Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9
3 listopada 2020
Tutaj udostępniamy szczegółowy, krok po kroku protokół inżynierii genomowej opartej na CRISPR/Cas9 pierwotnych ludzkich limfocytów B do nokautowania genów (KO) i knock-in (KI) w celu zbadania biologicznych funkcji genów w komórkach B i rozwoju terapii komórek B.
Protokół ten pozwala naukowcom precyzyjnie wyeliminować gen w komórkach B w celu zbadania skutków utraty funkcji tego genu lub wstawienia genu trans w celu uzyskania stabilnej ekspresji genu trans, który można wykorzystać do celów badawczych lub terapeutycznych. Główną zaletą tej metody jest to, że zapewnia uniwersalną platformę, która umożliwia łatwą i precyzyjną inżynierię komórek B o wysokiej wydajności. Metoda ta może być stosowana do inżynierii limfocytów B w celu ekspresji rekombinowanych przeciwciał lub enzymów, a następnie przenoszenia tych komórek B w celu leczenia infekcji lub enzymopatii.
Na początek rozmrozić komórki B w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Czekając, przenieś dwa mililitry wstępnie podgrzanego FBS do sterylnej, 15-mililitrowej stożkowej probówki. Gdy limfocyty B zostaną całkowicie rozmrożone, natychmiast dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego FBS, kroplami, do próbki.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Delikatnie odpipetować w celu ponownego zawieszenia próbki i przenieść całą objętość, kroplami, do stożkowej probówki zawierającej dwa mililitry wstępnie podgrzanego FBS. Doprowadź objętość do 15 mililitrów za pomocą sterylnego PBS, a następnie zakryj probówkę i delikatnie odwróć ją dwa do trzech razy.
Odwirować próbkę o sile 400 razy G przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad jednym mililitrem wstępnie zrównoważonej pożywki do rozprężania komórek B i policzyć komórki. Całkowita liczba komórek powinna wynosić około 10 do siódmych komórek.
Przenieść komórki do kolby zawierającej 20 mililitrów wstępnie zbalansowanego podłoża do ekspandowania komórek B. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić około pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr. Inkubować kolbę pionowo w inkubatorze do hodowli tkankowych.
Przygotować substrat transfekujący CRISPR/Cas9, mieszając jeden mikrogram chemicznie zmodyfikowanego sgRNA z 1,5 mikrograma mRNA jądra jądra Streptococcus pyogenes Cas9 na reakcję transfekcji. W celu kontroli dodaj jeden mikrolitr buforu TE zamiast sgRNA do 0,2-mililitrowej probówki z ośmioma probówkami. Włącz elektroporator i przygotuj odczynniki do infekcji jądrowej.
Policz i przenieś 1 milion komórek B na reakcję transfekcji do sterylnej stożkowej probówki. Doprowadzić objętość do 15 mililitrów za pomocą sterylnego PBS i odwirować w temperaturze 400 razy G przez pięć minut. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach sterylnego PBS i odwirować w temperaturze 400 razy G przez pięć minut, a następnie całkowicie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj 0,5 mikrograma chemicznie zmodyfikowanego mRNA GFP na 1 milion komórek B do osadu komórkowego. Zawiesić osad z 20 mikrolitrami odczynnika do transfekcji komórek pierwotnych na 1 milion komórek B i delikatnie wymieszać, pipetując pięć do sześciu razy.
Przenieś 20,5 mikrolitra na reakcję transfekcji do 0,2-mililitrowych probówek zawierających odczynnik CRISPR/Cas9. Pipetuj raz w górę i w dół, aby wymieszać i przenieść całą objętość do kuwety transfekcyjnej. Nakręć i delikatnie postukaj kuwetą o ławkę, aby upewnić się, że płyn zakrywa dno kuwety.
Użyj protokołu ludzkiej pierwotnej komórki B na elektroporatorze do transfekcji. Odstaw elektroporowane ogniwa w kuwecie w temperaturze pokojowej na 15 minut. Następnie przenieś 80 mikrolitrów wstępnie zbalansowanego podłoża do ekspandowania komórek B do reakcji transfekcji w kuwecie.
Umieścić kuwetę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 30 minut. Delikatnie przetrzeć kilka razy głowicę rurową, aby wymieszać i przenieść całą objętość próbki z kuwety do odpowiedniego dołka 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej jeden mililitr pożywki do ekspandowania komórek B. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić 1 milion komórek na mililitr.
Przeprowadzając eksperyment knock-in, przenieś rekombinowany wektor wirusowy typu szóstego związany z adeno przy 500 000 wielokrotności infekcji do odpowiedniej studzienki zawierającej elektroporowane komórki. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy wilgotności. W eksperymencie z nokautem liczba komórek B wykazała ponad 80% żywotnych komórek z niewielkim zmniejszeniem odzyskiwania komórek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i w próbkach z nokautem CD19 po 24 godzinach od elektroporacji.
Limfocyty B pobrano w piątym dniu po transfekcji do cytometrii przepływowej i analizy pływów. Reprezentatywne wykresy rozrzutu próbek kontrolnych i nokautujących wykazały odpowiednio 14 i 95% komórek ujemnych CD19, wykazując znaczne zmniejszenie ekspresji CD19 w próbkach nokautujących. Chromatogramy sekwencjonowania genomu wykazały podwójne piki w limfocytach B z nokautem CD19, co wskazuje na insercję lub delecje nukleotydów po dwuniciowych przerwach, w których pośredniczył CRISPR/Cas9.
Analiza indel chromatografów próbek z nokautem wykazała wysoki procent tworzenia się indel w locus CD19, co jest zgodne z procentową utratą białka CD19 wykrytą za pomocą cytometrii przepływowej. Limfocyty B z eksperymentu knock-in zostały zebrane w 12 dniu, po inżynierii. Wykresy rozrzutu wykazały 64% komórek dodatnich EGFP w próbce, która otrzymała rekombinowany wektor wirusowy typu szóstego związany z adeno, wraz z RNP, podczas gdy brak lub minimalny dodatni wynik EGFP zaobserwowano odpowiednio w próbkach kontrolnych i tylko wektorowych.
Amplifikacja PCR ze złączem wykazała amplikony 1,5 kilopary zasad w próbce knock-in i nie zaobserwowano produktu PCR ani w próbce kontrolnej, ani tylko wektorowej. Zliczanie komórek wykazało, że proces inżynieryjny wpływa na regenerację komórek w próbce knock-in bardziej niż w próbkach kontrolnych lub próbkach zawierających tylko wektory. Jednak wszystkie próbki szybko odbiły się w ciągu trzech dni po inżynierii.
Procedura ta może być również wykorzystana do wprowadzenia agentów edytora zasad w celu zmiany pojedynczych par zasad w celu wywołania lub skorygowania mutacji jednopunktowych w genomie komórek B. Może być również stosowany do wprowadzania przedwczesnych kodonów stop lub do zmiany miejsc splicingu, co pozwala na wielokrotne nokautowanie genów bez ryzyka translokacji chromosomowych. Zanim ta technika została opracowana, inżynieria ludzkich limfocytów B wymagała zastosowania innych, bardziej wymagających podejść inżynierii genetycznej.
Ta technika jest łatwiejszą, tańszą i szybszą alternatywą. Może być również potencjalnie wykorzystany do syntezy produktów terapii komórkowej do użytku klinicznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół inżynierii genomu opartej na systemie CRISPR/Cas9 w pierwotnych ludzkich limfocytach B, umożliwiający knockout oraz knock-in genów w celu badania funkcji genów i opracowywania terapii komórkami B.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Genomika
- Biologia komórki
- Opracowywanie terapii
Wstęp
- Znaczenie badania funkcji genów w limfocytach B
- Technologia CRISPR/Cas9 umożliwiająca precyzyjne edycje
- Potencjalne zastosowania w chorobach zakaźnych i enzymopatiach
Zastosowane metody
- Transfekcja CRISPR/Cas9 pierwotnych limfocytów B
- Pierwotne ludzkie limfocyty B jako model biologiczny
- Elektroporacja w celu dostarczenia narzędzi do edycji genów
Główne wyniki
- Skuteczny nokaut genu CD19 z redukcją ekspresji o ponad 95%
- Wysoki odsetek powstawania indeli w locus CD19 potwierdzony sekwencjonowaniem genomicznym
- Możliwość wprowadzania transgenów i edycji par zasad na potrzeby badań funkcjonalnych
Wnioski
- Niniejszy protokół skutecznie usprawnia badania nad biologią i terapią limfocytów B.
- Stanowi on solidną platformę do edycji genów, co ma istotne znaczenie dla badań medycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia precyzyjną edycję genomu pierwotnych ludzkich limfocytów B z wykorzystaniem układu CRISPR/Cas9, co wspiera walidację celów oraz ekspresję białek terapeutycznych. Stanowi on skalowalną platformę do opracowywania terapii opartych na limfocytach B w leczeniu chorób zakaźnych i enzymopatii. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad funkcją genów i minimalizuje ryzyko w procesie wdrażania do praktyki klinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę efektów utraty funkcji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach B.
- Wartość operacyjna: Wspiera wydajny knockout genów endogennych w celu wyjaśnienia ścieżek i mechanizmów biologicznych.
- Wartość strategiczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka związanego z celami terapeutycznymi poprzez walidację niezbędności genów w modelu komórek odpornościowych istotnym dla danej choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zmodyfikowanych limfocytów B ze stabilną ekspresją transgenu, co zapewnia spójne wyniki analiz funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia skalowalną produkcję rekombinowanych przeciwciał lub enzymów do zastosowań w badaniach przesiewowych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza odnawialny system komórkowy do opracowywania testów ukierunkowanych na humoralne odpowiedzi immunologiczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera przedkliniczną ocenę terapeutyków skierowanych przeciwko limfocytom B poprzez stabilną integrację i ekspresję transgenu.
- Wartość operacyjna: Wykazuje kinetykę regeneracji po inżynierii genetycznej, co pozwala na określenie harmonogramów dawkowania i produkcji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia postęp z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez powiązanie edycji genów z efektami funkcjonalnymi w klinicznie istotnym typie komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje wczesne etapy odkrywania leków w celu walidacji celu, przechodzi do identyfikacji związku wiodącego poprzez ekspresję transgenu oraz wspiera prace przedkliniczne za pomocą funkcjonalnej inżynierii limfocytów B.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez poprzez knockout wybranych genów w pierwotnych ludzkich limfocytach B.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych, ekspandowalnych populacji limfocytów B do spójnej oceny związków lub antygenów.
- Analityka: Dostarcza danych ilościowych, w tym wyniki cytometrii przepływowej, sekwencjonowania genomicznego oraz PCR złączy w celu walidacji edycji.
- Badania translacyjne: Łączy edycję genów z potencjałem terapeutycznym poprzez ekspresję rekombinowanych przeciwciał lub enzymów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnej edycji genów w wielu celach w ramach terapii limfocytami B.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Wysoka wydajność edycji z ponad 95% wskaźnikiem knockoutu CD19 i 64% wskaźnikiem knock-in, co umożliwia wiarygodne badania mechanistyczne.
- Wartość operacyjna: Dostarczanie oparte na elektroporacji zapewnia powtarzalność i skalowalność w reakcjach transfekcji.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza zależność od złożonych podejść inżynierii genetycznej, skracając czas i obniżając koszty rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez dostarczenie funkcjonalnych danych na temat niezbędności genów i wydajności białek terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z pierwotnymi komórkami, elektroporacji oraz przygotowywania odczynników CRISPR/Cas9.
- Zależne od dostępu do elektroporatorów, odczynników do transfekcji oraz infrastruktury do produkcji wektorów rAAV.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów izolacji, ekspansji i równoważenia pożywek dla limfocytów B w obrębie zespołów.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji w przypadku różnych genów docelowych lub kaset transgenowych w pierwotnych limfocytach B.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienną przeżywalność komórek po inżynierii, choć próbki zazwyczaj regenerują się w ciągu trzech dni.
