Name: Ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej poprzez monitorowanie fenologiczne, zapylanie ręczne, mikroskopię fluorescencyjną i genotypowanie molekularne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę określania wymagań zapylania śliwki japońskiej łączącą zapylanie polowe i laboratoryjne z mikroskopią fluorescencyjną oraz genotypowaniem PCR. Technika ta pozwala identyfikować efektywne zapylacze dla odmian samoniezgodnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 i RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón – Europejski Fundusz Społeczny, Unia Europejska (Grupo Consolidado A12-17R) oraz Junta de Extremadura – Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero był wspierany przez stypendium Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología z Meksyku (CONACYT, 471839).

1. Ręczne zapylanie na polu
<ol>
	<li>Ekstrakcja pyłku
	<ol>
		<li>Aby uzyskać pyłek, zbierz pąki kwiatowe na etapie D24, zgodnie z etapem 57 w skali BBCH25,26. 
		UWAGA: Śliwka japońska potrzebuje więcej pąków kwiatowych niż u innych gatunków Prunus, ponieważ ich pylniki wytwarzają mniej pyłku.</li>
		<li>Usuń pylniki za pomocą siatki z tworzywa sztucznego (rozmiar porów 2 mm x 2 mm) i umieść je na papierze w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aż do rozejścia się pylników.</li>
		<li>Przesiać ziarna pyłku przez drobne oczka (pory o wymiarach 0,26 mm x 0,26 mm) i przechowywać je w szklanej probówce o pojemności 10 ml z nakrętką w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapylanie wykastrowanych kwiatów
	<ol>
		<li>Gdy od 10% do 20% kwiatów jest otwartych, wybierz i oznacz kilka gałęzi. Usuń otwarte kwiaty i młode pąki, pozostawiając tylko pąki kwiatowe na etapie D24, zgodnie z etapem 57 na skali BBCH25,26.</li>
		<li>Usuń płatki, działki kielicha i pręciki od 800 do 1,000 pąków kwiatowych na zabieg za pomocą paznokci lub pęsety.</li>
		<li>Słupki należy zapylać ręcznie za pomocą drobnego pędzla 24 godziny po wykastrowaniu. Niektóre gałęzie zawierające połowę słupków z pyłkiem tej samej odmiany, a drugą połowę z kompatybilnym pyłkiem innej odmiany jako kontrolą. Uważaj, aby nie zanieczyścić opuszka palca lub pędzla ziarnami pyłku innych odmian</li>.
		<li>Rejestruj tygodniową liczbę kwiatów i rozwijających się owoców, aby scharakteryzować wzór opadania owoców i określić ilościowo końcowy zestaw owoców w każdym zabiegu zapylania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzupełniające zapylanie w terenie
	<ol>
		<li>Na kilka dni przed otwarciem pierwszych kwiatów należy zamknąć wybrane drzewa w klatce o oczkach 0,8 mm, aby uniknąć przylotu owadów zapylających.</li>
		<li>Gdy 10%-20% kwiatów jest otwartych, wybierz i oznacz kilka gałęzi na zabieg zapylania, pozostawiając 1,000-1,500 kwiatów na zabieg.</li>
		<li>Następnego dnia, gdy kwiaty są otwarte, zapyl każdy kwiat za pomocą pędzla odpowiednim pyłkiem (pyłek z tej samej odmiany do samozapylenia oraz z innych kompatybilnych odmian jako kontrola zapylenia krzyżowego).</li>
		<li>Zapylaj co drugi dzień, aż wszystkie kwiaty się otworzą.</li>
		<li>Rejestruj tygodniową liczbę kwiatów i rozwijających się owoców od fazy zapylania do zbioru, aby scharakteryzować wzór opadania owoców i określić ilościowo końcowy zestaw owoców w każdym zabiegu zapylania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zapylanie rąk w laboratorium
<ol>
	<li>Zbierz 50–100 kwiatów na etapie D24, zgodnie z etapem 57 w skali BBCH25,26.</li>
	<li>W laboratorium wykastruj 30 kwiatów na zabieg (samozapylenie i zapylenie krzyżowe). 
	UWAGA: Kastracja powinna być prowadzona ostrożnie, aby uniknąć uszkodzeń słupków.</li>
	<li>Wykonaj świeże nacięcie na podstawie każdej szypułki kwiatowej pod wodą przed umieszczeniem jej na kawałku mokrej pianki florystycznej (jeden kawałek pianki na każdy zabieg zapylania).</li>
	<li>Każdy słupek należy zapylać ręcznie 24 godziny później za pomocą cienkiego pędzla zebranym wcześniej pyłkiem (patrz punkt 1.1). Jeden zestaw słupków zapylić pyłkiem tej samej odmiany, a drugi zestaw pyłkiem z kompatybilnej odmiany jako kontrolą.</li>
	<li>Zapylone słupki pozostawić 72 godziny po zapyleniu w temperaturze pokojowej. Piana florystyczna powinna być stale zwilżona wodą.</li>
	<li>Utrwalić słupki w roztworze utrwalającym etanolu/kwasu octowego (3:1) przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C. Zastąpić utrwalacz 75% etanolem. Próbki można przechowywać w tym roztworze w temperaturze 4 °C do momentu użycia27. 
	UWAGA: Upewnij się, że próbki są całkowicie zanurzone w roztworze.</li>
</ol>
3. Obserwacje mikroskopowe
<ol>
	<li>Ocena kiełkowania pyłku in vitro
	<ol>
		<li>Aby opracować pożywkę do kiełkowania pyłku, rozpuść 25 g sacharozy w 250 ml wody destylowanej, a następnie dodaj 0,075 g azotanu wapnia [Ca(NO3)2] i 0,075 g kwasu borowego (H3BO3).</li>
		<li>Dodaj 2 g agaru do roztworu i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia28.</li>
		<li>Aby wysterylizować pożywkę, należy ją sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut. Schłodzić pożywkę i przed zestaleniem rozprowadzić 3 ml na sterylną szalkę Petriego (55 mm x 12 mm) w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Po zestaleniu w podłożu szalki Petriego zawinięte w folię aluminiową przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
		<li>Pyłek każdej odmiany uprzednio użytej jako dawca pyłku w kontrolowanych zapyleniach należy rozsiać na dwóch szalkach Petriego i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny 
		UWAGA: Zaszczepione pożywki hodowlane można obserwować pod mikroskopem natychmiast po użyciu lub przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. W tym celu szalki Petriego należy przestawić z zamrażarki do lodówki na 24 godziny przed obserwacjami mikroskopowymi.</li>
		<li>Aby obserwować ziarna pyłku, przygotuj 1% (v/v) roztwór błękitu anilinowego, który barwi modzelę. Najpierw przygotować 0,1 N roztwór trójzasadowego fosforanu potasu (K3PO4), rozpuszczając 7,97 gK3PO4 w 1000 ml wody destylowanej. Aby opracować 1% (v/v) roztwór błękitu anilinowego, należy rozpuścić 1 ml błękitu anilinowego w 100 ml 0,1 N K3PO4.</li>
		<li>Dodać 2-3 krople roztworu błękitu anilinowego do każdej płytki szalki Petriego i obserwować po 5 minutach pod mikroskopem epifluorescencyjnym UV przy użyciu filtra wzbudnicy BP340-390 i filtra barierowego LP425. Policz żywotne i niezdolne do życia ziarna pyłku na trzech polach na płytce, z których każde zawiera 100-200 ziaren pyłku, na dwóch szalkach Petriego dla każdej odmiany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzrost łagiewki pyłkowej
	<ol>
		<li>Przepłukać zamocowane słupki wodą destylowaną trzykrotnie (po 1 godzinie, łącznie 3 godziny) i przenieść do 5% (w/v) siarczynu sodu (Na2SO3) w temperaturze 4 °C na 24 godziny. Aby przygotować ten roztwór, rozpuść 5 g siarczynu sodu w 100 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Autoklawować słupki w temperaturze 120 °C przez 8 minut w 5% (w/v) siarczynie sodu w celu zmiękczenia tkanek.</li>
		<li>Zmiażdż zmiękczone słupki w kropli 1% (v/v) roztworu błękitu anilinowego pod szkłem nakrywkowym na szkiełku, aby zabarwić modzel.</li>
		<li>Obserwuj wzrost łagiewki pyłkowej wzdłuż stylu pod mikroskopem z epifluorescencją UV za pomocą filtra wzbudnicy BP340-390 i filtra barierowego LP425.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Określanie relacji niezgodności
<ol>
	<li>Ekstrakcja DNA z liści
	<ol>
		<li>Aby wyekstrahować DNA, należy zebrać 3–4 młode liście każdej odmiany na polu, najlepiej wiosną. 
		UWAGA: DNA można również wyekstrahować z dojrzałych liści, ale DNA z młodych liści ma mniej związków fenolowych.</li>
		<li>Wyizoluj DNA za pomocą komercyjnego zestawu i postępuj zgodnie z dostarczonym zestawem protokołów (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Określić ilościowo stężenie DNA i ocenić jakość DNA każdej próbki przy długości fali 260 nm w spektrofotometrze UV-Vis do spraw mikroobjętości. Dostosuj stężenie DNA do 10 ng/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki PCR do amplifikacji fragmentów
	<ol>
		<li>Oznacz probówki i nakrętki PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
		<li>Przygotuj odczynniki do PCR zgodnie z tabelą 1 i pozwól im rozmrozić się na lodzie.</li>
		<li>Ustawić objętość mieszanki wzorcowej każdej pary starterów w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml zgodnie z liczbą reakcji plus 10% nadmiaru, biorąc pod uwagę objętość 16 μl na reakcję. Dodać odczynniki zgodnie z kolejnością podaną w tabeli 1 i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Podwielokrotność 16 μl roztworu wzorcowego wymieszać w każdej 0,2 ml probówki PCR zawierającej 4 μl matrycy DNA lub 4 μl sterylizowanej wody destylowanej jako kontrolę ujemną (C-). Do kontroli pozytywnej należy wykorzystać DNA odmian o znanym genotypie. Delikatnie wymieszać, zamknąć probówki reakcyjne nakrętkami i odwirować przy 2 000 x g przez 30 s, aby zebrać całą objętość na dnie probówki reakcyjnej.</li>
		<li>Umieść probówki reakcyjne w termocyklerze i ustaw program PCR, korzystając z następującego profilu temperatury: początkowy krok trwający 3 minuty w temperaturze 94 °C, 35 cykli trwających 1 minutę w temperaturze 94 °C, 1 minuta w temperaturze 56 °C i 3 minuty w temperaturze 72 °C oraz końcowy etap trwający 7 minut w temperaturze 72 °C20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza i szacowanie wielkości fragmentu
	<ol>
		<li>Aby przygotować 1,7% (w/v) mini żel z agarozy, rozpuścić 0,68 g agarozy i 40 ml 1x buforu TBE w 100 ml kolbie Erlenmeyera. Rozpuść roztwór, podgrzewając w kuchence mikrofalowej o mocy 600 W w odstępach 30 s, aby uniknąć wrzenia.</li>
		<li>Pozostaw roztwór na stole do ostygnięcia, a następnie dodaj 3,5 μl roztworu do barwienia kwasów nukleinowych.</li>
		<li>Umieść tackę na żel w stojaku odlewniczym i włóż wybrany grzebień do formy żelowej. Upewnij się, że masz wystarczającą ilość studzienek dla każdego produktu PCR i drabiny DNA.</li>
		<li>Wlej roztwór agarozy do formy żelowej i pozwól mu ostygnąć do polimeryzacji. Usuń grzebień z polimeryzowanego żelu. Umieść żel w poziomym systemie elektroforezy zawierającym wystarczającą ilość 1x bufor TBE, aby pokryć powierzchnię żelu.</li>
		<li>Załaduj pierwszą i ostatnią studzienkę 2 μl drabinki masy cząsteczkowej DNA (drabinka DNA 1 kb). Załadować 3 μl każdego produktu PCR do pozostałych studzienek. Zamknij komorę, włącz zasilanie i uruchom żel pod napięciem 100 V przez 30 minut.</li>
		<li>Obserwuj żel w świetle UV za pomocą systemu dokumentacji żelu. Użyj drabiny masy cząsteczkowej DNA, aby określić rozmiar amplifikowanego fragmentu i porównaj go z kontrolami pozytywnymi w celu zidentyfikowania odpowiednich alleli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Monitorowanie dat kwitnienia
<ol>
	<li>Monitoruj fenologię różnych drzew każdej odmiany w okresie kwitnienia przez różne lata. Ustal długość okresu kwitnienia od pierwszego (około 5%) do ostatnich otwartych kwiatów (około 95%). Pełny rozkwit jest brany pod uwagę, gdy co najmniej 50% kwiatów znajduje się na etapie F24, zgodnie z etapem 65 w skali BBCH25,26.</li>
	<li>Aby porównać daty kwitnienia wzajemnie kompatybilnych odmian i określić te, które pokrywają się w okresie kwitnienia każdego roku, opracuj kalendarz okresów kwitnienia z danymi z kilku lat.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w niniejszym dokumencie metodologia wymagań dotyczących zapylania odmian śliwki japońskiej wymaga określenia samo(nie)zgodności każdej odmiany poprzez kontrolowane zapylanie w terenie lub laboratorium, a następnie obserwację wzrostu łagiewki pyłkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Relacje niezgodności ustala się poprzez scharakteryzowanie alleli S za pomocą genotypowania molekularnego. Wreszcie, selekcja zapylaczy jest przeprowadzana przez fenologię monitorującą w celu wykrycia tych odmian, któr...

Śliwka japońska (Prunus salicina Lindl.) pochodzi z Chin1. W XIX wieku roślina ta została sprowadzona z Japonii do Stanów Zjednoczonych, gdzie została skrzyżowana z innymi północnoamerykańskimi diploidalnymi śliwkami2. WXX wieku niektóre z tych hybryd rozprzestrzeniły się na umiarkowane regiony na całym świecie. Obecnie termin "śliwka japońska" odnosi się do szerokiej gamy międzygatunkowych hybryd pochodzących ze krzyżówek oryginalnego P. salicina z maksymalnie 15 innymi diploidalnymi Prunus spp.3,4,5.
Śliwka japońska, podobnie jak inne gatunki z rodziny Rosaceae, wykazuje gametofityczną samoniezgodność (GSI), która jest kontrolowana przez pojedynczy i wysoce polimorficzny locus S zawierający wiele alleli6. Locus S zawiera dwa geny, które kodują rybonukleazę (S-RNazę) wyrażaną w słupku oraz białko F-box (SFB) wyrażane w ziarnie pyłku7. W reakcji samoniezgodności, gdy allel S wyrażony w ziarnie pyłku (haploid) jest taki sam jak jeden z dwóch wyrażonych w słupku (diploidalny), wzrost łagiewki pyłkowej w poprzek stylu zostaje zatrzymany z powodu degradacji RNA łagiewki pyłkowej przez działanie S-RNase8. Ponieważ proces ten zapobiega zapłodnieniu żeńskiego gametofitu w zalążku, GSI sprzyja krzyżowaniu między odmianami.
Chociaż niektóre odmiany japońskiej śliwki są samokompatybilne, większość obecnie uprawianych odmian jest samoniekompatybilna i potrzebuje pyłku od wzajemnie kompatybilnych dawców do nawożenia swoich kwiatów3. W przypadku gatunków owoców pestkowych z rodzaju Prunus, takich jak almond9, apricot10,11,12 i czereśnia13, wymagania odmian dotyczące zapylania można ustalać na różne sposoby. Samo(nie)zgodność można określić na podstawie samozapylenia kwiatów na polu i późniejszego monitorowania zawiązywania owoców lub na podstawie samozapylenia częściowo in vivo w kontrolowanych warunkach w laboratorium i obserwacji łagiewek pyłkowych pod mikroskopem14,15,16,17,18. Zależności między odmianami można określić poprzez zapylenie krzyżowe w terenie lub w laboratorium przy użyciu pyłku potencjalnej odmiany zapylającej oraz poprzez identyfikację alleli S każdej odmiany za pomocą analizy PCR14,15,16,19,20,21,22. U gatunków takich jak czereśnia czy migdałowiec, samo(nie)zgodność może być również oceniona poprzez identyfikację poszczególnych alleli S związanych z samozgodnością, jak S4' w czereśni13 lub Sf w almond23.
Kilka programów hodowli śliwek z głównych krajów produkujących wprowadza na rynek szereg nowych odmian2,14, wiele z nich o nieznanych wymaganiach dotyczących zapylania. W pracy opisano metodykę określania wymagań dotyczących zapylania w mieszańcach typu śliwki japońskiej. Samo(nie)zgodność jest określana na podstawie samozapylenia zarówno w terenie, jak i w laboratorium, a następnie obserwacji łagiewek pyłkowych pod mikroskopią fluorescencyjną. Dobór odmian zapylających łączy identyfikację genotypów S za pomocą analizy PCR z monitorowaniem czasu kwitnienia na polu.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy Lodowcowy</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Błękit anilinowy</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy (H3BO4)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>4-hydrat azotanu wapnia (Ca(NO3)2 &środkowa kropka; 4H2O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Obrazowanie aparatu cyfrowego</td><td>Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do aparatów cyfrowych</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10 mM każdy</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Zielona polimeraza DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96&deg;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA 1Kb (patent USA nr 4.403.036) (500pb-12Kb)</td><td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>Rozmiar: 250&micro; g; Stężenie: 1.0 &mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>System Dokumentacji Żeli</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>Licznik ręczny</td><td>Oprogramowanie Laboratorium Obrazowego Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td></td> System Analizy Obrazu <td>Bio-Rad</td><td></td><td>do Systemu Dokumentacji Żeli</td></tr><tr><td>Mikrowirówka MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>5415 R</td><td>Mikroskop Z605212</td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>z UV epiflurescencja</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Filtr wzbudnicy BP340-390, Filtr barierowy LP425</td></tr><tr><td>Mikroszkiełka</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Mini system elektroforezy</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Miniwirówka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 1000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>Fosforan potasu trójzasadowy (K3PO4&middot; 1.5H2O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>Primer naprzód 'Pru C2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer naprzód Pru T2'ThermoFisher</td> <td>Scientific Primer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odwrócony 'PCER'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe Roztwór do barwienia kwasami nukleinowymi</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny siarczyn sodu (Na2SO3)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA roślin Speedtools</td><td></td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBE (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler T100</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Komfortowy termomikser</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw pionowy Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej poprzez monitorowanie fenologiczne, zapylanie ręczne, mikroskopię fluorescencyjną i genotypowanie molekularne

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Powszechnie uprawiane odmiany japońskiej śliwki to międzygatunkowe hybrydy pochodzące ze krzyżówek oryginalnego Prunus salicina z innymi gatunkami Prunus. Większość hybryd wykazuje gametofityczną samoniezgodność, która jest kontrolowana przez pojedynczy i wysoce polimorficzny locus S, który zawiera wiele alleli. Większość uprawianych hybryd jest niekompatybilna i potrzebuje pyłku od zgodnego dawcy do zapłodnienia swoich kwiatów. Ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej staje się coraz ważniejsze ze względu na dużą liczbę nowych odmian o nieznanych wymaganiach dotyczących zapylania. W pracy opisano metodykę określania wymagań dotyczących zapylania w mieszańcach typu śliwki japońskiej. Samo(nie)zgodność jest określana przez ręczne zapylanie zarówno na polu, jak i w laboratorium, a następnie monitorowanie wydłużenia łagiewki pyłkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a także monitorowanie dojrzewania owoców na polu. Wybór odmian zapylających jest oceniany poprzez połączenie identyfikacji genotypów S za pomocą analizy PCR z monitorowaniem czasu kwitnienia w terenie. Znajomość wymagań odmian w zakresie zapylania ułatwia dobór odmian do projektowania nowych sadów oraz pozwala na wczesne wykrycie problemów produkcyjnych związanych z niedoborem zapylenia w założonych sadach.

Każdy pąk kwiatowy śliwy japońskiej zawiera kwiatostan z 1–3 kwiatami. Podobnie jak u innych gatunków owoców pestkowych, każdy kwiat składa się z czterech kręgów: słupka, pręcików, płatków i działek kielicha, które są zrośnięte, tworząc kielich u podstawy kwiatu. Struktury kwiatowe są mniejsze niż u innych owoców pestkowych, z krótkim i kruchym słupkiem otoczonym przez pręciki zawierające niewielką ilość ziaren pyłku. W pełnym rozkwicie kwiaty każdego kwiatostanu wydają się być oddzielone na krótkich szypułkach, ukazując...

Opisano metodologię określania wymagań dotyczących zapylania w mieszańcach japońskich śliwek, która łączy polowe i laboratoryjne zapylenia oraz obserwacje łagiewek pyłkowych pod mikroskopią fluorescencyjną z identyfikacją genotypów S metodą PCR i monitorowaniem kwitnienia w celu wyboru zapylaczy.

Ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej poprzez monitorowanie fenologiczne, zapylanie ręczne, mikroskopię fluorescencyjną i genotypowanie molekularne

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Protokół ten staje się coraz ważniejszy ze względu na dużą liczbę nowych, samoniekompatybilnych odmian śliwki japońskiej o nieznanych wymaganiach dotyczących zapylania. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na określenie wymagań odmian w zakresie zapylania poprzez połączenie dwóch uzupełniających się podejść w warunkach polowych i laboratoryjnych. Podejście to można również zastosować do określenia wymagań dotyczących zapylania i innych niekompatybilnych gatunków drzew owocowych, takich jak morela lub czereśnia.Do ekstrakcji pyłku zbiera się pąki kwiatowe na etapie balonu zgodnie z etapem 57 w skali BBCH. Usuń pylniki za pomocą plastikowej siatki i umieść je na papierze w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aż do rozejścia się pylników. Przesiej ziarna pyłku przez drobną siatkę i przechowuj je w 10-milimetrowej szklanej probówce z nakrętką w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia.Gdy 10 do 20% kwiatów jest otwartych, wybierz i oznacz kilka gałęzi, pozostawiając od 1 000 do 1 500 kwiatów na zabieg zapylania. Następnego dnia, gdy otwartych jest więcej kwiatów, zapyl każdy kwiat za pomocą pędzla pyłkiem tej samej odmiany do samozapylenia i pyłkiem innych odmian w celu kontroli zapylenia krzyżowego. Zapylaj codziennie, aż wszystkie kwiaty będą otwarte.Rejestruj tygodniową liczbę kwiatów i rozwijających się owoców od fazy kwitnienia do zbioru, aby scharakteryzować wzór opadania owoców i określić ilościowo końcowy zestaw owoców w każdym zabiegu zapylania. Zbierz od 50 do 100 kwiatów na etapie balonu zgodnie z etapem 57 w skali BBCH. Wykastruj 30 kwiatów na zabieg w laboratorium w celu samozapylenia i zapylenia krzyżowego.Wykonaj świeże cięcie na podstawie każdej szypułki kwiatowej pod wodą i umieść je na kawałku mokrej pianki florystycznej. Do każdego zabiegu zapylania należy używać jednego kawałka pianki. Po 24 godzinach ręcznie zapyl każdy słupek zebranym wcześniej pyłkiem za pomocą cienkiego pędzla.Zapylić jeden zestaw słupków pyłkiem z tej samej odmiany, a drugi zestaw pyłkiem z innej kompatybilnej odmiany jako kontrolą. Utrwalić te zapylone słupki w utrwalającym roztworze etanolu i kwasu octowego przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozprowadź pyłek każdej odmiany używanej wcześniej jako dawca pyłku w zapyleniach na dwóch szalkach Petriego i inkubuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Aby obserwować ziarna pyłku, dodaj dwie do trzech kropli roztworu błękitu anilinowego do każdej szalki Petriego i obserwuj je pod mikroskopem epifluorescencyjnym UV po pięciu minutach. Policz żywotne i niezdolne do życia ziarna pyłku na trzech polach na szalce Petriego, przy czym każde pole zawiera około 100 do 200 ziaren pyłku na dwóch szalkach Petriego dla każdej odmiany. Aby obserwować łagiewki pyłkowe, zgnieć zmiękczone słupki w kropli 1% roztworu błękitu anilinowego pod szkłem nakrywkowym na szkiełku.Obserwuj wzrost łagiewki pyłkowej wzdłuż fryzury pod mikroskopem z epifluorescencją UV za pomocą filtra wzbudnicy BP340-390 i filtra barierowego LP425. Zbierz trzy do czterech młodych liści z każdej odmiany na polu i wyekstrahuj DNA z liści. Ustaw mieszankę wzorcową dla każdej pary starterów w mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj wszystkie odczynniki i dokładnie wymieszaj. Podwielokrotność 16 mikrolitrów tego wzorca wymieszać z każdą probówką PCR o pojemności 200 mikrolitrów zawierającą cztery mikrolitry matrycy DNA lub kontroli. Delikatnie je wymieszaj, zamknij nakrętki i odwiruj w temperaturze 2 000 razy G przez 30 sekund.Umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program PCR, jak wspomniano w rękopisie tekstowym. W celu oszacowania wielkości fragmentu za pomocą elektroforezy żelowej, należy załadować pierwszą i ostatnią studzienkę dwoma mikrolitrami drabinki DNA i trzema mikrolitrami produktu PCR w pozostałych studzienkach. Zamknij komorę i uruchom żel pod napięciem 100 woltów przez 30 minut.Obserwuj żel w świetle UV za pomocą systemu obrazowania żelu. Użyj drabiny DNA, aby oszacować wielkość amplifikowanych fragmentów i porównać ją z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi. Monitoruj fenologię różnych drzew każdej odmiany przez różne lata kwitnienia.Ustal długość okresu kwitnienia od pierwszego do ostatniego otwartego kwiatu. Za pełny rozkwit uważa się, gdy co najmniej 50% kwiatów znajduje się w fazie F zgodnie z etapem 65 na BBCH. Wzór opadania owoców kwiatów zapylanych ręcznie po wykastrowaniu lub dodatkowym zapyleniu wykazał, że większość kwiatów opadła dwa do trzech tygodni po zapyleniu, ale 4% samozapylonych kwiatów pozostało w drzewie, co wskazuje, że ta odmiana jest samokompatybilna.Żywotne ziarna pyłku wykazywały łagiewkę pyłkową dłuższą niż jej długość po 24 godzinach w pożywce, a niezdolne do życia ziarna pyłku nie kiełkowały. Podczas zapylania ziarna pyłku zostały przeniesione do znamienia. Każde kiełkujące ziarno pyłku wytwarzało łagiewkę pyłkową, która przerastała przez struktury słupków.W odmianach samoniezgodnych łagiewka pyłkowa przestała rosnąć w górnej jednej trzeciej stylu. Jednak w odmianach samokompatybilnych łagiewka pyłkowa może przerosnąć przez styl, dotrzeć do jajnika i zapłodnić zalążek. Analizę PCR przeprowadzono przy użyciu starterów z konserwatywnych regionów sRNA czereśni i śliwki japońskiej, co umożliwiło określenie wielkości alleli S w każdej odmianie.Obliczono długość okresu kwitnienia wynoszącą łącznie cztery lata. Kwitnienie w warunkach sadowniczych pozwoliło na określenie, które odmiany pokrywają się w okresie kwitnienia każdego roku. Próbując tego protokołu, upewnij się, że używasz większej liczby kwiatów śliwki japońskiej do zapylania ręcznego, ponieważ procent zawiązanych owoców jest bardzo niski w porównaniu z innymi gatunkami Prunus.Nie jest możliwe określenie samoniezgodności za pomocą metod molekularnych. Konieczne są dalsze prace nad sekwencjonowaniem alleli S, aby ocenić, czy niektóre allele S są związane z samozgodnością. Połączenie podejścia terenowego i laboratoryjnego zaowocowało cennymi informacjami do projektowania nowych sadów komercyjnych i może być wykorzystane w przypadku innych gatunków drzew owocowych.

establishing-pollination-requirements-japanese-plum-phenological

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy metodologię przeprowadzania krzyżówek w Setaria viridis (S. viridis).  Metoda polega na przycięciu wiechy przed zabiegiem gorącej wody w celu zabicia żywotnego pyłku.  Krzyżówki są wykonywane zgodnie z dobrze kontrolowanym reżimem wzrostu i zazwyczaj skutkują odzyskaniem od 1 do 7 nasion zapylonych krzyżowo na wiechę.

Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Aby odkryć skuteczność zapylaczy danego gatunku roślin, opracowano wiele metod eksperymentów polowych. W pracy przedstawiono podstawowe metody eksperymentów terenowych w ekologii zapylania na przykładzie Lycoris sanguinea var. sanguinea oraz nowego mechanizmu zapylania, zapylania przez pękające pąki.

Eksperymenty terenowe ekologii zapylania: przypadek Lycoris sanguinea var. sanguinea

Tutaj prezentujemy protokół wymuszający kwitnienie drzew mandarynkowych w warunkach fitotronu. Stres wodny, wysokie natężenie oświetlenia i symulowany wiosenny fotoperiod pozwoliły na uzyskanie żywotnych kwiatów w krótkim czasie. Ta metodologia pozwala naukowcom na kilka okresów kwitnienia w ciągu 1 roku.

Wymuszone kwitnienie drzew mandarynkowych w warunkach fitotronowych

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Przedstawiamy metodologię ustalania wymagań dotyczących zapylania odmian moreli (Prunus armeniaca L.), łącząc określenie samo(nie)zgodności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z identyfikacją genotypu S za pomocą analizy PCR.

Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych

Ten protokół zapewnia szybką metodę określania zgodności i niezgodności pyłków w odmianach cytrusowych.

Określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu S

Tutaj opisujemy ulepszenie metody semi-in vitro (SIV) do obserwacji naprowadzania i odbioru łagiewki pyłkowej u Arabidopsis thaliana, co zwiększa podatność zalążków. Wysokoprzepustowa metoda SIV cum septum może być połączona z liniami markerowymi gametofitów i genetycznie kodowanymi biosensorami w celu monitorowania dynamicznego procesu zapłodnienia.

Obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Aby zbadać mechanizm wykorzystania lipidów w błonach woreczków żółtkowych podczas późnych etapów rozwoju embrionalnego ptaków, stworzyliśmy podstawowy system hodowli komórek nabłonkowych encyklii encyklalnej przepiórek japońskich.

Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

Poznaj metodę określania wymagań zapylania śliwki japońskiej łączącą zapylanie polowe i laboratoryjne z mikroskopią fluorescencyjną oraz genotypowaniem PCR. Technika ta pozwala identyfikować efektywne zapylacze dla odmian samoniezgodnych.

Ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej poprzez monitorowanie fenologiczne, zapylanie ręczne, mikroskopię fluorescencyjną i genotypowanie molekularne (Wideo) | JoVE Journal

Ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej poprzez monitorowanie fenologiczne, zapylanie ręczne, mikroskopię fluorescencyjną i genotypowanie molekularne

Przeglądaj więcej filmów