Name: Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do analizy cyklu komórkowego antygenowo-specyficznych limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy. Technika wykorzystuje barwienie DNA i Ki67 do badania dynamiki odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Reithera, przez projekt MIUR 2017K55HLC_006 oraz przez grant 5 × 1000 od Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC). Następujący tetramer został uzyskany przez NIH Tetramer Facility: APC-sprzężony H-2K (d) HIV gag 197-205 AMQMLKETI.

<ol><li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li>
<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cells%3A+foot+soldiers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highways%2C+byways+and+breadcrumbs%3A+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunology%22%5BJournal%5D)">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li>
<li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD8+response+on+autopilot%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li>
<li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Naïve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li>
<li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+and+memory+T-cell+differentiation%3A+implications+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li>
<li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer%3A+making+sense+of+T-cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li>
<li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow%3A+survival+or+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271(2016).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+niches+in+the+bone+marrow%3A+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary%3A+Memory+CD8%28%2B%29+T+cells+colocalize+with+IL-7%28%2B%29+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102(2016).</li>
<li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735(2019).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes & Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li>
<li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Report%22%5BJournal%5D)">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li>
<li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li>
<li>Mouse phenotype. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020).</li>
<li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+time+of+CD8%2B+T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423(2010).</li>
<li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li>
<li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425(2013).</li>
</ol>

A. Folgori i S. Capone są pracownikami Reithera Srl. A. Nikozja zostaje wymieniony jako wynalazca w zgłoszeniu patentowym WO 2005071093 (A3) "Nosiciele szczepionki adenowirusa szympansów". Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż ekspansja klonów limfocytów T była intensywnie badana, niektóre aspekty pozostają nieznane, głównie dlatego, że dostępne narzędzia do jej badania są nieliczne i mają swoje wady. Z tej perspektywy opracowaliśmy bardzo czułą metodę cytometrii przepływowej do analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu we wczesnym okresie po szczepieniu w modelu mysim. Protokół opiera się na połączeniu barwienia Ki67 i DNA, które wcześniej było wykorzystywane do analizy cyklu komórkowego komórek krwiotwórczych BM u myszy13,14. Aby dostosować protokół do limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu, musieliśmy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kwestii, w tym wybór barwnika DNA, odpowiednie warunki do uzyskania porównywalnego barwienia DNA w różnych próbkach oraz strategię bramkowania do analizy danych.
Do barwienia DNA dostępnych jest wiele barwników, w tym jodek propidyny i 7-aminoaktynomycyna D; wybraliśmy Hoechst, ponieważ był kompatybilny z barwieniem membranowym i łagodnym protokołem utrwalania / przepuszczalności wymaganym do barwienia Ki67. Jednocześnie barwienie Hoechstem pozwoliło na uzyskanie histogramu DNA doskonałej jakości, tj. piki DNA G0/G1 i G2/M miały znacznie niższy współczynnik zmienności (CV) niż piki DNA zwykle uzyskiwane za pomocą innych barwników DNA, np. DRAQ519. Rzeczywiście, Hoechst może barwić DNA nawet w żywych komórkach20.
Zastosowano pewne strategie, aby uniknąć wahań intensywności Hoechsta w różnych próbkach tego samego eksperymentu. Barwienie metodą Hoechsta przeprowadzono tuż przed pobraniem próbki za pomocą cytometru przepływowego, aby zminimalizować spadek intensywności barwnika w czasie. Dla osób zainteresowanych odtworzeniem protokołu w dużych eksperymentach z wieloma próbkami, zalecamy wykonanie barwienia Hoechst na kilku próbkach jednocześnie. Inną wadą jest to, że intensywność Hoechsta może być silnie uzależniona od liczby komórek podczas inkubacji z barwnikiem. Z tego powodu zdecydowanie zalecamy, aby do barwienia DNA zawsze używać tej samej liczby komórek i tej samej objętości na próbkę. Jeśli do pobrania za pomocą cytometru przepływowego wymagana jest duża liczba komórek, zalecamy przygotowanie dwóch lub więcej identycznych próbek, a następnie połączenie ich tuż przed etapem barwienia Hoechsta.
Kluczowym punktem protokołu jest strategia bramkowania do analizy danych. Niedawno opublikowaliśmy nową strategię analizy limfocytów T we wczesnych okresach odpowiedzi immunologicznej, co pozwoliło nam zwiększyć czułość wykrywania limfocytów T specyficznych dla antygenu12. Zastosowaliśmy tę strategię do danych pokazanych tutaj w następujący sposób. Po pierwsze, wykluczyliśmy agregacje komórkowe na wykresie DNA-A/W. Po drugie, po bramkowaniu martwych komórek, użyliśmy dość dużej bramki limfocytów na wykresie FSC/SSC ("bramka zrelaksowana"). Dzięki tej strategii byliśmy w stanie włączyć wysoce aktywowane limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu w S-G2 / M, które zwykle są pomijane przez obecne strategie bramkowania, ponieważ komórki te mają wysokie FSC-A i SSC-A. Podsumowując, analiza danych stanowi krytyczną część metody, która jest niezbędna do uzyskania czułego wykrywania aktywowanych/proliferujących limfocytów T specyficznych dla antygenu.
Metoda zapobiega możliwości pominięcia krytycznych danych dotyczących limfocytów T we wczesnych fazach odpowiedzi immunologicznej i otwiera nowe perspektywy dla immunologicznego monitorowania limfocytów T. Przyszłym ulepszeniem może być włączenie barwienia fosfohistonem 3, które umożliwiłoby różnicowanie między G2 i M21. Obecnym ograniczeniem jest to, że komórki muszą być utrwalone i przepuszczalne, aby wybarwić marker jądrowy, Ki67. W związku z tym komórki nie mogą być używane do innych rodzajów analiz, takich jak sortowanie i późniejsza analiza funkcjonalna. Co więcej, barwniki DNA, w tym Hoechst, zwykle zakłócają analizę genomowego DNA i nie nadają się do tego typu oceny. Identyfikacja markerów błonowych, które korelują z różnymi fazami cyklu komórkowego i które mogą być barwione na żywych komórkach, może przezwyciężyć to ograniczenie. Podsumowując, metoda ta ma ogromny potencjał w ocenie aktywowanych/proliferujących limfocytów T w kilku kontekstach, takich jak szczepienia, infekcje, choroby o podłożu immunologicznym i immunoterapia.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Lymph node, spleen, bone marrow flow cytometry workflow; staining, fixation, data analysis diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Flow cytometry process diagram; lymph node and bone marrow cell staining, Ki67, DNA with Hoechst 33342." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

Naiwne limfocyty T ulegają klonalnej ekspansji i różnicowaniu po torowaniu antygenowym. Zróżnicowane limfocyty T wykazują funkcje efektorowe, które są niezbędne do usuwania antygenu i utrzymania pamięci specyficznej dla antygenu, co jest kluczem do długotrwałej ochrony. Podczas pierwszych etapów pierwotnej odpowiedzi, naiwna interakcja limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen (APC) w wyspecjalizowanych niszach w narządach limfoidalnych ma kluczowe znaczenie dla indukcji ogromnej proliferacji limfocytów T, która charakteryzuje fazę ekspansji klonalnej1,2,3. Interakcja limfocytów T z APC jest precyzyjnie regulowana przez stężenie i trwałość antygenu, sygnałów kostymulujących i rozpuszczalnych czynników (cytokin i chemokin), które wpływają na ilość i jakość potomstwa klonów limfocytów T4,5,6,7.
Pomimo intensywnych badań nad ekspansją klonalną limfocytów T, nadal nie wiadomo, czy limfocyty T z antygenem kończą cały cykl komórkowy w miejscu rozpoznania antygenu, czy też migrują do innych organów podczas progresji cyklu komórkowego. Ten brak wiedzy wynika z właściwości dostępnych narzędzi do analizy cyklu komórkowego. Należą do nich przeciwciała monoklonalne (mAb) specyficzne dla markera jądrowego Ki67 oraz barwniki komórkowe, które albo identyfikują komórki, które przeszły fazę S cyklu komórkowego (np. Bromodeoksyurydyna (BrdU)) lub rozróżniają komórki potomne i ich przodków (np. ester sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE)).
Jednak barwniki znakujące komórki, takie jak CFSE i BrdU, nie pozwalają na określenie, czy komórki znalezione w danym narządzie rozmnożyły się lokalnie, czy raczej migrowały do tego miejsca po podziale8,9. Co więcej, białko wewnątrzjądrowe, Ki67, jest w stanie odróżnić komórki tylko w G0 (komórki Ki67-ujemne) od tych w dowolnej innej fazie cyklu komórkowego (komórki Ki67-dodatnie). Tak więc analiza Ki67 nie odróżnia komórek w aktywnej proliferacji (tj. w S, G2 lub M) od tych w G1, które mogą albo szybko przejść do podziału, albo pozostać przez długi czas w G1, albo powrócić do stanu spoczynku10,11.
Tutaj opisujemy nową metodę cytometrii przepływowej do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD812 ze śledziony i węzłów chłonnych (LN) szczepionych myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Metoda wykorzystuje kombinację barwienia Ki67 i DNA, która była wcześniej używana do analizy cyklu komórkowego komórek krwiotwórczych szpiku kostnego myszy (BM)13,14. W tym przypadku z powodzeniem zastosowaliśmy barwienie Ki67 plus DNA, wraz z niedawno opublikowaną innowacyjną strategią bramkowania12, do analizy ekspansji klonalnej limfocytów T CD8. Byliśmy w stanie wyraźnie rozróżnić limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu w G0, w G1 i w fazach S-G2 / M w śledzionie i drenujących LN szczepionych myszy.

<table><tbody><tr><td>1-200 &mu; L uniwersalne końcówki do pipet pakowane luzem</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS4866-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2 anty-Fc&gamma; R mAb&nbsp;</td><td>BD</td><td>553141</td><td>10 &mu; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>5 ml tłok strzykawki</td><td>BD Szmaragd&nbsp;</td><td></td><td></td>307733</tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>MercK Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SBHA025SB</tr><tr><td>60 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtr siatkowy M&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna, mikropłytka hodowlana z powłoką TC</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353077</tr><tr><td>Ig,k/Cząstki kompensacyjne kontroli negatywnej przeciw szczurom/chomikom</td><td>BD- Bioscience</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>BUV805 Szczurzy środek przeciw myszom CD8a&nbsp;</td><td>BD- Nauki biologiczne</td><td>564920</td><td>4 &mu; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Dulbecco Sól fizjologiczna bez wapnia bez magnezu&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120159</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>34852-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Corning</td><td>35-079-CV</td><td></td></tr><tr><td>Filcon, sterylna, strzykawka typu 70 &mu; m</td><td>Sokół&nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Możliwy do utrwalenia barwnik żywotności eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>1:1000 końcowe stężenie</td></tr><tr><td>Foxp3 / zestaw barwiących czynnik transkrypcyjny</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Ten zestaw zawiera koncentrat i rozcieńczalnik do utrwalania/przepuszczalności oraz bufor permeabilacyjny 10x</td></tr><tr><td>H-2k(d) AMQMLKETI allofikocyjanin (APC)</td><td>znakowany tetramerem dostarczonym przez NIH Tetramer Core Facility</td><td></td><td>6 &mu; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>H-2k(d) AMQMLKETI fikoerytryna (PE) znakowana pentamerem</td><td>Proimmune&nbsp;</td><td>F176-2A-E - 176</td><td>10 &mu; L / próbka&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg/ml roztwór w wodzie</td><td>Przeciwciało</td> monoklonalne ThermoFisher <td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (SolA15), FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5698-82</td><td>5 &mu; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>L-Glutamina 100X (200 mM)</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtry Millex-HA 0,45 &mikro; m</td><td>BD</td><td>340606</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100X</td><td>Euroklon</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyjanina7 Przeciwciało anty-mysie CD62L</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>104418</td><td>0,2 & mu; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>PerCP-Cy&handel; 5.5 Chomik Anty-Myszy CD3e&nbsp;</td><td>BD- Nauki biologiczne</td><td>551163</td><td>4.4 &mu; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z polistyrenu okrągłodennego, 5 ml</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352058</tr><tr><td>RPMI 1640 Medium bez L-Glutaminy z Fenolem Czerwonym</td><td>Euroklonem</td><td>ECB9006L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej</td><td>FlowJo</td><td>v.10</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pobierania próbek za pomocą cytometru przepływowego</td><td>BD FACSDiva&nbsp;</td><td>v 6.2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Euroclone</td><td>ECM0990D</td><td></td></tr></tbody></table>

test cytometrii przepływowej oparty na dna/ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów t cd8 u zaszczepionych myszy

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

Cykl komórkowy limfocytów T specyficznych dla antygenu in vivo został zbadany przy użyciu kilku metod, z których wszystkie mają pewne ograniczenia. Bromodeoksyurydyna (BrdU) oznacza komórki, które są w fazie S lub niedawno zakończonej, a ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE) wykrywa komórki potomne po podziale. Jednak barwniki te nie pozwalają na identyfikację fazy cyklu komórkowego w momencie analizy. Alternatywnym podejściem jest wykorzystanie Ki67, markera, który ulega silnej ekspresji przez komórki we wszystkich fazach cyklu komórkowego z wyjątkiem fazy spoczynku G0. Niestety, Ki67 nie pozwala na dalsze różnicowanie, ponieważ nie oddziela komórek w fazie S, które są zaangażowane w mitozę, od tych w G1, które mogą pozostać w tej fazie, przejść do cyklu lub przejść do G0.
Tutaj opisujemy metodę cytometrii przepływowej do przechwytywania "migawki" limfocytów T w różnych fazach cyklu komórkowego w wtórnych narządach limfoidalnych myszy. Metoda łączy barwienie Ki67 i DNA z barwieniem głównym kompleksem zgodności tkankowej (MHC)-peptyd-multimerem oraz innowacyjną strategią bramkowania, co pozwala nam skutecznie różnicować między specyficznymi dla antygenu limfocytami T CD8 w fazach G0, G1 i S-G2/M cyklu komórkowego w śledzionie i drenujących węzły chłonne myszy po szczepieniu wektorami wirusowymi przenoszącymi modelowy antygen gag ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)-1.
Kluczowymi etapami metody były wybór barwnika DNA i strategii bramkowania, aby zwiększyć czułość testu i włączyć wysoce aktywowane/proliferujące limfocyty T specyficzne dla antygenu, które zostałyby pominięte przez obecne kryteria analizy. Barwnik DNA, Hoechst 33342, umożliwił nam uzyskanie wysokiej jakości dyskryminacji pików DNA G0/G1 i G2/M, przy jednoczesnym zachowaniu barwienia błonowego i wewnątrzkomórkowego. Metoda ta ma ogromny potencjał w zakresie poszerzenia wiedzy na temat odpowiedzi limfocytów T in vivo oraz poprawy analizy monitorowania immunologicznego.

Fazy cyklu komórkowego komórek śledziony, węzłów chłonnych (LNs) i szpiku kostnego (BM) myszy Balb/c analizowano przy użyciu fluorescencyjnego barwnika DNA, Hoechst, oraz przeciwciała mAb anty-Ki67, zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1. Barwienie to pozwoliło na rozróżnienie komórek w następujących fazach cyklu komórkowego: G0 (Ki67neg, z ilością DNA 2N zdefiniowaną jako DNAlow), G1 (Ki67pos, DNAlow) oraz S-G2/M (Ki67pos, z zawartością DNA mieszczącą się w przedziale od 2N do 4N lub równą 4N, zdefiniowaną jako DNAintermediate/high).
W pierwszej kolejności przeprowadzono analizę cyklu komórkowego komórek BM, aby powtórzyć wcześniej opublikowane wyniki13,14, a następnie przeanalizowano interesujące nas komórki, tj. limfocyty T CD8. Na Rysunku 2 przedstawiono typowy przykład analizy cyklu komórkowego komórek BM (Rysunek 2A). Protokół pozwolił uzyskać niski współczynnik zmienności (CV) dla pików DNA w fazach G0/G1 oraz G2/M, co wskazuje na doskonałą jakość barwienia DNA (Rysunek 2B, przedstawiający przykład z CV &lt; 2,5; we wszystkich eksperymentach CV wynosiło zawsze &lt; 5).
Następnie zastosowaliśmy ten sam protokół w odniesieniu do antygenowo swoistych limfocytów T CD8 od myszy zaszczepionych. Myszy BALB/c zaszczepiono przeciwko antygenowi gag wirusa HIV-1, stosując Chad3-gag do primingu oraz MVA-gag do dawki przypominającej (boosting), przy czym oba wektory zostały zmodyfikowane tak, aby przenosiły gag HIV-1. W dniu (d) 3 po dawce przypominającej przeanalizowaliśmy częstotliwość występowania limfocytów T CD8 swoistych dla gag w śledzionie oraz drenujących węzłach chłonnych (LNs). Wykorzystaliśmy nowo zdefiniowaną strategię bramkowania dla limfocytów T w wczesnej fazie odpowiedzi immunologicznej, która w przeciwieństwie do strategii konwencjonalnej jest odpowiednia do wykrywania silnie aktywowanych, odpowiadających na antygen limfocytów T CD812. Nową strategię zrealizowaliśmy w pięciu kolejnych krokach. W kroku 1 wykluczyliśmy dublety lub agregaty za pomocą bramki DNA-A/ -W, a w kroku 2 zidentyfikowaliśmy żywe komórki poprzez wykluczenie markerem komórek martwych. W kroku 3 zidentyfikowaliśmy interesującą nas populację, stosując niekonwencjonalną „rozluźnioną” bramkę FSC-A/ SSC-A (Rycina 3A) zamiast kanonicznej wąskiej bramki limfocytów12. Po bramkowaniu komórek CD3+CD8+ (krok 4 na Rycini 3A), zidentyfikowaliśmy limfocyty T CD8 swoiste dla gag, używając dwóch różnych multimerów MHC, tj. Pent-gag i Tetr-gag (krok 5 na Rycini 3A). Użyliśmy dwóch multimerów zamiast jednego, aby zwiększyć czułość wykrywania limfocytów T CD8 swoistych dla gag u myszy zaszczepionych, bez zwiększania tła barwienia u myszy nieleczonych (Rycina 3B i C, krok 5). W ten sposób pomyślnie odróżniliśmy myszy nieleczone (odpowiednio 0,00% i 0,00% antygenowo swoistych limfocytów T CD8 w węzłach chłonnych i śledzionie) od myszy zaszczepionych (odpowiednio 0,46% i 0,29% antygenowo swoistych limfocytów T CD8 w węzłach chłonnych i śledzionie, Rycina 3B i C).
Warto zaznaczyć, że protokół ten pozwolił nam uzyskać niezwykle niskie tło w bramce dla limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w węzłach chłonnych (LNs) i śledzionie myszy nieleczonych (zazwyczaj 0,00% i maksymalnie 0,02%). Porównanie wykresów FSC-A / SSC-A dla komórek specyficznych dla gag i niespecyficznych dla gag wykazało, że komórki specyficzne dla gag charakteryzowały się wysokimi wartościami SSC-A i FSC-A (Rycina 3D), co potwierdziło konieczność zastosowania „rozluźnionej” bramki FSC-A/ SSC-A w celu uchwycenia tych komórek. Następnie oceniliśmy odsetek limfocytów T CD8 specyficznych dla gag w różnych fazach cyklu komórkowego (Rycina 4A). Stwierdzono, że limfocyty T CD8 specyficzne dla gag w śledzionie, a jeszcze bardziej w drenujących LNs, zawierały wysoką proporcję komórek w fazach S-G2/M w 3. dobie po dawce przypominającej (odpowiednio 18,60% i 33,52%).
Ponadto stwierdzono, że swoiste dla białka gag limfocyty T CD8 w fazach S-G2/M charakteryzowały się wysokimi wartościami FSC-A i SSC-A po nałożeniu ich na całkowitą populację limfocytów T CD8 z tego samego narządu (Rysunek 4B). Ekspresja CD62L w swoistych dla gag limfocytach T CD8 była niska, co jest oczekiwane dla aktywowanych limfocytów T, z wyjątkiem kilku komórek w fazie G0 w węzłach chłonnych (Rysunek 4C). Podsumowując, wyniki te potwierdziły, że zastosowanie „rozluźnionego” bramkowania (krok 3 na Rysunkach 3A, B i C) było niezbędne do uwzględnienia wszystkich proliferujących swoistych dla antygenu limfocytów T CD812. Protokół ten okazał się niezwykle wartościowy do oceny „migawkowej” faz cyklu komórkowego swoistych dla antygenu limfocytów T CD8 w momencie analizy oraz ekspresji CD62L w komórkach znajdujących się w różnych fazach cyklu komórkowego.
<img alt="Schemat procesu cytometrii przepływowej przedstawiający etapy barwienia komórek i analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat protokołu analizy cyklu komórkowego antygenowo swoistych limfocytów T CD8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej przedstawiający zawartość DNA i fazy cyklu komórkowego wraz z wykresami danych z bramkowaniem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza cyklu komórkowego komórek BM. Komórki BM od nieleczonych myszy Balb/c zostały zabarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Przykład strategii bramkowania. Wykonano bramkowanie pojedynczych komórek na wykresie DNA-A/-W (lewo), a następnie żywych komórek poprzez wykluczenie barwnika do komórek martwych (środek). Następnie dla wszystkich komórek BM zastosowano „rozluźnione” bramkowanie FSC-A/SSC-A (prawo). (B) Przykład analizy cyklu komórkowego komórek BM (lewo). Wykorzystano kombinację barwienia Ki67 i DNA w celu zidentyfikowania komórek w następujących fazach cyklu komórkowego: G0 (lewy dolny kwadrant, komórki Ki67neg-DNAlow), G1 (lewy górny kwadrant, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (prawy górny kwadrant, Ki67pos-DNAintermediate/high). Przedstawiono kontrolę Fluorescence Minus One (FMO) dla przeciwciała mAb przeciwko Ki67 (środek) oraz histogram DNA (prawo). Na wykresie histogramu DNA lewa i prawa bramka odpowiadają odpowiednio piku DNA dla fazy G0/G1 oraz G2/M, a liczby reprezentują współczynniki zmienności (CV) każdego piku. Na wszystkich pozostałych wykresach liczby reprezentują procent komórek w zaznaczonych bramkach. Rycina przedstawia 1 reprezentatywny eksperyment z 5 przeprowadzonych. W każdym eksperymencie analizowano połączone komórki BM od 3 myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Cytometria przepływowa, limfocyty T CD8, limfocyty, szczepienie, komórki specyficzne dla gag, analiza danych, wykresy kropkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza antygenowo-specyficznych limfocytów T CD8 z węzłów chłonnych (WN) i śledziony. Myszy Balb/c poddano immunizacji pierwotnej domięśniowo (i.m.) preparatem Chad3-gag, a następnie dawce przypominającej i.m. preparatem MVA-gag. W 3. dobie po dawce przypominającej komórki z drenujących WN i śledziony myszy zaszczepionych oraz myszy kontrolnych nieleczonych zostały znakowane i analizowane metodą cytometrii przepływowej. (A) Schemat strategii bramkowania w pięciu krokach w celu identyfikacji pojedynczych komórek (Krok 1); żywych komórek (Krok 2); limfocytów (Krok 3); limfocytów T CD8 (Krok 4) oraz komórek specyficznych dla gag (Krok 5). (B-C) Przykładowe wykresy: analiza komórek z (B) WN i (C) śledziony myszy nieleczonych (góra) i zaszczepionych (dół). W Kroku 1 zidentyfikowano pojedyncze komórki na wykresie DNA-A/ -W. Następnie, w Kroku 2, wyselekcjonowano żywe komórki poprzez wykluczenie barwnika dla martwych komórek. W Kroku 3 zastosowano niekanoniczną, „rozluźnioną” bramkę dla limfocytów. W Kroku 4 zidentyfikowano limfocyty T CD8 na podstawie podwójnej ekspresji CD3 i CD8. W Kroku 5 zidentyfikowano komórki specyficzne dla gag oraz niespecyficzne dla gag, na podstawie ich zdolności (lub jej braku) do wiązania znakowanego fluorochromem H-2kd-gag-Pentameru (Pent-gag) i H-2kd-gag-Tetrameru (Tetr-gag). (D) Profile FSC-A/SSC-A komórek specyficznych dla gag (niebieskie) i niespecyficznych dla gag (szare) po bramkowaniu opisanym powyżej. Liczby reprezentują procenty komórek w wskazanych bramkach. Rysunek przedstawia 1 reprezentacyjny eksperyment z 5 przeprowadzonych. W każdym eksperymencie analizowano połączone próbki komórek ze śledziony i WN od 3 myszy zaszczepionych i 3 myszy nieleczonych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej przedstawiająca fazy cyklu komórkowego w węzłach chłonnych i śledzionie; wyniki wykresów Ki67, DNA-A." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8. Myszy zaszczepiono zgodnie z opisem na Rycina 3, a analizę cyklu komórkowego komórek specyficznych dla białka gag przeprowadzono w 3. dniu po dawce przypominającej, po bramkowaniu w 5 krokach, tak jak na Rycina 3. (A) Przykład analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8 specyficznych dla białka gag z węzłów chłonnych (góra) i śledziony (dół) zaszczepionych myszy. Fazy cyklu komórkowego zidentyfikowano zgodnie z Rycina 2B. Panele przedstawiają komórki w fazie G0, w fazie G1 oraz w fazach S-G2/M (lewo) oraz kontrolę Fluorescence Minus One (FMO) dla przeciwciała mAb przeciwko Ki67 (prawo). Liczby oznaczają procenty komórek w wskazanych bramkach. (B) Wykresy kropkowe FSC-A/SSC-A przedstawiające limfocyty T CD8 specyficzne dla białka gag w fazach S-G2/M (na czerwono) nałożone na całkowitą populację limfocytów T CD3+CD8+ (na szaro) z węzłów chłonnych (góra) i śledziony (dół) zaszczepionych myszy. (C) Przesunięte histogramy przedstawiające ekspresję CD62L przez limfocyty T CD8 specyficzne dla białka gag w fazie G0 (zielony), w fazie G1 (niebieski) oraz w fazach S-G2/M (czerwony) z węzłów chłonnych (góra) i śledziony (dół) zaszczepionych myszy. Osie Y wskazują znormalizowaną liczbę zdarzeń. Rycina przedstawia 1 reprezentatywny przykład z 5 niezależnych eksperymentów z udziałem łącznie 15 myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Materiały uzupełniające: Ustawienia cytometru przepływowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ekspansja klonalna jest kluczową cechą odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu. Jednak cykl komórkowy limfocytów T reagujących na antygen został słabo zbadany, częściowo z powodu ograniczeń technicznych. Opisujemy metodę cytometrii przepływowej do analizy klonalnie rozszerzających się limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w śledzionie i węzłach chłonnych szczepionych myszy.

Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Nasz protokół zapewnia praktyczne podejście, dzięki któremu śledziona i węzły chłonne myszy mogą być wykorzystane do odzwierciedlenia dynamiki odpowiedzi limfocytów T większej niż zapewnienie migawki fenotypowej w stanie ustalonym. Nasza technika z czułością wykrywa specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8, które są zaangażowane w ciągłą odpowiedź. Proliferujące limfocyty T CD8 są mierzone bez możliwych zakłócających skutków leczenia farmakologicznego in vivo lub transferu komórek.Nasza technika może zapewnić okno na dynamikę immunologiczną w kilku ustawieniach. Na przykład w odniesieniu do odpowiedzi na szczepienia i infekcje, choroby autoimmunologiczne i immunoterapię nowotworów. Przygotuj świeży 1x bufor do przemywania permeabilizacji, rozcieńczając 10x bufor permeabilizacji wodą destylowaną i przefiltruj go przez filtr 0,45 mikrometra w celu wyeliminowania agregatów.Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne Ki67 FITC w 1x permeabilizacyjnym buforze do płukania, jak oznaczono w doświadczeniu miareczkowania dla końcowej objętości 100 mikrolitrów na próbkę. Dodać 3 mililitry 1x buforu do przemywania permeabilizacji do każdej probówki z komórkami i odwirować przy 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.Ponownie dodaj 1x bufor do płukania permeabilizacji i odwirówkę, aby osadzać komórki. Następnie odrzucić supernatant. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała monoklonalnego Ki67 FITC do osadu, a następnie wirować i inkubować przez 30 minut w ciemności.Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 4 mililitrami 1x buforu przepuszczalnego, odwirować po każdym przemyciu i wyrzucić supernatant. Dodać 350 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego w przypadku próbek, które mają być pobrane bezpośrednio w cytometrze przepływowym i 250 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego w przypadku próbek, które mają być inkubowane z Hoechstem w celu barwienia DNA. Przygotować roztwór Hoechsta i PBS i dodać go do każdej próbki, tak aby końcowe stężenie wynosiło dwa mikrogramy na mililitr.Wirować i inkubować próbki przez 15 minut w ciemności. Następnie odwiruj próbki przez pięć minut i dodaj 350 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego. Otwórz oprogramowanie i utwórz różne grupy odpowiadające różnym narządom, które mają być analizowane, klikając Utwórz grupę"w sekcji wstążki obszaru roboczego.Otwórz okno zmodyfikowanej grupy, klikając dwukrotnie nazwę grupy i zsynchronizuj nowo utworzone grupy, wstawiając znacznik wyboru na synchronizowanej funkcji. Przeciągnij każdy plik FCS do odpowiadającej mu grupy, a następnie utwórz strategię bramkowania, zaczynając od grupy a-LN. Otwórz okno wykresu, klikając dwukrotnie w pełni wybarwioną próbkę, aby wyświetlić niezmienione zdarzenia uzyskane dla próbki na wykresie kropkowym.Należy zauważyć, że osie x i y są oznaczone tak, jak w plikach FCS, jak wskazano w drugiej tabeli pliku ustawień cytometru przepływowego w tym manuskrypcie. Sprawdź, czy wyświetlana jest wystarczająca liczba zdarzeń do odpowiedniej wizualizacji. W razie potrzeby otwórz preferencje, klikając ikonę serca na wstążce obszaru roboczego, wybierz Wykresy, a następnie Wykres punktowy"jako typ wykresu i sprawdź, czy liczba kropek narysowanych w odpowiednim polu jest poprawna lub zmień ją.Wyświetl zdarzenia nieobjęte w oknie wykresu na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i DNA-W na osi y. Użyj skali liniowej dla obu osi. W razie potrzeby zmień skalę z logarytmicznej na liniową, klikając pole oznaczone literą T w pobliżu każdej osi w oknie wykresu.Wybierz populację pojedynczych komórek, klikając prostokąt w sekcji narzędzia do bramkowania, a następnie kliknij dwukrotnie na środku prostokątnej bramki, aby wyświetlić pojedyncze komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i kością martwej komórki na osi y. Kliknij wielokąt, aby wybrać populację żywych komórek, które są ujemne dla kości martwej komórki. Kliknij dwukrotnie środek bramki wielokątnej, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i parametrem SSC-A na osi y.Kliknij prostokąt i utwórz zrelaksowaną bramę, aby uwzględnić wszystkie pojedyncze żywe komórki na tym wykresie. Kliknij dwukrotnie na środku rozluźnionej bramki, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z CD3 na osi x i CD8 na osi y. Użyj odpowiedniej skali dostępu do wizualizacji w oknie wykresu.W razie potrzeby zmodyfikuj skalę x i y, klikając pole oznaczone literą T w pobliżu każdej osi, wybierz Dostosuj funkcję dostępu i w razie potrzeby zmodyfikuj dodatkowe dekady ujemne za pomocą podstaw i dodatnich dekad. Wybierz komórki CD3 + CD8 +, klikając wielokąt. Kliknij dwukrotnie na środku bramki CD3 + CD8 +, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z Tetr-gag na osi x i Pent-gag na osi y.Wybierz limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu, klikając wielokąt. Kliknij dwukrotnie na środku bramki specyficznej dla knebla, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y. Wybierz komórki w różnych fazach cyklu komórkowego, klikając Quad"w sekcji narzędzia do bramkowania w oknie wykresu.Skopiuj strategię bramkowania utworzoną w jednej próbce do odpowiedniej grupy, aby zastosować bramki do wszystkich próbek w grupie. Następnie skopiuj strategie bramkowania dla grup b-śledziony i CBM, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Sprawdzić, czy wszystkie bramki są odpowiednie dla każdej próbki z trzech grup.W razie potrzeby zdesynchronizuj grupę i zmodyfikuj bramki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wyświetl komórki BM zrelaksowanej bramki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y. Wizualizuj wyniki, klikając Edytor układu" w sekcji wstążki przestrzeni roboczej.Przeciągnij każdą bramę strategii bramkowania w okienku próbki do edytora układu i umieść wykresy zgodnie z sekwencją bramkowania. W razie potrzeby należy zmienić typ wykresu, klikając dwukrotnie odpowiedni wykres w układzie i wybierając odpowiedni typ w oknie definicji wykresu. Kliknij grupę i iteruj według funkcji na wstążce układu, aby wyświetlić wyniki uzyskane w specyficznych dla antygenu limfocytach T CD8 z każdego narządu i porównać różne próbki.Wizualizacja wyników komórek szpiku kostnego reprezentujących kontrolę pozytywną. Typowy przykład analizy cyklu komórkowego komórek szpiku kostnego przedstawiono tutaj. Protokół wykazał niski współczynnik zmienności pików DNA G0 do G1 i G2 do M, co wskazuje na doskonałą jakość barwienia DNA.Zastosowano pięcioetapową strategię bramkowania w celu identyfikacji komórek CD8 specyficznych dla antygenu. Dwa multimery zastosowano w celu poprawy czułości wykrywania specyficznych dla gagu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy bez zwiększania tła barwienia u myszy nieleczonych. Limfocyty T CD8 specyficzne dla gag w drenujących węzłach chłonnych i śledzionie zawierają dużą część komórek w fazach S-G2 / M w trzecim dniu po wzmocnieniu.Co więcej, specyficzne dla gag limfocyty T CD8 w fazach S-G2 / M miały wysoki poziom FSC-A i SSC-A po nałożeniu na całkowite limfocyty T CD8 z tego samego narządu. Histogramy przesunięcia wykazały, że ekspresja CD62L przez limfocyty T CD8 specyficzne dla gagu była niska, zgodnie z oczekiwaniami dla aktywowanych limfocytów T, z wyjątkiem kilku komórek w G0 w węzłach chłonnych. Metoda ta jest przeznaczona dla limfocytów T w celu uzyskania doskonałej jakości barwienia DNA wraz z błoną i barwieniem Ki67.Kluczowym punktem jest analiza danych cytometrii przepływowej. Upewnij się, że używasz odpowiedniego sterowania do ustawiania bramy. Za pomocą tej metody odkryliśmy limfocyty T w fazach cyklu komórkowego S-G2/M w krwi obwodowej myszy i człowieka.Technika ta była przydatna w badaniach nad monitorowaniem immunologicznym w cukrzycy typu 1, mononukleozie zakaźnej i COVID-19.

a-dnaki67-based-flow-cytometry-assay-for-cell-cycle-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy użyteczność wielokolorowej cytometrii przepływowej w szczegółowej charakterystyce fenotypowej i funkcjonalnej całkowitych populacji, a także podzbiorów komórek pamięci limfocytów T CD4+ i CD8+ u makaków rhesus, które stanowią idealny model w badaniach nad szczepionkami przeciwko HIV/AIDS.

Wielokolorowe analizy cytometryczne odpowiedzi immunologicznej komórkowej u makaków rezus

W tym filmie demonstrujemy technikę opartą na cytometrii przepływowej, aby określić proporcję indukowanych przez cytokiny limfocytów T, komórek CIK, rozwiniętych z hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.

Rozpoznawanie markerów CD ludzkich komórek zabójczych indukowanych cytokinami za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje test do analizy specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ na różnych etapach cyklu komórkowego. Znakowane fluorescencyjnie żywe komórki są wybierane za pomocą cytometrii przepływowej, a komórki na różnych etapach cyklu komórkowego są identyfikowane na podstawie zawartości DNA przy użyciu przeciwciał przeciwko białku jądrowemu związanemu z proliferacją komórek i barwienia kwasem nukleinowym.

Test do analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.

Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do analizy cyklu komórkowego antygenowo-specyficznych limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy. Technika wykorzystuje barwienie DNA i Ki67 do badania dynamiki odpowiedzi immunologicznej.

Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy

Przeglądaj więcej filmów