Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy
5 stycznia 2021
Ekspansja klonalna jest kluczową cechą odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu. Jednak cykl komórkowy limfocytów T reagujących na antygen został słabo zbadany, częściowo z powodu ograniczeń technicznych. Opisujemy metodę cytometrii przepływowej do analizy klonalnie rozszerzających się limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w śledzionie i węzłach chłonnych szczepionych myszy.
Nasz protokół zapewnia praktyczne podejście, dzięki któremu śledziona i węzły chłonne myszy mogą być wykorzystane do odzwierciedlenia dynamiki odpowiedzi limfocytów T większej niż zapewnienie migawki fenotypowej w stanie ustalonym. Nasza technika z czułością wykrywa specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8, które są zaangażowane w ciągłą odpowiedź. Proliferujące limfocyty T CD8 są mierzone bez możliwych zakłócających skutków leczenia farmakologicznego in vivo lub transferu komórek.
Nasza technika może zapewnić okno na dynamikę immunologiczną w kilku ustawieniach. Na przykład w odniesieniu do odpowiedzi na szczepienia i infekcje, choroby autoimmunologiczne i immunoterapię nowotworów. Przygotuj świeży 1x bufor do przemywania permeabilizacji, rozcieńczając 10x bufor permeabilizacji wodą destylowaną i przefiltruj go przez filtr 0,45 mikrometra w celu wyeliminowania agregatów.
Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne Ki67 FITC w 1x permeabilizacyjnym buforze do płukania, jak oznaczono w doświadczeniu miareczkowania dla końcowej objętości 100 mikrolitrów na próbkę. Dodać 3 mililitry 1x buforu do przemywania permeabilizacji do każdej probówki z komórkami i odwirować przy 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
Ponownie dodaj 1x bufor do płukania permeabilizacji i odwirówkę, aby osadzać komórki. Następnie odrzucić supernatant. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała monoklonalnego Ki67 FITC do osadu, a następnie wirować i inkubować przez 30 minut w ciemności.
Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 4 mililitrami 1x buforu przepuszczalnego, odwirować po każdym przemyciu i wyrzucić supernatant. Dodać 350 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego w przypadku próbek, które mają być pobrane bezpośrednio w cytometrze przepływowym i 250 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego w przypadku próbek, które mają być inkubowane z Hoechstem w celu barwienia DNA. Przygotować roztwór Hoechsta i PBS i dodać go do każdej próbki, tak aby końcowe stężenie wynosiło dwa mikrogramy na mililitr.
Wirować i inkubować próbki przez 15 minut w ciemności. Następnie odwiruj próbki przez pięć minut i dodaj 350 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego. Otwórz oprogramowanie i utwórz różne grupy odpowiadające różnym narządom, które mają być analizowane, klikając Utwórz grupę"w sekcji wstążki obszaru roboczego.
Otwórz okno zmodyfikowanej grupy, klikając dwukrotnie nazwę grupy i zsynchronizuj nowo utworzone grupy, wstawiając znacznik wyboru na synchronizowanej funkcji. Przeciągnij każdy plik FCS do odpowiadającej mu grupy, a następnie utwórz strategię bramkowania, zaczynając od grupy a-LN. Otwórz okno wykresu, klikając dwukrotnie w pełni wybarwioną próbkę, aby wyświetlić niezmienione zdarzenia uzyskane dla próbki na wykresie kropkowym.
Należy zauważyć, że osie x i y są oznaczone tak, jak w plikach FCS, jak wskazano w drugiej tabeli pliku ustawień cytometru przepływowego w tym manuskrypcie. Sprawdź, czy wyświetlana jest wystarczająca liczba zdarzeń do odpowiedniej wizualizacji. W razie potrzeby otwórz preferencje, klikając ikonę serca na wstążce obszaru roboczego, wybierz Wykresy, a następnie Wykres punktowy"jako typ wykresu i sprawdź, czy liczba kropek narysowanych w odpowiednim polu jest poprawna lub zmień ją.
Wyświetl zdarzenia nieobjęte w oknie wykresu na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i DNA-W na osi y. Użyj skali liniowej dla obu osi. W razie potrzeby zmień skalę z logarytmicznej na liniową, klikając pole oznaczone literą T w pobliżu każdej osi w oknie wykresu.
Wybierz populację pojedynczych komórek, klikając prostokąt w sekcji narzędzia do bramkowania, a następnie kliknij dwukrotnie na środku prostokątnej bramki, aby wyświetlić pojedyncze komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i kością martwej komórki na osi y. Kliknij wielokąt, aby wybrać populację żywych komórek, które są ujemne dla kości martwej komórki. Kliknij dwukrotnie środek bramki wielokątnej, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i parametrem SSC-A na osi y.
Kliknij prostokąt i utwórz zrelaksowaną bramę, aby uwzględnić wszystkie pojedyncze żywe komórki na tym wykresie. Kliknij dwukrotnie na środku rozluźnionej bramki, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z CD3 na osi x i CD8 na osi y. Użyj odpowiedniej skali dostępu do wizualizacji w oknie wykresu.
W razie potrzeby zmodyfikuj skalę x i y, klikając pole oznaczone literą T w pobliżu każdej osi, wybierz Dostosuj funkcję dostępu i w razie potrzeby zmodyfikuj dodatkowe dekady ujemne za pomocą podstaw i dodatnich dekad. Wybierz komórki CD3 + CD8 +, klikając wielokąt. Kliknij dwukrotnie na środku bramki CD3 + CD8 +, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z Tetr-gag na osi x i Pent-gag na osi y.
Wybierz limfocyty T CD8 specyficzne dla antygenu, klikając wielokąt. Kliknij dwukrotnie na środku bramki specyficznej dla knebla, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y. Wybierz komórki w różnych fazach cyklu komórkowego, klikając Quad"w sekcji narzędzia do bramkowania w oknie wykresu.
Skopiuj strategię bramkowania utworzoną w jednej próbce do odpowiedniej grupy, aby zastosować bramki do wszystkich próbek w grupie. Następnie skopiuj strategie bramkowania dla grup b-śledziony i CBM, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Sprawdzić, czy wszystkie bramki są odpowiednie dla każdej próbki z trzech grup.
W razie potrzeby zdesynchronizuj grupę i zmodyfikuj bramki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wyświetl komórki BM zrelaksowanej bramki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y. Wizualizuj wyniki, klikając Edytor układu" w sekcji wstążki przestrzeni roboczej.
Przeciągnij każdą bramę strategii bramkowania w okienku próbki do edytora układu i umieść wykresy zgodnie z sekwencją bramkowania. W razie potrzeby należy zmienić typ wykresu, klikając dwukrotnie odpowiedni wykres w układzie i wybierając odpowiedni typ w oknie definicji wykresu. Kliknij grupę i iteruj według funkcji na wstążce układu, aby wyświetlić wyniki uzyskane w specyficznych dla antygenu limfocytach T CD8 z każdego narządu i porównać różne próbki.
Wizualizacja wyników komórek szpiku kostnego reprezentujących kontrolę pozytywną. Typowy przykład analizy cyklu komórkowego komórek szpiku kostnego przedstawiono tutaj. Protokół wykazał niski współczynnik zmienności pików DNA G0 do G1 i G2 do M, co wskazuje na doskonałą jakość barwienia DNA.
Zastosowano pięcioetapową strategię bramkowania w celu identyfikacji komórek CD8 specyficznych dla antygenu. Dwa multimery zastosowano w celu poprawy czułości wykrywania specyficznych dla gagu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy bez zwiększania tła barwienia u myszy nieleczonych. Limfocyty T CD8 specyficzne dla gag w drenujących węzłach chłonnych i śledzionie zawierają dużą część komórek w fazach S-G2 / M w trzecim dniu po wzmocnieniu.
Co więcej, specyficzne dla gag limfocyty T CD8 w fazach S-G2 / M miały wysoki poziom FSC-A i SSC-A po nałożeniu na całkowite limfocyty T CD8 z tego samego narządu. Histogramy przesunięcia wykazały, że ekspresja CD62L przez limfocyty T CD8 specyficzne dla gagu była niska, zgodnie z oczekiwaniami dla aktywowanych limfocytów T, z wyjątkiem kilku komórek w G0 w węzłach chłonnych. Metoda ta jest przeznaczona dla limfocytów T w celu uzyskania doskonałej jakości barwienia DNA wraz z błoną i barwieniem Ki67.
Kluczowym punktem jest analiza danych cytometrii przepływowej. Upewnij się, że używasz odpowiedniego sterowania do ustawiania bramy. Za pomocą tej metody odkryliśmy limfocyty T w fazach cyklu komórkowego S-G2/M w krwi obwodowej myszy i człowieka.
Technika ta była przydatna w badaniach nad monitorowaniem immunologicznym w cukrzycy typu 1, mononukleozie zakaźnej i COVID-19.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę cytometrii przepływowej do analizy klonalnie rozszerzających się antygenowo specyficznych limfocytów T CD8 w śledzionie i węzłach chłonnych szczepionych myszy. Technika ta pozwala na wykrycie odpowiedzi limfocytów T bez zakłócającego wpływu leczenia lekami in vivo lub transferu komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Cytometria przepływowa
- Biologia limfocytów T
Wprowadzenie
- Ekspansja klonalna jest kluczowa dla swoistych antygenowo odpowiedzi limfocytów T.
- Cykl komórkowy odpowiadających limfocytów T był słabo zbadany ze względu na wyzwania techniczne.
- Zrozumienie dynamiki limfocytów T jest niezbędne dla uzyskania wiedzy na temat odpowiedzi immunologicznej.
- Niniejsze badanie odpowiada na potrzebę opracowania metody analizy odpowiedzi limfocytów T w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Opracowanie metody analizy antygenowo swoistych limfocytów T CD8 in vivo.
- Zapewnienie wglądu w proliferację limfocytów T podczas odpowiedzi immunologicznej.
- Umożliwienie badania dynamiki limfocytów T w różnych kontekstach immunologicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie świeżego buforu do przemywania i permeabilizacji do barwienia komórek.
- Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego Ki67 FITC do wykrywania proliferujących limfocytów T.
- Analiza cytometryczna w celu oceny populacji limfocytów T i ich stanów aktywacji.
- Strategie bramkowania w celu wyizolowania CD8+ limfocytów T swoistych dla antygenu z populacji mieszanych.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie wykrywa swoiste dla antygenu limfocyty T CD8 uczestniczące w aktywnych odpowiedziach immunologicznych.
- Proliferację limfocytów T CD8 można mierzyć precyzyjnie, bez wpływu zmiennych zakłócających.
- Technika ta pozwala na poznanie dynamiki limfocytów T podczas szczepień i infekcji.
- Wyniki wykazują użyteczność tej metody w badaniu chorób autoimmunologicznych oraz immunoterapii nowotworów.
Wnioski
- Opracowana metoda cytometrii przepływowej jest skuteczna w analizie odpowiedzi limfocytów T.
- Podejście to pozwala na lepsze zrozumienie dynamiki odporności w różnych warunkach.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do analizy zachowania limfocytów T w stanach zdrowia i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną kwantyfikację proliferacji swoistych dla antygenu limfocytów T CD8 in vivo, wypełniając istotną lukę w immunomonitoringu podczas rozwoju szczepionek i immunoterapii. Dzięki rozróżnianiu faz G0, G1 oraz S-G2/M, bez polegania na analogach nukleotydów lub rozcieńczaniu barwnika, zapewnia ona mechanistyczny obraz dynamiki ekspansji klonalnej. Wspiera to walidację celu i identyfikację wiodących kandydatów poprzez powiązanie oddziaływania antygenu z funkcjonalnymi stanami proliferacyjnymi w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację swoistości antygenowej z progresją cyklu komórkowego w odpowiadających limfocytach T.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny odczyt z cytometrii przepływowej dla funkcjonalnej walidacji celu, niezależnie od ograniczeń związanych z BrdU lub CFSE.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka poprzez ilościowe określenie proporcji swoistych dla antygenu limfocytów T w fazie mitozy w stosunku do tych w fazach G1 lub G0.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość analizy: Generuje standaryzowane, ilościowe wyniki (DNA-A vs Ki67) odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewu kandydatów na szczepionki lub immunomodulatorów.
- Reprodukowalność: Wykorzystuje Hoechst 33342 do wysokorozdzielczego rozróżniania pików DNA, zapewniając spójną separację faz G0/G1 i G2/M we wszystkich próbkach.
- Skalowalność: Kompatybilna z analizą wielu organów (śledziona, węzły chłonne, szpik kostny) i możliwa do dostosowania do gatunków przedklinicznych w celu porównania międzybadawczego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Związek z chorobą: Metoda ma zastosowanie w badaniach nad skutecznością szczepionek, co wykazano u myszy szczepionych wektorem HIV-gag, u których zaobserwowano wzbogacenie frakcji S-G2/M w antygenowo swoistych limfocytach T CD8.
- Ciągłość translacyjna: Stanowi pomost między fazą odkrycia a fazą przedkliniczną, zapewniając rozdzielczo kinetyczny pomiar ekspansji limfocytów T, który pozwala przewidzieć wielkość odpowiedzi immunologicznej.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Umożliwia ustalenie kryteriów go/no-go w oparciu o kinetykę proliferacji klonów antygenowo swoistych, co zmniejsza zależność wyłącznie od końcowych markerów fenotypowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesną ocenę zdolności proliferacyjnej limfocytów T po immunizacji oraz wspomagając optymalizację wiodących kandydatów poprzez funkcjonalne profilowanie immunologiczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez powiązanie rozpoznawania antygenu (za pomocą multimeru MHC) ze stanem cyklu komórkowego, co pozwala wyjaśnić, czy oddziaływanie to napędza proliferację, czy anergię.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych danych o rozkładzie cyklu komórkowego, co umożliwia porównanie platform szczepionkowych lub efektów adiuwantów na ekspansję limfocytów T.
- Analityka: Generuje wieloparametryczne odczyty (zawartość DNA, Ki67, rozproszenie, specyficzność antygenowa), umożliwiając statystyczne porównanie wskaźników proliferacyjnych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z walidacją przedkliniczną poprzez identyfikację aktywowanych, cyklujących subpopulacji limfocytów T, które korelują z odpornością ochronną w modelach infekcji i nowotworów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Tworzy wielokrotnego użytku platformę immunomonitoringu do badań podłużnych w ramach projektów dotyczących chorób autoimmunologicznych, chorób zakaźnych i immunoonkologii.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez rozwiązanie problemu heterogeniczności proliferacyjnej w obrębie populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację dzięki stałej strategii bramkowania oraz barwieniu DNA z użyciem Hoechst, minimalizując zmienność między analizami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów immunomodulacyjnych na podstawie funkcjonalnej kinetyki limfocytów T.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowanie rozwoju do poziomu ryzyka poprzez kwantyfikację frakcji proliferacyjnej limfocytów T specyficznych dla antygenu jako biomarkera jakości odpowiedzi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w wielokolorowej cytometrii przepłyewej, w tym w zakresie kontroli kompensacji dla sygnałów FITC-Ki67 i Hoechst.
- Niezbędny jest dostęp do cytometru przepływowego z możliwością wzbudzenia UV dla detekcji Hoechst 33342 oraz odpowiednimi zestawami filtrów.
- Wymagane są standaryzowane protokoły permeabilizacji i przemywania w celu zachowania integralności epitopów Ki67, multimerów oraz markerów powierzchniowych.
- Konieczna jest optymalizacja stężenia Hoechst (2 µg/mL) i czasu inkubacji, aby uniknąć cytotoksyczności przy jednoczesnym uzyskaniu optymalnej rozdzielczości piku DNA.
- Kluczowe jest zastosowanie właściwej hierarchii bramkowania, rozpoczynając od wykluczenia dubletów i komórek martwych, aby zapewnić dokładną identyfikację limfocytów T specyficznych dla antygenu.
