Name: Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę odwrotnej transfekcji adipocytów 3T3-L1 w celu manipulacji ekspresją białek i mikro-RNA. Ta efektywna technika umożliwia badanie sygnalizacji insulinowej i pobierania glukozy w tkance tłuszczowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez INSERM, Université Côte d'Azur i Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) poprzez program Inwestycje dla przyszłego Laboratorium Doskonałości (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) i Inicjatywę Doskonałości (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. jest wspierany przez granty z Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) oraz Fondation Benjamin-Delessert. J.G. jest obsługiwany przez ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. jest wspierany przez grant ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 oraz grant z Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Dziękujemy również Centralnemu Ośrodku Obrazowania C3M finansowanemu przez Conseil Départemental des Alpes-Maritimes i Région PACA, który jest również wspierany przez Platformę Mikroskopii i Obrazowania GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).

UWAGA: Użyj sterylnych technik, aby wykonać wszystkie kroki protokołu w kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników i sprzętu.
1. Różnicowanie mysich fibroblastów 3T3-L1 w adipocyty
<ol>
	<li>Hoduj fibroblasty 3T3-L1 na 100 mm szalkach w pożywce hodowlanej-DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% surowicy nowonarodzonych cieląt oraz 1% penicyliny i streptomycyny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Umieścić szalki w inkubatorze do hodowli tkankowych (7% CO2 i 37 °C).</li>
	<li>Dwa dni po konfluencji zmień pożywkę, zastępując DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny uzupełnionej 0,25 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX), 0,25 μM deksametazonu, 5 μg/ml insuliny i 10 μM rozyglitazonu. 
	UWAGA: Osiągnięcie konfluencji zajmuje 5 dni, gdy komórki są wysiewane w ilości 300 000 komórek na 100 mm szalki.</li>
	<li>Dwa dni później zastąp pożywkę hodowlaną DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny uzupełnionej 5 μg/ml insuliny i 10 μM rozyglitazonu i inkubuj przez 2 dni. Następnie karmić komórki co 2 dni DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B).</li>
	<li>Transfekcja adipocytów 3T3-L1 7-8 dni po rozpoczęciu protokołu różnicowania. 
	UWAGA: Ważne jest, aby osiągnąć wysoki poziom różnicowania (>80%) przed transfekcją, aby uniknąć proliferacji pozostałych fibroblastów po transfekcji, co doprowadziłoby do mieszanej populacji komórek, która mogłaby zniekształcić wyniki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wstępnie powlekanych płyt
<ol>
	<li>Dzień przed lub kilka godzin przed transfekcją przygotować roztwór kolagenu typu I w stężeniu 100 μg/ml w 30% etanolu z roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml. Dodać 250 μl kolagenu na dołek płytki 12-dołkowej i 125 μl na dołek płytki 24-dołkowej i rozprowadzić roztwór na powierzchni dołka.</li>
	<li>Pozostaw płytkę bez pokrywki pod kapturem hodowlanym, aż kolagen wyschnie. Przemyć dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (D-PBS) firmy Dulbecco. 
	UWAGA: Płyty wstępnie powlekane są dostępne w sprzedaży.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mieszanki transfekcyjnej
UWAGA: Końcowe stężenie siRNA wynosi od 1 do 100 nM (1 do 100 pmol siRNA na dołek płytki 12-dołkowej). Końcowe stężenie mimiku miR wynosi 10 nM (10 pmol/dołek). Określ najlepsze stężenie każdego siRNA, mimiku miR lub innego oligonukleotydu przed rozpoczęciem eksperymentu, aby uniknąć efektów niedocelowych. Wykonaj eksperymenty transfekcji w trzech egzemplarzach, aby ułatwić analizę statystyczną wyników. Przygotować wszystkie odczynniki w nadmiarze, aby uwzględnić normalne straty podczas pipetowania.
<ol>
	<li>Wymieszać przez pipetowanie (objętość/objętość) siRNA (lub innych oligonukleotydów) z ulepszoną minimalną pożywką niezbędną (Tabela 1). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać odczynnik do transfekcji i ulepszone Minimal Essential Medium do siRNA i pipetować do mieszania (Tabela 1). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (w tym czasie przejść do sekcji 4). Dodaj mieszankę transfekcyjną do każdego dołka płytki pokrytej kolagenem.</li>
</ol>
4. Przygotowanie adipocytów 3T3-L1
<ol>
	<li>Umyć komórki na szalce Petriego o średnicy 100 mm dwukrotnie za pomocą D-PBS. Dodaj 5x trypsynę do komórek (1 ml na 100 mm szalka), upewniając się, że cała powierzchnia została pokryta trypsyną. Odczekaj 30 s i ostrożnie usuń trypsynę.</li>
	<li>Inkubować szalkę Petriego przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Dotknij czaszy 100 mm, aby odłączyć komórki.</li>
	<li>Dodaj 10 ml DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny, aby zneutralizować trypsynę. Ostrożnie pipetować pożywkę w górę i w dół, aby odłączyć komórki i homogenizować zawiesinę komórkową.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory liczącej Malasseza lub automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie komórek do 6,25 x 105 komórek/ml pożywki. Wysiew: 800 μl zawiesiny komórek/dołka płytki 12-dołkowej (5 x 105 komórek) lub 400 μl zawiesiny komórek/basenika płytki 24-dołkowej (2,5 x 105 komórek) zawierającej mieszaninę transfekcyjną. 
	UWAGA: Jedna 100 mm szalka Petriego z adipocytami pozwoli na przygotowanie jednej płytki 12-dołkowej lub jednej płytki 24-dołkowej. Naczynie o średnicy 100 mm zawiera zwykle 6-7 x 106 adipocytów, co odpowiada 5 x 105 adipocytów na dołek 12-dołkowej płytki.</li>
	<li>Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych (7 % CO2 i 37 °C) i nie naruszać komórek przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie zastąp supernatant świeżym DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny. 
	UWAGA: Możliwe jest również wysiewanie komórek na 48- i 96-dołkowych płytkach pokrytych kolagenem, ale należy zachować więcej środków ostrożności podczas wymiany pożywki, aby uniknąć oderwania adipocytów.</li>
</ol>
5. Analiza funkcjonalna transfekowanych adipocytów 3T3-L1
<ol>
	<li>Badaj docelowe knockdown 24-48 godzin i 48-96 godzin po dostarczeniu siRNA lub miR naśladującego odpowiednio mRNA i białko.</li>
	<li>Wykonuj analizy funkcjonalne transfekowanych adipocytów w celu zbadania sygnalizacji insuliny, wychwytu glukozy, wydzielania adipokiny, lipolizy i lipogenezy.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy przedstawiono szczegółowy protokół różnicowania i transfekcji dojrzałych adipocytów. Ta metoda odwrotnej transfekcji jest prostą, ekonomiczną i wysoce wydajną metodą transfekcji oligonukleotydów, takich jak między innymi siRNA, mimiki mikro-RNA i anty-mikro-RNA do adipocytów 3T3-L1, które są jedną z najtrudniejszych linii komórkowych do transfekcji. Ta metoda ma pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Protokół ten nie jest skuteczny w przypadku transfekcji plazmidowym DNA, co ogranicza użyteczność tej t...

Otyłość jest uważana za główny czynnik ryzyka wielu chorób metabolicznych, w tym insulinooporności (IR), cukrzycy typu 2 (T2D) i chorób sercowo-naczyniowych1. Obecne terapie nie są w stanie powstrzymać stale rosnącej częstości występowania tych chorób, a leczenie IR u pacjentów otyłych i chorych na cukrzycę pozostaje ważnym problemem klinicznym. Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w kontroli homeostazy energetycznej, a jej patologiczne rozrosty w czasie otyłości przyczynia się do rozwoju IR i T2D2,3. Podkreśla to potrzebę lepszego zrozumienia mechanizmu molekularnego zaangażowanego w dysfunkcję adipocytów w celu opracowania nowych terapii przeciwko chorobom związanym z otyłością. W wielu badaniach naukowych badano rolę RNA kodujących białka w fizjologii adipocytów i ich związek z otyłością.
Niedawno, odkrycie niekodujących RNA (ncRNA), zwłaszcza mikro-RNA (miR), stworzyło nowe koncepcje związane z mechanizmem regulacji programów ekspresji genów. Badania wykazały, że ncRNA są ważnymi regulatorami funkcji adipocytów, a ich rozregulowanie odgrywa ważną rolę w chorobach metabolicznych4. W związku z tym manipulacja białkami i ncRNA w adipocytach ma kluczowe znaczenie dla rozszyfrowania ich roli w funkcjonowaniu adipocytów i ich wpływu na patologie, takie jak cukrzyca typu 2. Jednak manipulowanie ekspresją białek i ncRNA in vivo, a także w pierwotnych adipocytach, pozostaje dużym wyzwaniem, co sprzyja stosowaniu modeli adipocytów in vitro.
Mysie fibroblasty 3T3-L1 łatwo różnicują się w dojrzałe, funkcjonalne i reagujące na insulinę adipocyty, które są dobrze scharakteryzowaną linią komórkową używaną do badania funkcji adipocytów (np. sygnalizacji insuliny, wychwytu glukozy, lipolizy i wydzielania adipokin)5,6,7,8,9,10. Te właściwości sprawiają, że adipocyty 3T3-L1 są atrakcyjnym modelem do modulowania ekspresji białek kodujących i nc-RNA w celu rozszyfrowania ich roli w funkcjonowaniu adipocytów i ich potencjalnej roli w chorobach związanych z otyłością. Niestety, podczas gdy fibroblasty 3T3-L1 są łatwe do transfekcji przy użyciu dostępnych na rynku odczynników, zróżnicowane adipocyty 3T3-L1 są jednymi z najtrudniejszych do transfekcji linii komórkowych. Dlatego liczne badania manipulujące ekspresją genów w komórkach 3T3-L1 koncentrowały się na różnicowaniu adipocytów, a nie na funkcji adipocytów.
Przez długi czas jedyną skuteczną techniką transfekcji adipocytów była elektroporacja5, która jest żmudna, kosztowna i może powodować uszkodzenia komórek. W artykule opisano technikę odwrotnej transfekcji przy użyciu powszechnie używanego odczynnika do transfekcji, która skraca czas potrzebny na transfekcję, nie ma wpływu na żywotność komórek i jest znacznie tańsza niż elektroporacja. Protokół ten doskonale nadaje się do transfekcji siRNA i innych oligonukleotydów, takich jak mimiki mikro-RNA (mimiki) i anty-miR. Zasada protokołu odwrotnej transfekcji polega na inkubacji odczynnika do transfekcji i oligonukleotydów w celu utworzenia kompleksu na płytce hodowli komórkowej, a następnie zasianiu dojrzałych adipocytów w studzienkach. Następnie adipocyty ponownie przyczepiają się do przylegającej powierzchni płytki w obecności kompleksu oligonukleotydów/odczynników do transfekcji. Ta prosta, wydajna i niedroga metodologia pozwala na badanie roli kodujących białka RNA i miR w funkcji adipocytów oraz ich potencjalnej roli w chorobach związanych z otyłością.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2,5% trypsyna (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>rozcieńczony do 5x z D-PBS</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell Non-targeting Pool</td><td>Horizon Discovery</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I ze skóry cielęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's&nbsp; Zmodyfikowane podłoże Eagles's Medium (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4,5 g/L D-Glukozy; L-glutamina; bez pirogronianu</td></tr><tr><td>etanolu</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola negatywna si-RNA znakowana FAM</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Wolny odczynnik glicerolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy glicerolu</td><td>Przeciwciało</td><td></td> Sigma-Aldrich G7793 <td></td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-131119</td><td>Rozcieńczenie: 0,5 i mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Ulepszone minimalne niezbędne podłoże (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, ludzka rekombinowana</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN mikro-RNA naśladuje</td><td>Horizon Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Testy Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Testy Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Zielony zestaw PCR</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla noworodków</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>Olej Czerwony O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Mysz Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon Discovery</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Perilipin-1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3470</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000</td></tr><tr><td>szalka Petriego 100 mm x 20 mm</td><td>Przeciwciało Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9272</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000</td></tr><tr><td>Komórka przeciwciała PKB Phospho Thr308</td><td> Sygnalizacja</td><td>9275</td><td>Rozcieńczenie: 1/1000</td></tr><tr><td>Rozyglitazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji (INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tubulina</td><td>przeciwciało Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>Rozcieńczenie: 0,5 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>przeciwciało Vamp2</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB5136</td><td>Rozcieńczenie: 0,1 i mikro; g/ml</td></tr></tbody></table>

model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-rna na funkcję adipocytów

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Zmiana funkcji adipocytów przyczynia się do patogenezy chorób metabolicznych, w tym cukrzycy typu 2 i insulinooporności. Podkreśla to potrzebę lepszego zrozumienia mechanizmu molekularnego zaangażowanego w dysfunkcję adipocytów w celu opracowania nowych terapii przeciwko chorobom związanym z otyłością. Modulowanie ekspresji białek i mikro-RNA w adipocytach pozostaje dużym wyzwaniem. W artykule opisano protokół różnicowania mysich fibroblastów na dojrzałe adipocyty oraz modulowania ekspresji białek i mikro-RNA w dojrzałych adipocytach poprzez odwrotną transfekcję przy użyciu oligonukleotydów naśladujących małe interferujące RNA (siRNA) i mikro-RNA (mimik miR). Ten protokół odwrotnej transfekcji obejmuje inkubację odczynnika do transfekcji i oligonukleotydów w celu utworzenia kompleksu na płytce hodowli komórkowej, do którego dodaje się dojrzałe adipocyty. Adipocyty mogą następnie ponownie przyłączyć się do przylegającej powierzchni płytki w obecności kompleksu oligonukleotydów/odczynników do transfekcji. Analizy funkcjonalne, takie jak badanie sygnalizacji insuliny, wychwytu glukozy, lipogenezy i lipolizy, można przeprowadzić na transfekowanych dojrzałych adipocytach 3T3-L1 w celu zbadania wpływu manipulacji białkiem lub mikro-RNA na funkcję adipocytów.

Stosując opisaną tutaj procedurę transfekcji odwrotnej w celu modulacji ekspresji białek lub mikro-RNA w adipocytach 3T3-L1, wykazano, że adipocyty zachowują swoją morfologię po transfekcji (Rysunek 1B,C). Rzeczywiście, 2 dni po transfekcji adipocyty były dobrze rozprzestrzenione i przytwierdzone do płytki oraz wykazywały obecność wielokomorowych kropel lipidowych, które są charakterystyczne dla dojrzałych adipocytów 3T3-L1. Zawartość lipidów...

Przedstawiono tutaj protokół dostarczania oligonukleotydów, takich jak mało-interferujące RNA (siRNA), mimiki mikro-RNA (miRs) lub anty-mikro-RNA (anty-miR) do dojrzałych adipocytów w celu modulacji ekspresji białek i mikro-RNA.

Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Protokół ten umożliwia manipulowanie białkami lub ekspresją mikroRNA w zróżnicowanych adipocytach w celu zbadania ich roli w funkcjonowaniu adipocytów. Ta metoda odwrotnej transfekcji jest prostą, ekonomiczną i wysoce wydajną metodą transfekcji oligonukleotydów do mysich adipocytów 3T3-L1. Metoda ta może być również stosowana do ludzkich preadipocytów zróżnicowanych w adipocyty.Procedurę zademonstruje Melanie Gaudfrin, technik z naszego laboratorium. Hoduj fibroblasty 3T3-L1 w 100-milimetrowych szalkach w DMEM bez pirogronianu, 25-milimolowej glukozy, 10% surowicy nowonarodzonej cielęciny oraz jednego procenta penicyliny i streptomycyny. Umieść naczynia w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i siedmioprocentowej zawartości dwutlenku węgla.Dwa dni po konfluencji zmień pożywkę hodowlaną, zastępując ją DMEM bez pirogronianu, 25 milimolowych glukoz, 10% FCS oraz jednego procenta penicyliny i streptomycyny uzupełnionych 0,25 milimolowym IBMX, 0,25 mikromolowym deksametazonem, pięcioma mikrogramami na mililitr insuliny i 10 mikromolowymi rozyglitazonem. Inkubuj naczynia przez dwa dni. Dwa dni później zastąp pożywkę hodowlaną DMEM bez pirogronianu, 25 milimolowych glukoz, 10% FCS i jednego procenta penicyliny i streptomycyny uzupełnionych pięcioma mikrogramami na mililitr insuliny i 10 mikromolowymi rozyglitazonem i inkubuj przez kolejne dwa dni.Karm komórki co dwa dni DMEM bez pirogronianu, 25 milimolowych glukoz, 10% FCS oraz jednego procenta penicyliny i streptomycyny i trzymaj komórki w inkubatorze. Dzień lub kilka godzin przed transfekcją przygotuj roztwór kolagenu typu I w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr w 30% etanolu z roztworu podstawowego o stężeniu jednego miligrama na mililitr. Dodaj 250 mikrolitrów kolagenu na dołek 12-dołkowej płytki lub 125 mikrolitrów na dołek 24-dołkowej płytki i rozprowadź roztwór na powierzchni studzienki.Pozostaw płytkę bez pokrywki pod kapturem hodowlanym, aż kolagen wyschnie. Następnie umyj go dwukrotnie za pomocą D-PBS. Odpipetować siRNA z ulepszoną minimalną pożywką niezbędną do wymieszania i inkubacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Dodaj odczynnik do transfekcji i ulepszone minimalne niezbędne podłoże do siRNA i odpipetuj do wymieszania. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj mieszankę transfekcyjną do każdego dołka płytki pokrytej kolagenem.Umyj komórki na 100-milimetrowej szalce Petriego dwukrotnie za pomocą D-PBS. Dodaj 5x trypsynę do komórek, upewniając się, że cała powierzchnia jest pokryta trypsyną. Odczekaj 30 sekund i ostrożnie usuń trypsynę.Inkubować szalkę Petriego przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Następnie dotknij naczynia, aby odłączyć komórki, unikając ich uszkodzenia. Dodaj 10 mililitrów DMEM bez pirogronianu, 25 milimolowych glukozy, 10% FCS oraz jeden procent penicyliny i streptomycyny, aby zneutralizować trypsynę.Ostrożnie odpipetować pożywkę w górę i w dół, aby odłączyć komórki i homogenizować zawiesinę komórek. Policz komórki za pomocą komory liczącej Malasseza lub automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie komórek do 0,625 miliona komórek na mililitr pożywki. Wysiewać 800 mikrolitrów zawiesiny komórek na dołek 12-dołkowej płytki lub 400 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na dołek 24-dołkowej płytki zawierającej mieszaninę transfekcyjną.Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych i nie przeszkadzać im przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie zastąp supernatant świeżym DMEM bez pirogronianu, 25 milimolowej glukozy, 10% FCS oraz jednego procenta penicyliny i streptomycyny, a następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora. Typowe punkty czasowe wykrywania docelowego knockdown po dostarczeniu siRNA lub miR wynoszą od 24 do 48 godzin dla mRNA i od 48 do 96 godzin dla białka.Eksperymenty funkcjonalne mogą być przeprowadzane na transfekowanych adipocytach, w tym sygnalizacja insuliny, wychwyt glukozy, wydzielanie adipokiny, lipoliza i lipogeneza. Wykazano, że adipocyty zachowują swoją morfologię po transfekcji. Dwa dni po transfekcji adipocyty prezentowały wielopunktowe kropelki lipidów o zawartości lipidów nie różniącej się między transfekowanymi i nietransfekowanymi adipocytami.Ekspresja mRNA różnych markerów różnicowania pozostała niezmieniona w transfekowanych komórkach w porównaniu z ekspresją w adipocytach nietransfekowanych. Protokół odwrotnej transfekcji jest skuteczny, ponieważ ponad 70% adipocytów zostało przetransfekowanych. Trzy dni po transfekcji siRNA przeciwko Perilipin-1 poziom mRNA Perilipiny-1 zmniejszył się o 70%, a poziom białka o 63% Ekspresję Perilipiny-1 analizowano również za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej cztery dni po transfekcji i stwierdzono, że zmniejszył się o 92% w porównaniu z jego ekspresją w adipocytach kontrolnych.Pokazano tutaj odwrotną transfekcję adipocytów z oligonukleotydami naśladującymi mikroRNA w celu zwiększenia ekspresji miR-34a. Nadekspresja miR-34a doprowadziła do zmniejszenia ekspresji białka VAMP2 o 50%Knockdown Perilipin-1 w adipocytach 3T3-L1 doprowadził do wzrostu lipolizy podstawowej, podczas gdy nadekspresja miR-34a doprowadziła do zahamowania fosforylacji kinazy białkowej B indukowanej insuliną i wychwytu glukozy. Ważne jest, aby osiągnąć wysoki poziom różnicowania adipocytów, aby przeprowadzić transfekcję na nowo różnicujących się adipocytach i uważnie monitorować leczenie adipocytów trypsyną.Po transfekcji możliwe jest przeprowadzenie eksperymentów funkcjonalnych na adipocytach w celu zbadania wpływu manipulacji białkami lub mikroRNA na sygnalizację insuliny, wychwyt glukozy, lipogenezę i lipolizę.

an-adipocyte-cell-culture-model-to-study-impact-protein-micro-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tkanka tłuszczowa (AT) może wpływać na homeostazę całego organizmu, dlatego zrozumienie molekularnych mechanizmów różnicowania i funkcji adipocytów jest ważne. Udostępniamy protokół uzyskiwania nowych informacji na temat tych procesów poprzez analizę homeostazy, różnicowania i ekspozycji na niedotlenienie adipocytów jako modelu indukowanej apoptozy adipocytów.

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Biała tkanka tłuszczowa (WAT) ma krytyczne braki w swoich obecnych pierwotnych modelach hodowli, co utrudnia rozwój farmakologiczny i badania metaboliczne. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania układu mikrofizjologicznego tkanki tłuszczowej poprzez umieszczanie WAT między arkuszami komórek zrębu. Ta konstrukcja zapewnia stabilną i adaptowalną platformę dla podstawowej kultury WAT.

Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

Hodowla agregatów dojrzałych adipocytów błonowych (MAAC) to nowa metoda hodowli dojrzałych ludzkich adipocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować adipocyty z ludzkiej tkanki tłuszczowej i jak skonfigurować MAAC.

Izolacja i hodowla dojrzałych adipocytów ludzkich przy użyciu błonowych dojrzałych kultur zagregowanych adipocytów (MAAC)

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Ten protokół opisuje izolację preadipocytów myszy z podskórnego tłuszczu, ich różnicowanie na dojrzałe adipocyty oraz indukcję insulinooporności. Działanie insuliny ocenia się na podstawie fosforylacji/aktywacji członków szlaku sygnałowego insuliny przez western blot. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie insulinooporności/wrażliwości w adipocytach pierwotnych.

Zróżnicowane adipocyty myszy w hodowli pierwotnej: model insulinooporności

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Bodźce wygenerowane komputerowo z wykorzystaniem smoka Jacky jako modelu.

Komputerowo generowane bodźce dla modeli zwierzęcych

Poznaj metodę odwrotnej transfekcji adipocytów 3T3-L1 w celu manipulacji ekspresją białek i mikro-RNA. Ta efektywna technika umożliwia badanie sygnalizacji insulinowej i pobierania glukozy w tkance tłuszczowej.

Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów

Przeglądaj więcej filmów