Name: Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj metodę współkultury aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej. Model in vitro umożliwia ilościową ocenę zdolności regeneracyjnych OEG po urazie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana finansowo przez projekt SAF2017-82736-C2-1-R od Ministerio de Ciencia e Innovación do MTM-F oraz przez Fundación Universidad Francisco de Vitoria do JS.

UWAGA: Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez krajowe i instytucjonalne komisje bioetyczne.
1. Kultura ihOEG (Ts12 i Ts14)
UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej.
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml pożywki ME10 OEG zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Przygotować 5 ml DMEM/F12-FBS, jak podano w Tabeli 1, w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Ogrzewać oba media w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 15 minut.</li>
	<li>Rozmrozić fiolki z komórkami Ts12 i Ts14 w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić i dodać komórki do pożywki hodowlanej DMEM/F12-FBS przygotowanej w kroku 2.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Aspiruj do supernatantu.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki ME10 i ponownie zawiesić osad.</li>
	<li>Przygotuj naczynie do hodowli komórkowej p60 z 3 ml ME10 i dodaj zawiesinę komórkową kroplami.</li>
	<li>Przesuń, aby równomiernie rozprowadzić komórki na płytce.</li>
	<li>Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO2, 
	UWAGA: Po osiągnięciu konfluencji należy wykonać co najmniej kolejne przejście, aby zoptymalizować komórki pod kątem kokultury. 90% konfluencji jest potrzebne przed wysiewem ich na szkiełkach nakrywkowych w celu kokultury. Zlewający się p-60 ma średnią liczbę komórek 7 x 105 dla linii komórkowych Ts14 i 2,5 x 106 dla linii komórkowych Ts12. Linie komórkowe Ts12 i Ts14 należy przechodzić co 2–3 dni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ihOEG (Ts12 i Ts14) do testu
UWAGA: Ten krok musi być wykonany 24 godziny przed sekcją RGN i kokulturą.
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm należy traktować 10 μg/ml poli-L-lizyny (PLL) przez 1 godz. 
	UWAGA: Szkiełka nakrywkowe można pozostawić na noc w roztworze PLL.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).</li>
	<li>Odłącz komórki Ts12 i Ts14 ihOEG od naczynia do hodowli komórek p60.
	<ol>
		<li>Dodać 4 ml pożywki hodowlanej DMEM/F12-FBS (Tabela 1) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ogrzewać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Usunąć pożywkę z płytek i przemyć komórki 1 ml 1x PBS-EDTA, jeden raz.</li>
		<li>Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do komórek OEG i inkubować przez 3–5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Zebrać komórki za pomocą pipety p1000 i przenieść je do podłoża przygotowanego w kroku 3.1.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 200 x g.</li>
		<li>Aspiruj do supernatantu.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki ME10 i ponownie zawiesić osad.</li>
		<li>Policz numer komórki w hemocytometrze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiać 80 000 komórek Ts14 lub 100 000 komórek Ts12 / basenik na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach w 500 μl pożywki ME10.</li>
	<li>Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Sekcja tkanki siatkówki
UWAGA: 2-miesięczne samce szczurów rasy Wistar są używane jako źródło RGN. Dwie siatkówki (jedna szczura) na 20 dołków 24-dołkowej płytki komórkowej. Autoklaw materiału chirurgicznego przed użyciem. Zestaw do dysocjacji papainy jest kupowany komercyjnie (tabela materiałów). Należy postępować zgodnie z instrukcjami dostawcy dotyczącymi rekonstytucji. Rozpuścić kwas D,L-2-amino-5-fosfonowalerianowy (APV) w 5 mM i przygotować podwielokrotności.
<ol>
	<li>W dniu testu należy przygotować następujące podłoża.
	<ol>
		<li>Przygotuj naczynie do hodowli komórek p60 z 5 ml zimnego EBSS (fiolka 1 zestawu do dysocjacji papainy).</li>
		<li>Przygotować naczynie do hodowli komórek p60 z odtworzoną fiolką 2 (papainą) zestawu do dysocjacji papainy oraz 50 μl APV. Następnie dodać 250 μl odtworzonej fiolki 3 (DNaza plus 5 μL APV).</li>
		<li>W sterylnej probówce wymieszać 2,7 ml fiolki 1 z 300 μl fiolki 4 (inhibitor proteazy albuminowo-jajnikowej). Dodać 150 μl fiolki 3 (DNazy) plus 30 μl APV.</li>
		<li>Przygotować 20 ml pożywki Neurobasal-B27 (NB-B27) zgodnie z tabelą 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Złożyć ofiarę szczura przez uduszenie CO2 .</li>
	<li>Usunąć głowę przez ścięcie głowy gilotyną; umieścić ją na szalce Petriego o średnicy 100 mm i spryskać głowę etanolem o stężeniu 70% przed umieszczeniem jej w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Obetnij wąsy szczura nożyczkami, aby nie przeszkadzały w manipulacji oczami.</li>
	<li>Chwyć nerw wzrokowy kleszczami, aby wyciągnąć gałkę oczną na tyle, aby móc wykonać nacięcie w poprzek oka skalpelem.</li>
	<li>Usuń soczewkę i ciało szkliste i wyciągnij siatkówkę (tkankę podobną do pomarańczy), podczas gdy pozostałe warstwy oka pozostają w środku (w tym warstwa nabłonka pigmentowego).</li>
	<li>Umieścić siatkówkę w naczyniu do hodowli komórkowej p60 przygotowanym w kroku 3.1.1.</li>
	<li>Przenieść siatkówkę do szalki do hodowli komórkowej p60 przygotowanej w kroku 3.1.2 i pokroić ją skalpelem na małe kawałki o przybliżonej wielkości < 1 mm.</li>
	<li>Przenieść do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Inkubować tkankę przez 30 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 i mieszając co 10 minut.</li>
	<li>Dysocjuj grudki komórek, pipetując w górę i w dół za pomocą szklanej pipety Pasteura.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i w celu dezaktywacji papainy ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze przygotowanym w kroku 3.1.3. (1,5 ml na 2 oczy).</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować zawiesinę komórkową do 5 ml przygotowanej fiolki 4.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 min.</li>
	<li>Podczas wirowania należy całkowicie usunąć pożywkę ME-10 z płytki kuwety OEG 24 dołkowej (wcześniej przygotowanej w kroku 2) i zastąpić ją 500 μl pożywki NB-B27 na studzienkę.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki NB-B27.</li>
	<li>Płytka 100 μl zawiesiny komórek siatkówki, na dołek płytki m24, na monowarstwy nakrywki poddane działaniu PLL lub OEG.</li>
	<li>Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 96 godzin w pożywce NB-B27.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Po 96 godzinach utrwalić komórki na 10 minut, dodając taką samą objętość 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS do pożywki hodowlanej (600 μL) (stężenie końcowe PFA 2%).</li>
	<li>Usuń pożywkę i PFA z płytki 24-dołkowej i ponownie dodaj 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS. Inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Wyrzuć utrwalacz i umyj 3 razy 1x PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Blokuj 0,1% Triton X-100/1% FBS w PBS (PBS-TS) przez 30–40 min.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w buforze PBS-TS w następujący sposób: przeciwciało monoklonalne SMI31 (przeciwko białkom MAP1B i NF-H) (1:500). 514 (rozpoznaje białka MAP2A i B) królicza surowica poliklonalna (1:400).</li>
	<li>Dodać przeciwciała pierwszorzędowe do kokultur i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia wyrzuć przeciwciała i przemyj szkiełka nakrywkowe 1x PBS, 3 razy, przez 5 minut.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała drugorzędowe w buforze PBS-TS w następujący sposób: Dla SMI-31, anty-mysi Alexa Fluor 488 (1:500). Dla 514 anty-królik Alexa-594 (1:500).</li>
	<li>Inkubować komórki z odpowiednimi fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 1x PBS, 3 razy, przez 5 minut, w ciemności.</li>
	<li>Na koniec zamontować szkiełka nakrywkowe z podłożem montażowym (tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W razie potrzeby można przeprowadzić barwienie jąder fluorescencyjnych DAPI (4,6-diamidyno-2-fenyloindol). Przed montażem inkubować komórki przez 10 minut w ciemności z DAPI (10 μg/ml w 1x PBS). Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą 1x PBS i na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja regeneracji aksonów
UWAGA: Próbki są oznaczane ilościowo pod 40-krotnym obiektywem mikroskopu epifluorescencyjnego. Należy wykonać co najmniej 30 zdjęć na losowych polach, z co najmniej 200 neuronami, które należy określić ilościowo dla każdego leczenia. Każdy eksperyment należy powtórzyć co najmniej trzy razy.
<ol>
	<li>Określ ilościowo odsetek neuronów z aksonem (neuryt SMI31 dodatni) w stosunku do całkowitej populacji RGN (zidentyfikowanych z MAP2A/B 514 dodatnim immunobarwieniem ciała neuronalnego i dendrytów).</li>
	<li>Określ ilościowo wskaźnik regeneracji aksonów lub średnią długość aksonów (μm/neuron). Ten parametr jest zdefiniowany jako suma długości (w μm) wszystkich zidentyfikowanych aksonów, podzielona przez całkowitą liczbę zliczonych neuronów, niezależnie od tego, czy prezentowały one akson, czy nie. Długość aksonów jest określana za pomocą wtyczki NeuronJ oprogramowania do obrazowania ImageJ (NIH-USA).</li>
	<li>Oblicz średnią, odchylenie standardowe i istotność statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
</ol>

<ol><li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%3A+Its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).</li>
<li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).</li>
<li>Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+olfactory+mesenchymal+stromal+cell+transplants+promote+remyelination+and+earlier+improvement+in+gait+coordination+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury.</a> Glia. 65 (4), 639-656 (2017).</li>
<li>Moreno-Flores, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+cell+line+from+immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promotes+functional+recovery+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord.</a> Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).</li>
<li>Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair.</a> Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).</li>
<li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).</li>
<li>Su, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells%3A+biology+in+neural+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration.</a> Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+for+spinal+cord+injury%3A+sniffing+out+the+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues.</a> Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).</li>
<li>Gómez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+spinal+cord+injury+with+olfactory+ensheathing+glia+cells+%28OECs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs).</a> Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).</li>
<li>Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+glia%3A+repairing+injury+to+the+mammalian+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system.</a> Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).</li>
<li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+olfactory+ensheathing+cells+restore+retinal+function+in+a+rat+model+of+light-induced+retinal+damage+by+inhibiting+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress.</a> Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).</li>
<li>Pastrana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+associated+with+adult+axon+regeneration+promoted+by+olfactory+ensheathing+cells%3A+a+new+role+for+matrix+metalloproteinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2.</a> The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).</li>
<li>Pastrana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+production+by+olfactory+ensheathing+cells+contributes+to+axonal+regeneration+of+cultured+adult+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons.</a> Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).</li>
<li>Simón, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+by+olfactory+ensheathing+glia+promotes+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration.</a> Glia. 59, 1458-1471 (2011).</li>
<li>Lim, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibly+immortalized+human+olfactory+ensheathing+glia+from+an+elderly+donor+maintain+neuroregenerative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity.</a> Glia. 58, 546-558 (2010).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+senescence+progression+in+reversibly+immortalized+human+ensheathing+glia+permits+their+survival+after+deimmortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization.</a> Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuroregenerative+human+ensheathing+glia+cell+line+with+conditional+rapid+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth.</a> Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).</li>
<li>Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+an+immortalized+olfactory+ensheathing+glia+cell+line+with+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+gene%3A+Evaluation+of+its+neuroregenerative+capacity+as+a+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept.</a> Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).</li>
<li>Deumens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+of+glial+cells+stimulates+directional+neurite+growth+of+CNS+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro.</a> Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).</li>
<li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+promote+neurite+sprouting+of+injured+axons+in+vitro+by+direct+cellular+contact+and+secretion+of+soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).</li>
<li>Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+olfactory+ensheathing+glia+promote+the+long-distance+growth+of+adult+retinal+ganglion+cell+neurites+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro.</a> Glia. 53 (5), 467-476 (2006).</li>
<li>Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+exert+a+trophic+effect+on+the+hypothalamic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro.</a> Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).</li>
<li>Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+represent+an+optimal+substrate+for+hippocampal+neurons%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).</li>
<li>Runyan, S. A., Phelps, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+olfactory+ensheathing+glia+enhance+axon+outgrowth+on+a+myelin+substrate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro.</a> Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).</li>
<li>Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+promote+corticospinal+axonal+outgrowth+by+a+L1+CAM-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism.</a> Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).</li>
<li>Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell-free+adult+canine+olfactory+ensheathing+cell+preparations+from+olfactory+bulb+and+mucosa+display+differential+migratory+and+neurite+growth-promoting+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro.</a> BMC Neuroscience. 14, 141(2013).</li>
<li>Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cell-neurite+alignment+enhances+neurite+outgrowth+in+scar-like+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures.</a> Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).</li>
<li>Wigley, C. B., Berry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+adult+rat+retinal+ganglion+cell+processes+in+monolayer+culture%3A+comparisons+between+cultures+of+adult+and+neonatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons.</a> Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).</li>
<li>Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+olfactory+nerve+ensheathing+cells+are+effective+promoters+of+adult+central+nervous+system+neurite+outgrowth+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture.</a> Glia. 25 (3), 256-269 (1999).</li>
<li>Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+olfactory+ensheathing+cell+signaling+mechanisms%3A+effects+on+their+support+for+neurite+regrowth+from+adult+CNS+neurons+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture.</a> Glia. 44 (3), 232-241 (2003).</li>
<li>Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+and+interactions+between+phenotypic+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+in+promoting+CNS+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration.</a> Glia. 50 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promote+axonal+regeneration+of+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+olfactory+mucosa+cells+but+not+lung+or+skin+fibroblasts+mediate+axonal+regeneration+of+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons.</a> Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+site-specific+phosphorylation+of+the+microtubule-associated+protein+2+during+the+development+of+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons.</a> Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).</li>
<li>Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+cell+purification+and+determination+of+cell+purity%3A+crucial+aspects+of+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair.</a> Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeszczep OEG w miejscach uszkodzenia OUN jest uważany za obiecującą terapię uszkodzenia OUN ze względu na jego konstytutywne właściwości proneuroregeneracyjne 7,8,9. Jednak w zależności od źródła tkanki – błony śluzowej węchu (OM-OEG) w porównaniu z opuszką węchową (OB-OEG) – lub wieku dawcy, istnieje znaczna różnica w tej pojemności 26,31,33,36....

Dorosłe neurony ośrodkowego układu nerwowego (OUN) mają ograniczoną zdolność regeneracyjną po urazie lub chorobie. Powszechną strategią wspomagania regeneracji OUN jest przeszczepianie, w miejscu urazu, typów komórek, które indukują wzrost aksonów, takich jak komórki macierzyste, komórki Schwanna, astrocyty lub komórki glejowe otaczające węch (OEG)1,2,3,4,5.
OEG wywodzi się z grzebienia neuronalnego6 i znajduje się w błonie śluzowej węchu oraz w opuszce węchowej. U dorosłego osobnika węchowe neurony czuciowe obumierają regularnie w wyniku ekspozycji środowiskowej i są zastępowane przez nowo różnicujące się neurony. OEG otacza i prowadzi te nowe aksony węchowe, aby weszły do opuszki węchowej i ustanowiły nowe synapsy z ich celami w klasie CNS<sup="xref">7. Ze względu na te cechy fizjologiczne, OEG został wykorzystany w modelach uszkodzeń OUN, takich jak uszkodzenie rdzenia kręgowego lub nerwu wzrokowego, a jego właściwości neuroregeneracyjne i neuroprotekcyjne zostały udowodnione8,9,10,11. Zidentyfikowano kilka czynników odpowiedzialnych za proregeneracyjne cechy tych komórek, w tym produkcję proteaz macierzy zewnątrzkomórkowej lub wydzielanie neurotroficznych i aksonalnych czynników wzrostu12,13,14.
Biorąc pod uwagę techniczne ograniczenia związane z rozszerzaniem pierwotnych komórek OEG, wcześniej ustaliliśmy i scharakteryzowaliśmy odwracalne, unieśmiertelnione ludzkie linie klonalne OEG (ihOEG), które zapewniają nieograniczoną podaż jednorodnych OEG. Te komórki ihOEG pochodzą z kultur pierwotnych, przygotowanych z opuszki węchowej uzyskanej w autopsjach. Zostały one unieśmiertelnione przez transdukcję podjednostki katalitycznej telomerazy (TERT) i onkogenu Bmi-1 oraz zmodyfikowane dużym antygenem T wirusa SV4015,16,17,18. Dwie z tych linii komórkowych ihOEG to Ts14, która utrzymuje zdolność regeneracyjną oryginalnych kultur i Ts12, linia o niskiej regeneracji, która jest używana jako kontrola niskiej regeneracji w tych eksperymentach18.
Aby ocenić zdolność OEG do wspomagania regeneracji aksonów po uszkodzeniu neuronów, zaimplementowano kilka modeli in vitro. W tych modelach OEG stosuje się do kultur o różnym pochodzeniu neuronalnym i bada się tworzenie i wydłużanie neurytów - w odpowiedzi na kokulturę glejową. Przykładami takich źródeł neuronalnych są neurony korowe noworodków szczurów19, rany zadrapań wykonywane na neuronach embrionalnych szczura z tkanki korowej20, eksplantaty siatkówki szczura21, neurony postnatalne podwzgórza lub hipokampa szczura22,23, postnatal ratal rat grzbiet root ganglions24, postnatal mouse corticospinal tracts25, ludzkie neurony NT226, lub postnatalne neurony korowe mózgu na reaktywnych kulturach przypominających blizny astrocytów27.
W tych modelach test regeneracji opiera się na neuronach embrionalnych lub postnatalnych, które mają wewnętrzną plastyczność, której nie ma w uszkodzonych neuronach dorosłych. Aby przezwyciężyć tę wadę, przedstawiamy model regeneracji aksonów dorosłych w kokulturach linii OEG z dorosłymi neuronami zwojowymi siatkówki (RGN), oparty na modelu pierwotnie opracowanym przez Wigleya i wsp.28,29,30,31 i zmodyfikowany i używany przez naszą grupę12,13,14,15,16,17,18,32,33. Krótko mówiąc, tkanka siatkówki jest ekstrahowana od dorosłych szczurów i trawiona papainą. Zawiesina komórek siatkówki jest następnie posiewana na szkiełkach nakrywkowych poddanych działaniu polilizyny lub na monowarstwach Ts14 i Ts12. Hodowle są utrzymywane przez 96 godzin przed ich utrwaleniem, a następnie przeprowadza się immunofluorescencję dla markerów aksonalnych (MAP1B i NF-H)34 i somatodendrytycznych (MAP2A i B)35. Regeneracja aksonów jest określana ilościowo jako procent neuronów z aksonem, w odniesieniu do całkowitej populacji RGN, a wskaźnik regeneracji aksonów jest obliczany jako średnia długość aksonów na neuron. Protokół ten jest nie tylko przydatny do oceny potencjału neuroregeneracyjnego ihOEG, ale może być rozszerzony na różne źródła OEG lub innych komórek glejowych.

<table><tbody><tr><td>przeciwciało 514</td><td>Odniesienie 34</td><td></td><td>Surowica poliklonalna królika, która rozpoznaje MAP2A i B.</td></tr><tr><td>przeciwciało SMI-31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Przeciwciało monoklonalne przeciwko białkom MAP1B i NF-H</td></tr><tr><td>przeciwko mysim przeciwciałom Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciw królikowi Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D,L-2-amino-5-fosfonowalerianowy</td><td>Sigma</td><td>283967</td><td>Inhibitor receptora NMDA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Barwienie fluorescencyjne jąder</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>11573397</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>FBS-Hyclone</td><td>Fisher Scientific</td><td>16291082</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Medium montażowe</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH-USA)</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605F</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Pożywka do hodowli komórek nerwowych</td></tr> System <tr><td>dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Do stosowania w izolacji komórek nerwowych</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-EDTA</td><td>Lonza</td><td>H3BE02-017F</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Bakteriostatyczny i bakteriobójczy</td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki mózgowej</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej</td></tr><tr><td>Poly -L- lizyna (PLL)</td><td>Sigma</td><td>A-003-M</td><td></td></tr></tbody></table>

współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Komórki glejowe otoczki węchowej (OEG) są zlokalizowane na całej długości od błony śluzowej węchu do warstwy nerwu węchowego (ONL) opuszki węchowej. Przez całe dorosłe życie odgrywają kluczową rolę w aksonalnym wzroście nowo wytworzonych neuronów węchowych, od blaszki właściwej do ONL. Ze względu na swoje właściwości proregeneracyjne, komórki te zostały wykorzystane do wspomagania regeneracji aksonów w modelach uszkodzeń rdzenia kręgowego lub nerwu wzrokowego.
Prezentujemy model in vitro do testowania i mierzenia zdolności neuroregeneracyjnej OEG po uszkodzeniu nerwowym. W tym modelu odwracalnie unieśmiertelniony ludzki OEG (ihOEG) jest hodowany jako monowarstwa, siatkówki są ekstrahowane od dorosłych szczurów, a neurony zwojowe siatkówki (RGN) są kohodowane na monowarstwie OEG. Po 96 godzinach markery aksonalne i somatodendrytyczne w RGN analizuje się metodą immunofluorescencji, a liczbę RGN z aksonem i średnią długość aksonów / neuron określa się ilościowo.
Ten protokół ma tę przewagę nad innymi testami in vitro, które opierają się na neuronach embrionalnych lub postnatalnych, że ocenia właściwości neuroregeneracyjne OEG w tkance dorosłej. Jest również przydatny nie tylko do oceny potencjału neuroregeneracyjnego ihOEG, ale może być rozszerzony na różne źródła OEG lub innych komórek glejowych.

W niniejszym protokole przedstawiamy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej OEG po uszkodzeniu neuronalnym. Jak pokazano na Rycini 1, źródłem OEG jest odwracalnie unieśmiertelniona klonalna linia komórkowa ludzkich OEG – Ts14 i Ts12 –, pochodząca z kultur pierwotnych przygotowanych z cebulek węchowych uzyskanych podczas autopsji15,17,18. Tkankę siatkówki pobiera się od dorosłych szczu...

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Nasz protokół jest prostym i powtarzalnym modelem do oceny zdolności otoczki węchowej w celu wspierania regeneracji aksonów u dorosłych osób Jest to technika ilościowa, która umożliwia ocenę zdolności regeneracyjnej gleju otaczającej węch, którą można również rozszerzyć na inne typy komórek glejowych. Technika ta jest pierwszym krokiem do zbadania gleju otoczki węchowej jako kandydata do terapii komórkowej w uszkodzeniach układu nerwowego przed translacją do badań in vivo lub klinicznych. Zabieg zademonstruje Maria Portela, doktorantka z naszego laboratorium.Na początek przygotuj wszystkie wymagane nośniki zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Po złożeniu szczura w ofierze umieść jego głowę na 100-mililitrowej szalce Petriego i spryskaj ją 70% etanolem przed umieszczeniem w okapie z przepływem laminarnym. Obetnij wąsy szczura nożyczkami, aby nie przeszkadzały w manipulacji oczami.Chwyć nerw wzrokowy kleszczami, aby wyciągnąć gałkę oczną na tyle, aby móc wykonać nacięcie w poprzek oka skalpelem. Usuń soczewkę i ciało szkliste i wyciągnij siatkówkę, pozostawiając pozostałe warstwy oka w środku. Umieść siatkówkę w wcześniej przygotowanym naczyniu do hodowli komórek P60 z pięcioma mi

coculture-axotomized-rat-retinal-ganglion-neurons-with-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym protokole opisaliśmy nową metodę badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem systemu kokultury in vitro. Glejowe komórki kory mózgu szczura hodowano do osiągnięcia konfluencji, a następnie kokultywowano z wysoko oczyszczonymi neuronami z zwojów korzeni grzbietowych szczura. Bezpośrednio w tej samej kulturze porównano wpływ różnych komórek glejowych na adhezję neuronów oraz wzrost aksonów. Metoda ta stanowi nowy sposób bezpośredniego badania...

Badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem nowej metody kokultury

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Ten film pokazuje procedurę izolacji neuronów zwojowych siatkówki (RGN) z siatkówki szczura i kohodowli ich z komórkami glejowymi otoczki węchowej (OEG). Metoda ta pozwala na badanie potencjału neuroregeneracyjnego OEG po uszkodzeniu neuronalnym.

Hodowla neuronów zwojowych siatkówki z glejem osłonki węchowej

Ten film demonstruje model kokulturacyjny eksplantacji zwoju korzenia grzbietowego i komórek Schwanna. W warunkach kokultury kwas askorbinowy sprzyja różnicowaniu komórek Schwanna w formy mielinizujące. Mielinizujące się komórki Schwanna wielokrotnie owijają aksony, aby utworzyć osłonkę mielinową, która jest niezbędna do funkcjonowania nerwów.

Wspólna hodowla eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego z komórkami Schwanna do mielinizacji neuronów

Źródło: Cheah, M., et al. Iniekcja ganglionu korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych. J. Vis. Exp. (2017). Ten film pokazuje krok po kroku procedurę wstrzykiwania zawiesiny wirusa do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i wywoływania kontrolowanego uszkodzenia aksonów poprzez zmiażdżenie korzenia grzbietowego u znieczulonego szczura. Protokół obejmuje odsłonięcie DRG, dostarczenie wektora wirusowego stymulującego wzrost w celu...

Modelowanie regeneracji aksonów czuciowych u szczura za pomocą iniekcji zwoju korzenia grzbietowego i uszkodzenia zmiażdżenia korzenia grzbietowego

Źródło: Portela-Lomba, M., et. al. Kokultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem osłonki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych. J. Vis. Exp. (2020). Ten film przedstawia obrazowanie i kwantyfikację regeneracji aksonów w aksotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura (RGN) współhodowanych z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami glejowymi otaczającymi węch. RGN są znakowane immunologicznie, z czerwonymi somi i zielonymi aksonami. Obrazy...

Obrazowanie i kwantyfikacja regeneracji aksonów w akskotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost pierwotnych neuronów węchowych. Ta specyficzna właściwość może być wykorzystana do przeszczepu komórkowego. Przedstawiamy w niniejszej pracy model transplantacji komórkowej oparty na zastosowaniu OEC w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Ten protokół przedstawia użycie iniekcji do zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i równoczesnym uszkodzeniem zmiażdżenia korzenia grzbietowego u dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Model ten nadaje się do badania zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

W systemie kokultury zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, mielinizacja obwodowego układu nerwowego może być badana. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości obserwacji i ilościowego określenia mielinizacji obwodowej oraz zbadania wpływu związków będących przedmiotem zainteresowania na osłonkę mielinową.

Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna

Poznaj metodę współkultury aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej. Model in vitro umożliwia ilościową ocenę zdolności regeneracyjnych OEG po urazie nerwowym.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych (Wideo) | JoVE Journal

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Przeglądaj więcej filmów