (sterylny) lub serwetka chirurgiczna&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki ząbkowane (CeramaCut, proste)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka (Freer-Yasargil)</td>Strzykawki <td>Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021001</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki (10 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do ścięgien (Walton)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14077-09</td><td></td></tr><tr><td>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 oślica anty-świnka morska IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 osioł anty-królik IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina frakcji bydlęcej V, gatunku standardowego, liofilizowana)&nbsp;</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne Collagen IV (RRID: AB_2276457)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>Gospodarz: królik</td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4, 10&razy;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Gospodarz: koza</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne Periostin (miły prezent od Manuela Kocha. RRID:AB2801621)</td><td></td><td></td><td>Gospodarz: świnka morska</td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy z ostrzem nr 11 (szt. 10)</td><td>VWR</td><td>233-5364)</td><td></td></tr><tr><td>Surowica (normalna surowica osła)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Detektory (detektor hybrydowy (model Leica, HyD S) i lampy fotopowielacza (PMT; )&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Fluorescencyjne źródło światła&nbsp;</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mikroskop (odwrócony mikroskop wielofotonowy)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Obiektyw (lambda blue, 20&times;, 0,70 apertura numeryczna (NA) IMM UV)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; Dwufotonowy Ti&ndash; laser szafirowy (fizyka widm, model Mai Tai DeepSee)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Laser światła białego (WLL)&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DECELLULARIZATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol (alkohol bezwzględny 99,9%); alkohol bezwzględny należy dostosować do 70% (vol/vol) przy użyciu wody dejonizowanej&nbsp;</td><td>Śliwka</td><td>1680766</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana (Milli-Q IQ 7000, system ultraczystej wody laboratoryjnej)&nbsp;</td><td>Złączki</td><td></td> męskie Merck ZIQ7000T0 <td></td></tr><tr><td>Luer-to-tubing (1/8 cala)</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4, 10&x;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 70011044</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna (z 12 kanałami)</td><td>Ole Dich</td><td>110AC(R)20G75</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa (z średnicą wewnętrzną 2 mm i średnicą zewnętrzną 4 mm)</td><td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu (DOC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>H& E BARWIENIE</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15434389</td><td></td></tr><tr><td>96%</td><td>Etanol Śliwka</td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Śliwka</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (24x50mm; 1000 szt)</td><td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 szt)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX medium montażowe</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y roztwór alkoholowy 0,5%</td> <td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>Pióro mikrotomu ze stali nierdzewnej, C35 (50 szt)</td><td>Pfm medyczne</td><td>207500003</td><td></td></tr><tr><td> Prowadnice Fisherbrand Superfrost Plus (25 x 75 mm; 144 szt)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td>6319483</tr><tr><td>Mayers hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>VWR</td><td>361603E Skaner slajdów</td><td></td></tr><tr><td>(Nanozoomer)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Prezentujemy tutaj protokół decelularyzacji serca i płuc myszy. Wytwarza strukturalne rusztowania ECM, które można wykorzystać do analizy topologii i składu ECM. Opiera się na procedurze mikrochirurgicznej mającej na celu cewnikowanie tchawicy i aorty myszy poddanej eutanazji w celu perfuzji serca i płuc środkami decelularycznymi. Pozbawiony komórek kompleks krążeniowo-oddechowy może być następnie barwiony immunologicznie, aby ujawnić lokalizację strukturalnych białek ECM. Całą procedurę można wykonać w ciągu 4 dni.
Rusztowania ECM wynikające z tego protokołu są wolne od zniekształceń wymiarowych. Brak komórek umożliwia badanie strukturalne struktur ECM do rozdzielczości submikronowej w 3D. Protokół ten można zastosować do zdrowych i chorych tkanek myszy w wieku 4 tygodni, w tym mysich modeli zwłóknienia i raka, otwierając drogę do określenia przebudowy ECM związanej z chorobą krążeniowo-oddechową.

Dekomórkowanie krążeniowo-oddechowe 
Po pomyślnym przeprowadzeniu protokołu serce i płuca, a także tkanki przyległe, takie jak łuk aorty, będą wolne od komórek. Dekomórkowanie można potwierdzić za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (Rysunek 1) rusztowań ECM, wykazującego usunięcie jąder komórkowych w porównaniu z tkanką natywną. Rusztowania te zachowują wymiary świeżych organów, a ich nierozpuszczalna struktura ECM pozostaje nienarusz...

Ten protokół ma na celu decelularyzację serca i płuc myszy. Powstałe w ten sposób rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) mogą być barwione immunologicznie i obrazowane w celu zmapowania lokalizacji i topologii ich elementów.

Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Ten protokół jest bramą do macierzy zewnątrzkomórkowej. Jest to złożoność i struktura w skali submikronowej. Tak więc kluczową zaletą tej metody jest to, że umożliwia uzyskanie macierzy zewnątrzkomórkowej, która zachowuje swoją integralność strukturalną, otwierając w ten sposób drogę do analizy biochemicznej i anatomicznej.Procedurę zademonstrują Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten i Maria Rafaeva, obecnie pracująca w moim laboratorium oraz Chris Madsen, który był w moim laboratorium i kontynuował pracę na Uniwersytecie w Lund. Zacznij od ogolenia klatki piersiowej, brzucha i grzbietu myszy poddanej eutanazji za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Zdezynfekuj obszar 70% etanolem.Następnie przypnij mysz do styropianowej tacy, wysuwając jej cztery końce tylnych kończyn, a także głowę i ogon. Umieść go pod mikroskopem mikrochirurgicznym. Za pomocą nożyczek Mayo z prostym wzorem wykonaj nacięcie skórne biegnące od okolicy podżuchwowej do dolnej części brzucha i wypreparuj podskórnie, aby odsłonić ścianę klatki piersiowej i otrzewną.Następnie za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych przeciąć mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze wzdłuż szóstej przestrzeni międzyżebrowej po obu stronach ściany klatki piersiowej. Przetnij mostek wzdłuż poprzednich nacięć nożyczkami o prostym wzorze. Następnie zakończ sternotomię, przecinając mostek wzdłuż jego długiej osi.Podnieś i przygwoźdź obie strony ściany klatki piersiowej, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy. Użyj mikrokleszczyków z okrągłymi końcówkami, aby wyciąć grasicę i otaczającą ją tkankę tłuszczową, delikatnie ściągając je z przyczepów. I przetnij przełyk mikronożyczkami.Oddziel żyły ramienno-głowowe i tętnicę ramienno-głowową ostrymi mikrokleszkami. Następnie oddziel lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową od leżącej poniżej tkanki, aby ułatwić podwiązanie i kauteryzację. Użyj uchwytu mikroigłowego i ostrych mikrokleszczyków oraz szwu dziewięciokrotnego, aby umieścić szwy powyżej pojawienia się lewej tętnicy szyjnej ramienno-głowowej i lewej tętnicy podobojczykowej, kauteryzować żyły ramienno-głowowe.Za pomocą mikronożyczek otwórz wejście, przecinając więzadło. Wprowadzić cewnik o rozmiarze 27 do tchawicy i delikatnie wciskać, aż tchawica rozgałęzi się do oskrzeli, uważając, aby nie naruszyć oskrzeli. Za pomocą szewu sześć O umieść trzy szwy wokół tchawicy, aby zabezpieczyć cewnik.Przekrój mysz na wysokości 12. kręgu piersiowego, aorta zstępująca biegnie do przodu kręgosłupa i powinna być tutaj podzielona wraz z kręgosłupem. Wstecznie cewnikuj aortę i wepchnij cewnik, aż dotrze do łuku aorty. Za pomocą szwu umieść cztery szwy wokół aorty, zaczynając pięć milimetrów poniżej końcówki cewnika.Podłącz mysz do systemu pompowania za pomocą silikonowej rurki i dolnych złączy. Perfuzja z wodą dejonizowaną w ilości 200 mikrolitrów na minutę przez 15 minut. Następnie zmień środek perfuzyjny na 0,5% DOC, rozcieńcz w wodzie dejonizowanej i perfuzuj przez noc.Następnego dnia zmień środek perfuzyjny na 0,1% SDS rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzuj przez osiem godzin. Następnie perfuzjuj wodą dejonizowaną przez 24 godziny, aby zmyć SDS i DOC. Wytnij pozbawione komórek serce i płuca, dzieląc ich przyczepy na klatkę piersiową.Przechowuj tkankę w sterylnej probówce kriogenicznej w dejonizowanej wodzie z 1% penicyliną, streptomycyną i 0,3 mikromolowym azydkiem sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić barwienie immunologiczne, zablokuj próbkę, inkubując ją w krioprobówce zawierającej 6% surowicy osła i 3% BSA przez noc. Następnie inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w 3% surowicy osła w PBS przez 24 godziny.Po inkubacji przemyć próbkę pięć razy w PBST przez jedną godzinę na przemycie. Inkubować próbkę z fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym w 3% surowicy osła w PBS przez 24 godziny. Następnie powtórz pranie w PBST.Dodaj zjonizowaną wodę i przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z dala od bezpośredniego światła. Aby zobrazować próbkę, umieść ją w naczyniu ze szklanym dnem i nawilż dwiema kropelkami roztworu do przechowywania. Ustaw obiektyw i sprawdź próbkę za pomocą światła fluorescencyjnego.Przełącz się na sterowanie komputerowe, włącz lasery i dostosuj intensywność lasera, aperturę otworkową, długość fali detektorów, wzmocnienie, rozdzielczość i zoom. Ustaw liczbę i rozmiar kroku dla stosu Z, a następnie rozpocznij akwizycję. Wytnij jeden płat płuca od myszy poddanej eutanazji i umieść go w krioformie o wymiarach 10 na 10 na pięć milimetrów.Przykryj go około 500 milowymi mikrolitrami związku OCT i zamroź na suchym lodzie. Utrzymać próbkę w tej temperaturze. Wytnij jeden pozbawiony komórek płat płuc z przetworzonej myszy, umieść go w formie kriogenicznej największą powierzchnią w dół i przykryj związkiem OCT.Zawiesić próbkę na suchym lodzie i utrzymywać ją w tej temperaturze do czasu, gdy będzie to wymagane w innym przypadku. Próbka może być przechowywana przez co najmniej 12 tygodni. Użyj kriostatu, aby pokroić zamrożone bloki tkanek na pięć mikrometrowych odcinków w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.I umieść sekcje na samoprzylepnych szkiełkach szkiełkowych. Przenieś szkiełka do temperatury pokojowej, aż wyschną powietrzem. Zanurz na krótko szkiełka w PBS, a następnie 4% paraformaldehydu w PBS na 15 minut.Umyj raz w PBS, a następnie dwa razy w wodzie destylowanej przez pięć minut na pranie. Zanurz szkiełka w roztworze hematoksyliny Myera na 10 minut. Następnie umyj szkiełka w słoiku Copeland pod bieżącą wodą destylowaną przez 10 minut i zanurz w roztworze eozyny na siedem minut.Zanurz kilkakrotnie w ksylenie. Nałóż kilka kropel podłoża montażowego DPX i umieść szklane szkiełko nakrywkowe. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc pod kapturem chemicznym, a następnie zeskanuj je w skanerze do slajdów.Po pomyślnym zakończeniu protokołu serce i płuca oraz tkanka NX będą wolne od komórek. Decelularyzacja może być zwalidowana przez barwienie rusztowań ECM eozyną hematoksyliną. Rusztowania zachowują wymiary świeżych narządów, a ich nierozerwalna struktura ECM jest nienaruszona.Rusztowania ECM wykazywały zwiększoną przepuszczalność i przepuszczalność światła. Korzystanie z tego protokołu z zmotoryzowanym stolikiem mikroskopowym pozwala na trójwymiarowe obrazowanie kafelkowe całych próbek z mocowaniem w rozdzielczości submikronowej. Konieczne jest unikanie przepływu w kierunku narządów zainteresowania, aby osiągnąć całkowicie jednolitą deceluneryzację.Mikrochirurgiczne rozwarstwienie i podwiązanie naczyń musi być skuteczne. A jednocześnie szanuj tkanki docelowe, aby utrzymać natywną strukturę VCM. Po tej procedurze rusztowania zostaną wzbogacone o strukturalne białka ECM i będą mogły być wykorzystywane do spektrometrii mas lub inżynierii tkankowej.Technika ta toruje drogę do mapowania macierzy zewnątrzkomórkowej w wysokiej rozdzielczości.

decellularization-of-the-murine-cardiopulmonary-complex

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje metodę wytwarzania decelularnych rusztowań z matrycy zewnątrzkomórkowej lub ECM poprzez zastosowanie perfuzji detergentów przez układ krwionośny. Strukturalne rusztowania ECM mogą być następnie wykorzystane do analizy przebudowy ECM związanej z chorobą krążeniowo-oddechową.

Decelularyzacja kompleksu krążeniowo-oddechowego: technika decelularyzacji serca i płuc na podstawie modelu mysiego

Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.

Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

W tych badaniach podajemy metodologię nowatorskich, noworodkowych, mysich rusztowań serca do wykorzystania w badaniach regeneracyjnych.

Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Macierz zewnątrzkomórkowa serca (ECM) to złożona sieć molekuł, które zarządzają kluczowymi procesami w tkankach i organach, jednocześnie znosząc fizjologiczną przebudowę przez całe życie. Standaryzowana decelularyzacja serc płodów i dorosłych pozwala na porównawcze badania eksperymentalne obu tkanek w kontekście 3D poprzez uchwycenie natywnej architektury i właściwości biomechanicznych.

Porównywalna decelularyzacja eksplantatów tkanek serca płodu i dorosłych jako platformy podobne do 3D do badań in vitro

Ta metoda umożliwia decelularyzację złożonego stałego organu przy użyciu prostego protokołu opartego na szoku osmotycznym i perfuzji jonowego detergentu przy minimalnym naruszeniu macierzy narządu. Obejmuje on nowatorską technikę decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z monitorowaniem w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu i odpływu zanieczyszczeń komórkowych.

Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

Klasycznie, wsierdzie zarodka zarodka zastawki myszy zostało przeanalizowane za pomocą przekrojów poprzecznych, czołowych lub strzałkowych. Nasze nowatorskie podejście do dwuwymiarowego obrazowania wsierdzia en face w regionach walwugennych umożliwia analizę polaryzacji planarnej i rearanżacji komórek wsierdzia podczas rozwoju zastawki.

En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Poznaj protokół decelularyzacji mysiego serca i płuc w celu uzyskania szkieletów macierzy pozakomórkowej ECM. Ta metoda umożliwia zachowanie integralności strukturalnej tkanek i otwiera drogę do szczegółowych badań biochemicznych oraz anatomicznych.

Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego

Przeglądaj więcej filmów