Name: Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj inżynierię genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia precyzyjne wyciszanie genów i wprowadzanie transgenów z wysoką wydajnością, wspierając badania nad biologią komórek B oraz rozwój terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Children's Cancer Research Fund (CCRF) i NIH R01 AI146009 dla B.S.M.

Próbki leukaferezy od zdrowych dawców zostały pobrane z lokalnego banku krwi. Wszystkie opisane tutaj eksperymenty zostały uznane za zwolnione z badań przez Institutional Review Board (IRB) i zostały zatwierdzone przez Institutional Biosafety Committee (IBC) na University of Minnesota.
UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z uniwersalnymi środkami ostrożności dla patogenów przenoszonych przez krew, przy użyciu sterylnych/aseptycznych technik i odpowiedniego sprzętu do poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
1. Przygotuj suplementy do pożywki do ekspansji komórek B
<ol>
	<li>Oligonukleotyd CpG należy rozpuścić w stężeniu 1 mg/ml.</li>
	<li>Ligand CD40 (CD40L) należy rozpuścić do stężenia 100 μg/ml.</li>
	<li>Rozpuścić rekombinowaną ludzką IL-10 (rhIL-10) do stężenia 50 μg/ml.</li>
	<li>Rozpuść rekombinowaną ludzką IL-15 (rhIL-15) do stężenia 10 μg/ml. 
	UWAGA: Każdy suplement należy przechowywać w małych porcjach w temperaturze od -20 °C do -80 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Przygotuj podłoże podstawowe
<ol>
	<li>Połącz pożywkę bazową komórek B z 5% (v/v) suplementem pożywki do ekspansji komórek odpornościowych in vitro (np. CTS Immune Cell SR) oraz 1% (v/v) penicyliną i streptomycyną.</li>
	<li>Przefiltruj i wysterylizuj podłoże podstawowe za pomocą adaptera filtra 0,22 μm do wysterylizowanej butelki.</li>
	<li>Podłoże podstawowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
</ol>
3. Przygotuj podłoże do ekspandowania komórek B
<ol>
	<li>Przenieść wymaganą ilość podłoża podstawowego do sterylnego pojemnika w celu hodowli limfocytów B w stężeniu 5 × 105 komórek/ml.</li>
	<li>Uzupełnij podłoże podstawowe o 1 μg/ml CpG, 100 ng/ml CD40L, 50 ng/ml rhIL-10 i 10 ng/ml rhIL-15.</li>
	<li>Przefiltruj pożywkę rozszerzającą komórkę B za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Pożywkę do ekspandowania komórek B w inkubatorze do hodowli tkankowych należy równoważyć wilgotnością w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 30 minut przed użyciem. 
	UWAGA: Przygotuj świeżą pożywkę do ekspandowania komórek B do użycia przez jeden dzień. Nie należy przygotowywać pożywki ekspansywnej komórek B do użycia przez wiele dni. Ta receptura pożywki zachęca do proliferacji komórek B pamięci i aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek B.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie i ekspansja ludzkich komórek B
UWAGA: Dodaj 99–100% alkoholu izopropylowego do pojemnika do zamrażania o kontrolowanej temperaturze, postępując zgodnie z instrukcją producenta, i schładzaj pojemnik do zamrażania w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem kroku 4.1.
<ol>
	<li>Wyizolować PBMC z próbki leukaforezy
	<ol>
		<li>Przenieś próbkę leukaforezy (około 8–10 ml) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Zwiększyć objętość do 35 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym 1x fosforanem (PBS).</li>
		<li>Ostrożnie ułóż 35 ml próbki leukaforezy na 15 ml podłoża o gradiencie gęstości.</li>
		<li>Wirować przy 500 × g przez 25 minut bez hamowania, usunąć warstwę osocza bez naruszania kożucha (warstwa PBMC), zebrać PBMC z granicy faz i przenieść do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Podnieś PBMC do 50 ml za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Wirować przy 500 × g przez 5 minut bez hamulca. Usunąć supernatant bez naruszania osadu PBMC, który może mieć czerwony kolor.</li>
		<li>Dodać 7 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu, pipetować 3 razy, aby dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 minuty.</li>
		<li>Zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Wirować przy 400 × g przez 5 minut z hamulcem o niskim oporowym. Usunąć supernatant bez naruszania osadu. Granulka powinna wyglądać na różowawą lub białą. 
		UWAGA: Aby kontynuować hodowlę świeżo wyizolowanych limfocytów B, przygotuj pożywkę do ekspandowania komórek B przed rozpoczęciem izolacji komórek B (krok 4.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek B z PBMC przy użyciu zestawu do izolacji ludzkich pierwotnych komórek B
	<ol>
		<li>Zawiesić PBMC w buforze izolacyjnym do stężenia 5 × 107 komórek/mL. 
		UWAGA: Jeśli całkowita liczba PBMC jest mniejsza niż 5 × 107 komórek, zmniejsz objętość bufora izolacyjnego, aby utrzymać 5 × 107 komórek/ml. Minimalne i maksymalne objętości zawiesiny komórek wynoszą odpowiednio 0,25 ml i 8 ml.</li>
		<li>Przenieś do 8 ml (5 × 107 komórek/ml) do sterylnej, polipropylenowej probówki z okrągłym dnem z nakrętką.</li>
		<li>Dodaj 50 μl/ml Cocktail Enhancer do PBMCs.</li>
		<li>Dodaj 50 μl/ml koktajlu izolacyjnego do PBMC, zakryj probówkę i odwróć 2-3 razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut; w 4 minucie inkubacji wirować mikrokulki magnetyczne przez co najmniej 30 s.</li>
		<li>Przenieś 50 μl mikrogranulek magnetycznych na 1 ml PBMC, zakryj probówkę i odwróć 2-3 razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Uzupełnij do 10 ml buforem izolacyjnym i delikatnie pipetuj w górę i w dół 2–3 razy.</li>
		<li>Umieść probówkę w stacji magnetycznej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Przytrzymaj magnes i rurkę razem i jednym ruchem odwróć magnes i rurkę razem, aby wlać zawiesinę ogniw do nowej probówki. Wyrzuć starą rurkę.</li>
		<li>Powtórzyć krok 4.2.8 (skrócić czas inkubacji do 2 minut) i wlać zawiesinę komórek B do czystej stożkowej probówki.</li>
		<li>Wzbogacone limfocyty B są gotowe do użycia. Jeśli komórki zostaną użyte natychmiast, przejdź do punktu 4.3 (Ekspansja ludzkich komórek B). Sprawdź czystość wyizolowanych limfocytów B za pomocą cytometrii przepływowej (opcjonalnie). Jeśli komórki mają zostać zamrożone przed użyciem, przejdź do kroku 4.2.12.</li>
		<li>Aby zamrozić limfocyty B, odwirować przy 400 × g przez 5 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej w stężeniu 107 komórek/ml i podwielokrotności 1 ml/kriowial.</li>
		<li>Umieścić kriowial w schłodzonym pojemniku do zamrażania i przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc; następnie przenieść zamrożony kriowial do zbiornika z ciekłym azotem; przechowywać zamrożone komórki do 1 roku. 
		UWAGA: Oczekiwana wydajność izolowanych komórek B wynosi 2%-8% wszystkich PBMCs, przy żywotności 95%-99%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspansja ludzkich komórek B 
	UWAGA: Jeśli używasz świeżo wyizolowanych komórek B, pomiń kroki 4.3.1–4.3.5. Policz komórki i przenieś wymaganą liczbę komórek do sterylnej stożkowej probówki, a następnie przejdź do kroku 4.3.6.
	<ol>
		<li>Wstępnie ogrzej płodową surowicę bydlęcą (FBS) w łaźni wodnej przed rozmrożeniem limfocytów B. Przygotować 20 ml pożywki do ekspandowania komórek B, przenieść do kolby T25 i wstępnie zrównoważyć pożywkę w inkubatorze do hodowli tkankowych (w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności) co najmniej 15 minut przed użyciem.</li>
		<li>Rozmrozić komórki B w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Czekając, przenieś 2 ml wstępnie podgrzanego FBS do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Po całkowitym rozmrożeniu limfocytów B natychmiast dodaj do próbki 1 ml wstępnie podgrzanego FBS, kroplami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować w celu ponownego zawieszenia próbki i przenieść całą objętość, kroplami, do stożkowej probówki zawierającej 2 ml wstępnie podgrzanego FBS.</li>
		<li>Zwiększ objętość do 15 ml za pomocą sterylnego 1x PBS, nakrętki i delikatnie odwróć probówkę 2-3 razy.</li>
		<li>Wirować przy 400 × g przez 5 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego, ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml wstępnie zbalansowanego podłoża do ekspandowania komórek B i policzyć komórki. Całkowita liczba komórek powinna wynosić około 107 komórek.</li>
		<li>Przenieść komórki do kolby zawierającej 20 ml wstępnie zbalansowanej pożywki do ekspandowania komórek B. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić około 5 x 105 komórek/ml.</li>
		<li>Inkubować kolbę pionowo w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
		<li>Całkowicie odświeżać pożywkę ekspandacyjną co 2 dni, przenosząc całą objętość limfocytów B do sterylnej stożkowej probówki i powtórzyć kroki 4.3.6–4.3.9. 
		UWAGA: Kolba T25 może pomieścić 10–20 ml pożywki; Kolba T75 może pomieścić do 20–60 ml podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pierwotna inżynieria ludzkich komórek B
<ol>
	<li>Inżynieria komórek B po 48 ± 2 godzinach po rozprężeniu/aktywacji w celu uzyskania optymalnych wyników. Przygotować pożywkę do ekspandowania komórek B, podwielokrotność 1 ml pożywki na 48-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i wstępnie zrównoważyć w inkubatorze do hodowli tkankowej co najmniej 15 minut przed użyciem. 
	UWAGA: Projektując sgRNA CRISPR/Cas9 dla interesującego genu, postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej. 
	- Projektowanie sgRNA za pomocą narzędzia online11. 
	- Zaprojektuj sgRNA na eksonie, który jest wspólny dla wszystkich izoform białka. 
	- Zamów chemicznie modyfikowane sgRNA w renomowanych firmach. 
	- sgRNA zwykle występuje w postaci liofilizowanej; rozpuścić sgRNA w sterylnym buforze Tris-EDTA (TE) wolnym od DNaz/RNaz do stężenia 1 μg/μL.</li>
	<li>Przygotować substrat transfekujący CRISPR/Cas9, mieszając 1 μl (1 μg/μL) chemicznie zmodyfikowanego sgRNA z 1,5 μl (1 μg/μL) chemicznie zmodyfikowanego nukleazy Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) na reakcję transfekcji. Do kontroli użyj 1 μl buforu TE zamiast sgRNA. 
	UWAGA: Gdy CD19 sgRNA jest używany w eksperymencie genu KO, zobacz wyniki Rysunek 2. Gdy AAVS1 sgRNA jest używany w eksperymencie genu KI, zobacz Rysunek 5, aby uzyskać wyniki.
	<ul>
		<li>Trzymaj wszystkie elementy na lodzie.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Delikatnie wymieszać i przenieść 2,5 μl substratu transfekującego CRISPR/Cas9 na reakcję do probówki z 8-probówkowym paskiem o pojemności 0,2 ml; odstawić na miejsce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Włączyć nukleofektor (elektroporator) i przygotować odczynniki do transfekcji, jak pokazano w tabeli 1. 
	UWAGA: Jest to dobry krok na przerwę, jeśli to konieczne, poprzez umieszczenie wszystkich odczynników na lodzie. Usuń wszystkie odczynniki z lodu, gdy będziesz gotowy do wznowienia eksperymentu. W przypadku stosowania białka S.p. Cas9, badacz MUSI wstępnie skompleksować rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9-sgRNA, mieszając 1 μg sgRNA z 5 μg białka S.p. Cas9, unikając pęcherzyków i inkubując mieszaninę w temperaturze RT przez co najmniej 20 minut przed użyciem w celu uzyskania optymalnych wyników.</li>
	<li>Policz i przenieś 106 komórek B na reakcję transfekcji do sterylnej stożkowej probówki.</li>
	<li>Zwiększyć objętość do 15 ml za pomocą sterylnego 1x PBS i odwirować przy 400 × g przez 5 minut. W czasie oczekiwania przygotować odczynnik do transfekcji komórek pierwotnych (Tabela 2) i odstawić na miejsce w temperaturze względnej.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml sterylnego 1x PBS i odwirować przy 400 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Supernatant należy całkowicie wyrzucić, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	<li>Przenieś 0,5 μg chemicznie zmodyfikowanego mRNA GFP (jako reporter transfekcji) na 10 6 komórek B do osadu komórkowego (opcjonalnie).</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 20 μl odczynnika do transfekcji komórek pierwotnych na 106 komórek B; delikatnie wymieszać, pipetując 5–6 razy. Przenieść 20,5 μl na reakcję transfekcji do probówki o pojemności 0,2 ml paska z 8 probówkami zawierającego 2,5 μl substratu do transfekcji CRISPR/Cas9.</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół jeden raz, aby wymieszać i przenieść całą objętość (23 μl) do kuwety transfekcyjnej. Nakręć i delikatnie postukaj kuwetą o ławkę, aby upewnić się, że płyn zakrywa dno kuwety.</li>
	<li>Użyj protokołu ludzkiej pierwotnej komórki B na nukleofektorze do transfekcji. 
	UWAGA: Nukleofektor (elektroporator) może być umieszczony i używany na zewnątrz kaptura do hodowli tkankowej. Zakręć kuwetę, aby zapewnić sterylność.</li>
	<li>Odstaw elektroporowane ogniwa w kuwecie w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Przenieść 80 μl wstępnie zbalansowanej pożywki do ekspandowania limfocytów B z płytki do hodowli tkankowej do reakcji transfekcji w kuwecie. Umieścić kuwetę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować kilka razy, aby wymieszać i przenieść całą objętość próbki z kuwety do odpowiedniego dołka na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej zawierającej 1 ml pożywki do ekspandowania limfocytów B. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić 106 komórek/ml.</li>
	<li>Jeśli wykonujesz eksperyment z genem KI, przenieś wektor rAAV6 przy 500 000 wielokrotności infekcji do odpowiedniej studzienki zawierającej elektroporowane komórki (około 45 minut po elektroporacji). Zobacz przykładową konstrukcję wektorową rAAV6 w Rysunek 4A. 
	UWAGA: Na przykład: Próbka kontrolna zostanie poddana elektroporacji bez CRISPR/Cas9 lub wektora rAAV6. Próbka zawierająca tylko wektor zostanie poddana elektroporacji bez CRISPR/Cas9, a następnie zostanie wydedukowana za pomocą wektora rAAV6. Próbka KI zostanie poddana elektroporacji za pomocą CRISPR/Cas9, a następnie transdukowana za pomocą wektora rAAV6. rAAV6 musi zawierać ramiona homologiczne przed i za docelową witryną DSB dla HDR.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy wilgotności.</li>
	<li>Policz komórki i zapisz żywotność w pierwszym dniu po zakończeniu inżynierii.</li>
	<li>Odświeżaj pożywkę do ekspandowania komórek B co 2 dni, licząc komórki, a następnie przenosząc całą objętość komórek do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 400 × g przez 5 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl świeżej pożywki do ekspandowania limfocytów B i przenieść do dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Zwiększyć objętość pożywki, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek na poziomie 5 × 105 komórek/ml. 
	UWAGA: Płytka 48-dołkowa może pomieścić do 1 ml pożywki/dołka; płytka 24-dołkowa może pomieścić do 2 ml pożywki/dołka; płytka 12-dołkowa może pomieścić do 4 ml pożywki/dołka, a płytka 6-dołkowa może pomieścić do 8 ml pożywki/dołka.</li>
	<li>Pozwól zmodyfikowanym komórkom rozprężyć się przez co najmniej 5 dni przed wykonaniem dalszych analiz, takich jak analiza cytometrii przepływowej, analiza TIDE i PCR złącza.</li>
</ol>

<ol><li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes%3A+how+they+develop+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li>
<li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li>
<li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicines%22%5BJournal%5D)">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li>
<li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li>
<li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li>
<li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li>
<li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144(2018).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
<li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+CRISPR%2FCas9+sgRNA+design+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li>
<li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+editing%3A+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li>
<li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li>
<li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404(2014).</li>
<li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li>
<li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li>
<li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li>
</ol>

Złożono wniosek patentowy na metody wytwarzania i używania komórek B z edytowanym genomem, których wynalazcami są M.J.J., K.L. i B.S.M. B.S.M jest konsultantem i właścicielem akcji Immusoft Inc. Immusoft Inc sponsorował badania w laboratorium B.S.M.

Precyzyjna inżynieria genomu w pierwotnych ludzkich komórkach B była do niedawna wyzwaniem 9,10. Wcześniej opublikowaliśmy protokoły wykorzystujące CRISPR/Cas9 do inżynierii pierwotnych ludzkich limfocytów B9. W tym miejscu przedstawiamy ulepszone protokoły izolacji, ekspansji i inżynierii komórek B, aby umożliwić skuteczne KO CD19 lub wbijanie EGFP.
Tutaj pokazujemy, że nasz protokół ekspansji pozwala ...

Komórki B są podgrupą linii limfocytów wywodzących się z hematopoetycznych komórek macierzystych. Odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnym humoralnym układzie odpornościowym, wytwarzając duże ilości przeciwciał w odpowiedzi na wyzwania immunologiczne1. Limfocyty B są również prekursorami komórek B pamięci i terminalnie zróżnicowanych, długowiecznych komórek plazmatycznych, zapewniając w ten sposób trwałą odporność humoralną2. Komórki plazmatyczne, w szczególności, są unikalne wśród komórek odpornościowych pod względem ich zdolności do wytwarzania dużych ilości określonego przeciwciała podczas przetrwania przez lata lub dekady3. Dodatkowo, łatwość izolacji od krwi obwodowej sprawia, że linia komórek B jest doskonałym kandydatem do nowatorskich terapii komórkowych4.
Poprzednio, losowe metody integracji, takie jak te wykorzystujące wektory lentiwirusowe lub transpozon Śpiącej Królewny, były używane do inżynierii komórek B do dostarczania i ekspresji transgenu5,6,7,8. Jednak niespecyficzny charakter tych podejść utrudnia badanie funkcji biologicznych określonego genu w komórkach B i niesie ze sobą nieodłączne ryzyko mutagenezy insercyjnej i zmiennej ekspresji transgenu i/lub wyciszenia w warunkach terapeutycznych.
System CRISPR/Cas9 to potężne narzędzie inżynierii genomu, które pozwala naukowcom na precyzyjną edycję genomu różnych komórek u wielu gatunków. Ostatnio dwie grupy, w tym nasza, z powodzeniem opracowały metody ekspansji ex vivo i ukierunkowanej inżynierii genomu pierwotnych ludzkich komórek B9,10. Opiszemy proces oczyszczania pierwotnych ludzkich limfocytów B z próbki leukaforezy. Następnie opiszemy nasz zaktualizowany protokół ekspansji komórek B i aktywacji izolowanych komórek B. Następnie opiszemy proces wybijania klastra różnicowania 19 (CD19), specyficznego receptora komórek B i cechy charakterystycznej komórek B, za pomocą elektroporacji w celu wprowadzenia mRNA CRISPR / Cas9 wraz z sgRNA CD19 do aktywowanych komórek B.
Cas9 mRNA ulega translacji i wiąże się z sgRNA CD19, tworząc kompleks rybonukleoproteinowy CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Następnie sgRNA w kompleksie prowadzi Cas9 do wytworzenia pęknięcia dwuniciowego (DSB) w sekwencji docelowej na eksonie 2 genu. Komórki naprawią DSB poprzez "niehomologiczne łączenie końców" poprzez wprowadzanie lub usuwanie nukleotydów, co prowadzi do mutacji przesunięcia ramki i powoduje znokautowanie genu. Następnie zmierzymy utratę CD19 za pomocą cytometrii przepływowej i przeanalizujemy tworzenie indeli poprzez śledzenie indeli za pomocą analizy rozkładu (TIDE).
Następnie opiszemy proces używania CRISPR/Cas9 razem z rekombinowanym wektorem AAV6 (rAAV6, matrycą dawcy do naprawy kierowanej homologią (HDR)) do pośredniczenia w specyficznym dla miejsca insercji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w genie miejsca integracji wirusa związanego z adenowirusem 1 (AAVS1). Gen AAVS1 jest aktywnym locus bez znanych funkcji biologicznych i miejscem integracji wirusa AAV w ludzkim genomie; Dlatego jest uważany za "bezpieczną przystań" dla inżynierii genomu. Tutaj informujemy, że ekspansja i aktywacja limfocytów B pozwoliła na 44-krotną ekspansję w ciągu 7 dni hodowli (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Elektroporacja komórek B wykazała nieznaczne pogorszenie ogólnego stanu zdrowia komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) po 24 godzinach od transfekcji. Analiza wykresu punktowego markera CD19 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) wykazała do 83% redukcję w edytowanych komórkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).
analiza TIDE chromatografów (Rysunek 3A) wykazała, że % indeli było podobne do % utraty białka przez cytometrię przepływową (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Analiza cytometrii przepływowej eksperymentu KI wykazała, że komórki, które otrzymały wektor AAV (<silna klasa = "xfig" >Figura 4), wraz z RNP, wyrażały do 64% komórek EGFP-dodatnich (<silna klasa = "xfig" >Figura 5A), a następnie wykazywały pomyślną integrację przez reakcję łańcuchową polimerazy złączowej (PCR) (<silna klasa = "xfig">Figura 5B). Zliczanie komórek wykazało, że wszystkie próbki szybko odzyskały się w ciągu 3 dni po inżynierii (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C).

<table><tbody><tr><td>Białko nukleazy Cas9 V3 Alt-R, S.P. 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>mniejszym rozmiarze jest również dostępne</td></tr><tr><td>Komórka pierwotna Amaxa P3 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap chemicznie modyfikowane mRNA Cas9</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>dostępnych różnych rozmiarów</td></tr><tr><td>Cryostor CS10, 100 ml</td><td>STEMCELL Technology</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS Immune Cell SR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ludzkich komórek B EasySep</td><td>Technologia STEMCELL</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience utrwalany barwnik żywotności eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Doskonałe podłoża z komórek B, wolne od ksenotypów</td><td>R& D Systems</td><td>CCM031</td><td>B-komórkowe podłoże</td></tr><tr><td>bazowe Falcon 14 ml polipropylenowa probówka okrągłodenna</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11550</td><td>Tylko do rozmrażania komórek B</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&reg; 8-paskowe probówki PCR 0,2 ml z indywidualnie dołączonymi nasadkami kopułkowymi</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0,0067M PBS (bez Ca, bez Mg) lub 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector jednostka główna</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka Lonza 4D Nucleofector X</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Mega CD40 Ligand</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>Do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>Pen/Strep 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anty-ludzki klon CD19 HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>mniejszym rozmiarze dostępny jest również</td></tr><tr><td>pakiet rAAV6 SA-GFP (z naszą kasetą SA-GFP, patrz rysunek 4).</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A opakowanie</td><td>na dużą skalę, 1e13 GC/mL, 500 mL</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IL-10 250 ug</td><td>R& D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>dostępne różne rozmiary</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IL-15 25 ug</td><td>R& D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>dostępne różne rozmiary</td></tr><tr><td>Duży magnes Easy EasySep</td><td>STEMCELL Technology</td><td>18001</td><td>dostępne różne rozmiary</td></tr><tr><td>Bufor Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek b przy użyciu crispr/cas9

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B limfocyty pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych i są kluczowym składnikiem humoralnego ramienia adaptacyjnego układu odpornościowego. Są atrakcyjnymi kandydatami do terapii komórkowych ze względu na łatwość izolacji od krwi obwodowej, zdolność do ekspansji in vitro i długowieczność in vivo. Dodatkowo, ich normalna funkcja biologiczna - wytwarzanie dużych ilości przeciwciał - może być wykorzystana do ekspresji bardzo dużych ilości białka terapeutycznego, takiego jak rekombinowane przeciwciało do zwalczania infekcji lub enzym do leczenia enzymopatii. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody izolowania pierwotnych ludzkich komórek B od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) oraz aktywacji/ekspansji izolowanych komórek B in vitro. Następnie pokazujemy etapy związane z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9 do specyficznego dla miejsca KO endogennych genów w komórkach B. Metoda ta pozwala na efektywne KO różnych genów, które mogą być wykorzystane do badania funkcji biologicznych interesujących genów. Następnie demonstrujemy etapy korzystania z systemu CRISPR/Cas9 wraz z rekombinowanym, związanym z adenowirusem wektorem (rAAV) w celu efektywnej specyficznej dla miejsca integracji kasety ekspresji transgenu w komórkach B. Razem protokół ten zapewnia platformę inżynieryjną krok po kroku, która może być wykorzystana w pierwotnych ludzkich komórkach B do badania biologicznych funkcji genów, a także do opracowywania terapii komórkami B.

Zaktualizowany protokół ekspansji i aktywacji umożliwił szybką ekspansję limfocytów B do 44-krotności w ciągu 7 dni (Rysunek 1; n = 3 dawców). W eksperymencie KO liczba limfocytów B określona za pomocą barwienia błękitem Trypanu wykazała ponad 80% żywotnych komórek przy niewielkim spadku odzysku komórek zarówno w próbach kontrolnych, jak i CD19 KO w 24 h po elektroporacji (Rysunek 2A; p ≥ 0,05, n = 3 dawców). Wynik ten wskazuje, że elektroporacja nieznacznie wpł...

Tutaj udostępniamy szczegółowy, krok po kroku protokół inżynierii genomowej opartej na CRISPR/Cas9 pierwotnych ludzkich limfocytów B do nokautowania genów (KO) i knock-in (KI) w celu zbadania biologicznych funkcji genów w komórkach B i rozwoju terapii komórek B.

Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Protokół ten pozwala naukowcom precyzyjnie wyeliminować gen w komórkach B w celu zbadania skutków utraty funkcji tego genu lub wstawienia genu trans w celu uzyskania stabilnej ekspresji genu trans, który można wykorzystać do celów badawczych lub terapeutycznych. Główną zaletą tej metody jest to, że zapewnia uniwersalną platformę, która umożliwia łatwą i precyzyjną inżynierię komórek B o wysokiej wydajności. Metoda ta może być stosowana do inżynierii limfocytów B w celu ekspresji rekombinowanych przeciwciał lub enzymów, a następnie przenoszenia tych komórek B w celu leczenia infekcji lub enzymopatii.Na początek rozmrozić komórki B w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Czekając, przenieś dwa mililitry wstępnie podgrzanego FBS do sterylnej, 15-mililitrowej stożkowej probówki. Gdy limfocyty B zostaną całkowicie rozmrożone, natychmiast dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego FBS, kroplami, do próbki.Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Delikatnie odpipetować w celu ponownego zawieszenia próbki i przenieść całą objętość, kroplami, do stożkowej probówki zawierającej dwa mililitry wstępnie podgrzanego FBS. Doprowadź objętość do 15 mililitrów za pomocą sterylnego PBS, a następnie zakryj probówkę i delikatnie odwróć ją dwa do trzech razy.Odwirować próbkę o sile 400 razy G przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad jednym mililitrem wstępnie zrównoważonej pożywki do rozprężania komórek B i policzyć komórki. Całkowita liczba komórek powinna wynosić około 10 do siódmych komórek.Przenieść komórki do kolby zawierającej 20 mililitrów wstępnie zbalansowanego podłoża do ekspandowania komórek B. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić około pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr. Inkubować kolbę pionowo w inkubatorze do hodowli tkankowych.Przygotować substrat transfekujący CRISPR/Cas9, mieszając jeden mikrogram chemicznie zmodyfikowanego sgRNA z 1,5 mikrograma mRNA jądra jądra Streptococcus pyogenes Cas9 na reakcję transfekcji. W celu kontroli dodaj jeden mikrolitr buforu TE zamiast sgRNA do 0,2-mililitrowej probówki z ośmioma probówkami. Włącz elektroporator i przygotuj odczynniki do infekcji jądrowej.Policz i przenieś 1 milion komórek B na reakcję transfekcji do sterylnej stożkowej probówki. Doprowadzić objętość do 15 mililitrów za pomocą sterylnego PBS i odwirować w temperaturze 400 razy G przez pięć minut. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach sterylnego PBS i odwirować w temperaturze 400 razy G przez pięć minut, a następnie całkowicie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj 0,5 mikrograma chemicznie zmodyfikowanego mRNA GFP na 1 milion komórek B do osadu komórkowego. Zawiesić osad z 20 mikrolitrami odczynnika do transfekcji komórek pierwotnych na 1 milion komórek B i delikatnie wymieszać, pipetując pięć do sześciu razy.Przenieś 20,5 mikrolitra na reakcję transfekcji do 0,2-mililitrowych probówek zawierających odczynnik CRISPR/Cas9. Pipetuj raz w górę i w dół, aby wymieszać i przenieść całą objętość do kuwety transfekcyjnej. Nakręć i delikatnie postukaj kuwetą o ławkę, aby upewnić się, że płyn zakrywa dno kuwety.Użyj protokołu ludzkiej pierwotnej komórki B na elektroporatorze do transfekcji. Odstaw elektroporowane ogniwa w kuwecie w temperaturze pokojowej na 15 minut. Następnie przenieś 80 mikrolitrów wstępnie zbalansowanego podłoża do ekspandowania komórek B do reakcji transfekcji w kuwecie.Umieścić kuwetę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 30 minut. Delikatnie przetrzeć kilka razy głowicę rurową, aby wymieszać i przenieść całą objętość próbki z kuwety do odpowiedniego dołka 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej jeden mililitr pożywki do ekspandowania komórek B. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić 1 milion komórek na mililitr.Przeprowadzając eksperyment knock-in, przenieś rekombinowany wektor wirusowy typu szóstego związany z adeno przy 500 000 wielokrotności infekcji do odpowiedniej studzienki zawierającej elektroporowane komórki. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy wilgotności. W eksperymencie z nokautem liczba komórek B wykazała ponad 80% żywotnych komórek z niewielkim zmniejszeniem odzyskiwania komórek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i w próbkach z nokautem CD19 po 24 godzinach od elektroporacji.Limfocyty B pobrano w piątym dniu po transfekcji do cytometrii przepływowej i analizy pływów. Reprezentatywne wykresy rozrzutu próbek kontrolnych i nokautujących wykazały odpowiednio 14 i 95% komórek ujemnych CD19, wykazując znaczne zmniejszenie ekspresji CD19 w próbkach nokautujących. Chromatogramy sekwencjonowania genomu wykazały podwójne piki w limfocytach B z nokautem CD19, co wskazuje na insercję lub delecje nukleotydów po dwuniciowych przerwach, w których pośredniczył CRISPR/Cas9.Analiza indel chromatografów próbek z nokautem wykazała wysoki procent tworzenia się indel w locus CD19, co jest zgodne z procentową utratą białka CD19 wykrytą za pomocą cytometrii przepływowej. Limfocyty B z eksperymentu knock-in zostały zebrane w 12 dniu, po inżynierii. Wykresy rozrzutu wykazały 64% komórek dodatnich EGFP w próbce, która otrzymała rekombinowany wektor wirusowy typu szóstego związany z adeno, wraz z RNP, podczas gdy brak lub minimalny dodatni wynik EGFP zaobserwowano odpowiednio w próbkach kontrolnych i tylko wektorowych.Amplifikacja PCR ze złączem wykazała amplikony 1,5 kilopary zasad w próbce knock-in i nie zaobserwowano produktu PCR ani w próbce kontrolnej, ani tylko wektorowej. Zliczanie komórek wykazało, że proces inżynieryjny wpływa na regenerację komórek w próbce knock-in bardziej niż w próbkach kontrolnych lub próbkach zawierających tylko wektory. Jednak wszystkie próbki szybko odbiły się w ciągu trzech dni po inżynierii.Procedura ta może być również wykorzystana do wprowadzenia agentów edytora zasad w celu zmiany pojedynczych par zasad w celu wywołania lub skorygowania mutacji jednopunktowych w genomie komórek B. Może być również stosowany do wprowadzania przedwczesnych kodonów stop lub do zmiany miejsc splicingu, co pozwala na wielokrotne nokautowanie genów bez ryzyka translokacji chromosomowych. Zanim ta technika została opracowana, inżynieria ludzkich limfocytów B wymagała zastosowania innych, bardziej wymagających podejść inżynierii genetycznej.Ta technika jest łatwiejszą, tańszą i szybszą alternatywą. Może być również potencjalnie wykorzystany do syntezy produktów terapii komórkowej do użytku klinicznego.

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Prezentujemy metodę hodowli i edycji genów pierwotnych komórek B makaków rezusów przy użyciu CRISPR/Cas9 i rekombinowanego adenowirusa serotypu 6 do badania terapii komórkami B.

Edycja genów pierwotnych komórek B makaka rezusa

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Poznaj inżynierię genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia precyzyjne wyciszanie genów i wprowadzanie transgenów z wysoką wydajnością, wspierając badania nad biologią komórek B oraz rozwój terapii.

Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów