Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

CMOD Pack pozwala na modelowanie komórek z bardzo dużą precyzją i hodowlę ich w 2d lub 3d. Otwiera to możliwości badania interakcji między komórkami i morfogenezy nowych tkanek silnikowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do przyjęcia przez inne laboratoria, nie wymaga czystego pomieszczenia, specjalistycznego sprzętu ani niestandardowych syntetyzowanych odczynników.

Zacznij od upuszczenia małych kropel dodatniego fotorezystu na szkiełko aldehydowe za pomocą jednorazowej pipety. Kręć suwakiem z prędkością 3000 obr./min przez 30 sekund za pomocą kodera wirowego, a następnie umieść go na płycie grzejnej o temperaturze 100 stopni Celsjusza na 1,5 minuty, aby usieciować fotorezyst. Zdejmij szkiełko z płyty grzejnej i umieść maskę fotograficzną z pożądanymi funkcjami na wierzchu szkiełka, obciąż ją kawałkiem szkła i przykryj cały zestaw w nieprzezroczystym pudełku.

Wystaw zestaw z lampą UV na dwie minuty, wywołaj szkiełko, zanurzając je w roztworze wywoływacza na trzy do pięciu minut, a następnie spłucz nadmiar roztworu wywoływacza wodą, wysusz pod strumieniem powietrza lub azotu. Obserwuj to światło pod mikroskopem, aby potwierdzić sukces litografii fotograficznej i przechowuj je w ciemności. Dodaj kroplę 20 mikromolowego roztworu oligonukleukleotydów zmodyfikowanych aminami na każdy obszar szkiełka ze wzorem fotograficznym i delikatnie rozprowadź kroplę na całym obszarze, używając końcówki pipety, uważając, aby nie zarysować szkiełka, upiecz szkiełko w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza, aż roztwór DNA całkowicie wyschnie, wykonaj aminację redukcyjną, umieszczając upieczone szkiełko i 15-centymetrowe naczynie do hodowli komórek w dygestoriach na górze shakera.

Delikatnie wymieszaj 100 miligramów wodorku boro sodu w 40 mililitrach PBS i dodaj do naczynia. Następnie włącz shaker na 15 minut. Po reakcji przemyj to szkiełko dwukrotnie 0,1% dodecylosiarczanem sodu, aby usunąć nieprzereagowane DNA.

Następnie umyj szkiełko trzykrotnie wodą. Przeprowadź tę prowadnicę pod strumieniem azotu lub powietrza. Na koniec spłucz go acetonem, aby usunąć pozostały fotorezystor.

Przygotować czteromikromolowy uniwersalny roztwór kotwy i adaptera zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i przygotować uniwersalny roztwór współkotwiący o mocy 20 mikromoli w PBS. Przygotuj zawiesinę komórkową, ponownie zawieszając osad komórkowy w jednym mililitrze lodowatego PBS lub pożywki wolnej od surowicy i przenieś od jednego do 3 milionów komórek do 1,5-mililitrowej wirówki z mikrowirówką. Wirować w temperaturze 160 razy G przez cztery minuty.

Otrzymany osad komórkowy zawiesić w 75 mikrolitrach lodowatego PBS lub pożywki wolnej od surowicy i dodać 75 mikrolitrów przygotowanego dla mikromola uniwersalnego roztworu kotwy i adaptera. Dokładnie wymieszać i inkubować przez pięć minut na lodzie, dodać 15 mikrolitrów uniwersalnego roztworu współkotwiczącego do probówki i dokładnie wymieszać, a następnie inkubować próbkę przez pięć minut na lodzie. Aby usunąć nadmiar oligonukleotydów z zawiesiny komórek, dodaj jeden mililitr lodowatego PBS lub pożywki wolnej od surowicy do probówki i wymieszaj pipetą.

Osadzać komórki przez odwirowywanie w temperaturze 160 razy G przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Ponownie zawiesić komórki w pożywce lodowej PBS lub pożywce wolnej od surowicy, aby uzyskać gęsty roztwór komórek o stężeniu co najmniej 25 milionów komórek na mililitr, lekko przechylić szkiełko wzorcowe, a następnie dodać 25 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do wlotu każdej komórki przepływowej.

Usuń PBS i 1% roztwór BSA z wylotu, pozwalając zawiesinie ogniw wypełnić komórkę przepływową PDM. Inkubować na lodzie lub w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, odessać pięć mikrolitrów zawiesiny komórek z wylotu szkiełka i dodać ją z powrotem do wlotu. Powtórz to 10 razy na komórkę przepływową.

Delikatnie odpipetować PBS lub pożywkę wolną od surowicy do wlotu każdej komory przepływowej, aby wypłukać nadmiar komórek i zebrać zawiesinę komórek z wylotu. Powtórz to dwa do czterech razy, aż na szkiełku nie pozostanie żaden nadmiar komórek. Do hodowli 3d przygotuj roztwór prekursora hydrożelu zawierający 2% DNA i dodaj 50 mikrolitrów do wlotu każdej komórki przepływowej.

Zassać nadmiar płynu z wylotu, wprowadzając roztwór hydrożelu do komory przepływowej. Inkubować szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut, aby umożliwić hydrożelom związanie i rozszczepienie adhezji opartej na DNA między komórkami a powierzchnią. Dodać 50 mikrolitrów prekursora hydrożelu do studzienki szkiełka dwudołkowego lub płytki sześciodołkowej.

Odpipetować 10 mikrolitrów PBS po obu stronach każdej celi przepływowej. Rozprowadź go na całej długości komory przepływowej za pomocą żyletki lub pęsety punktowej i delikatnie podnieś boki komórek przepływowych, aby PBS wpadł pod hydrożel. Za pomocą żyletki przesuń komórkę przepływu do krawędzi szkiełka, odwracając suwak i popchnij komórkę przepływu ze szkiełka tak, aby wylądowała na żyletce.

Podnieś komórkę przepływową z żyletki za pomocą zakrzywionych kleszczy. Odwróć komórki przepływowe tak, aby komórki znajdowały się na dnie i umieść je na kropelce roztworu prekursora hydrożelu. Inkubować przez co najmniej 30 minut, aby hydrożel zawierający komórki wzorca mógł związać się z podkładem hydrożelowym, co spowoduje pełne zatopienie komórek wzorca.

Wyjmij komórkę przepływową i zanurz ją całkowicie w mediach. Delikatnie popchnij komórkę przepływową za pomocą zakrzywionych kleszczy, aż odskoczy i wypłynie na nośnik, a następnie wyrzuć ją. Kwantyfikacja adhezji plamki DNA do komórek znakowanych CMO, która wzrasta.

w funkcji stężenia CMO jest reprezentowany jako średnia i odchylenie standardowe z trzech doświadczeń. Wzorce DNA są pokazane w kolorze magenta, a przylegające komórki znakowane CMO w kolorze cyjanu przy różnych stężeniach CMO. Porównanie huveków znakowanych CMO i huveków znakowanych LMO przylegających do liniowego wzorca DNA pokazano tutaj.

Pojedynczy wzór MDCKs VSC MOD pack i przeniesiony do żelu maitre był w stanie namnażać się i polaryzować po pięciu dniach hodowli. Wielowarstwowe agregaty wielokomórkowe zostały utworzone przez naprzemienne warstwy komórek oznaczonych uzupełniającymi CMO. Wiele unikalnych populacji komórek może być modelowanych razem z dużą precyzją i bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Podczas próbowania tego protokołu bardzo ważne jest, aby mieć gęstą zawiesinę komórek podczas dodawania komórek do szkiełka, aby zmaksymalizować możliwości przyklejania się komórek do plam DNA.