Drukowany w 3D hipoksyjny rak na chipie do rekapitulacji patologicznej progresji raka litego
5 stycznia 2021
Niedotlenienie jest cechą charakterystyczną mikrośrodowiska guza i odgrywa kluczową rolę w progresji raka. Ten artykuł opisuje proces wytwarzania niedotlenionego raka na chipie opartego na technologii drukowania komórek 3D w celu podsumowania patologii raka związanej z niedotlenieniem.
Niedotlenienie jest kluczowym czynnikiem rozwoju raka, który indukuje niestabilność genomu i nowotworzenie się. Demonstrujemy metodę generowania centralnej hipoksji w raku litym in vitro w oparciu o technologię biodruku 3D. Korzystając z tej metody, gradient hipoksyjności radiowej można odtworzyć za pomocą prostej strategii, która łączy wydrukowaną w 3D barierę przepuszczalną dla gazów i szklaną pokrywę.
Ta technologia on-a-chip w leczeniu niedotlenienia raka może być wykorzystywana do przewidywania skuteczności leków w celu ułatwienia przepisywania leków przeciwnowotworowych dostosowanych do potrzeb pacjenta. Oczekuje się również, że umożliwi szybką diagnozę agresywnych nowotworów. Aby pomóc w przygotowaniu trzymililitrowego zneutralizowanego roztworu żelu kolagenowego, pokrój 30-miligramowe gąbki kolagenowe na kawałki o wymiarach pięć na pięć milimetrów kwadratowych.
Umieść kawałki w sterylnej szklanej fiolce o pojemności 10 mililitrów i dodaj 2,4 mililitra filtra strzykawkowego 0,2 mikrona, 0,1 normalnego kwasu solnego do fiolki na trzydniową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 15 obrotów na minutę. Po strawieniu przecedź niestrawione cząsteczki kolagenu przez sitko do komórek o wielkości 40 mikronów i przechowuj kwaśny roztwór kolagenu w temperaturze czterech stopni Celsjusza do siedmiu dni. Aby dostosować pH 1% zneutralizowanego roztworu kolagenu przed żelem, dodaj 30 mikrolitrów roztworu czerwieni fenolowej do końcowego stężenia 1% i 300 mikrolitrów 10X PBS do końcowego stężenia 10% Po wymieszaniu i odwirowaniu użyj jednego normalnego wodorotlenku sodu, aby zneutralizować pH do siedmiu, sprawdzając zmianę koloru i dodaj wodę destylowaną, aby uzyskać całkowitą objętość trzech mililitrów.
Następnie przechowuj 1% zneutralizowany roztwór żelu kolagenowego o dostosowanym pH w temperaturze czterech stopni Celsjusza do użycia w ciągu trzech dni. Aby wstępnie sprawdzić żelowanie zneutralizowanego roztworu żelu wstępnego kolagenu, użyj pipety wyporowej, aby dodać 50 mikrolitrów kropelek kolagenu do małego naczynia i inkubować kropelki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Pod koniec inkubacji sprawdź, czy kolagen zmienił kolor z przezroczystego na nieprzezroczysty biały.
Przechyl pojemnik, aby upewnić się, że kolagen przylega do dna pojemnika. I wlej PBS na kropelkę, aby potwierdzić, że konstrukt kolagenowy nie rozpada się w roztworze. Aby wydrukować 3D ofiarną formę PEVA, kliknij Plik i zapisz typ pliku jako STL, aby przekonwertować plik CAD 3D na plik STL, a następnie kliknij Opcja i wyjdź formularz jako ASCII, aby wygenerować G-code.
Aby zaimportować wygenerowany plik STL, kliknij Plik i otwórz plik STL i wybierz zapisany plik STL. Aby automatycznie wygenerować kod G formy protektorowej PEVA, należy wybrać model warstwowy wymiennika STL-CAD. Następnie, aby wygenerować ścieżki drukowania do produkcji chipów, użyj precyzyjnej dyszy o rozmiarze 50 przy ciśnieniu pneumatycznym 500 kilopaskali w temperaturze 110 stopni Celsjusza, aby wydrukować ofiarną formę PEVA na sterylnym kleju hydrofilowym szkiełku histologicznym.
Aby odlać barierę PDMS, wymieszaj sześć mililitrów elastomeru bazowego PDMS i 600 mikrolitrów utwardzacza przez pięć minut w plastikowym zbiorniku i załaduj jednorodnie zmieszany roztwór do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów. Wyposaż strzykawkę w plastikową, stożkową końcówkę dozującą o średnicy 20 mm i napełnij ofiarną formę PEVA zmieszanym roztworem PDMS. Zmieszany PDMS wypełni tę ofiarną formę PEVA wypukłą powierzchnią, a bariera będzie wyższa niż w przypadku formy.
Po utwardzeniu bariery PDMS w piekarniku o temperaturze 40 stopni Celsjusza przez ponad 36 godzin, aby uniknąć stopienia PEVA, użyj pęsety precyzyjnej, aby odłączyć protektorową formę PEVA i wysterylizować barierę przepuszczalną dla gazów w temperaturze 120 stopni Celsjusza w autoklawie. Aby wymieszać roztwór z komórkami rakowymi, ponownie zawieś każdy rodzaj zebranych osadów komórkowych w 20 mikrolitrach pożywki hodowlanej i dodaj jeden mililitr 1% zneutralizowanego roztworu żelu kolagenowego do każdej z zawieszonych zawiesin komórkowych na mokrym lodzie z delikatnym mieszaniem. Użyj pipety wyporowej, aby wymieszać każdą zawiesinę komórek.
Po uzyskaniu jednorodnych roztworów użyj dodatniej pipety jednorazowej, aby przenieść biotusze kolagenowe w kapsułkach z komórkami do pojedynczych trzymililitrowych jednorazowych strzykawek i przechowywać strzykawki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu drukowania komórek 3D. Aby wydrukować 3D koncentryczne pierścienie rakowo-zrębowe, przekonwertuj odpowiedni plik CAD 3D na format pliku STL i użyj wymiennika STL-CAD do wygenerowania kodu G koncentrycznych pierścieni rak-zręb. Załaduj biotusze kolagenowe w kapsułkach do głowicy drukarki 3D i ustaw temperaturę głowicy i płytki na 15 stopni Celsjusza.
Załaduj wygenerowaną ścieżkę drukowania do oprogramowania sterującego drukarki 3D i kliknij Start, aby wydrukować biotusze kolagenowe na barierę przepuszczalną dla gazów zgodnie z załadowanym kodem G za pomocą plastikowej igły o rozmiarze 18 przy ciśnieniu pneumatycznym około 20 kilopaskali w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Pod koniec każdej operacji drukowania ręcznie umieść wysterylizowaną szklaną pokrywę o wymiarach 22 na 50 milimetrów na wierzchu bariery przepuszczającej gaz, aby wygenerować gradient hipoksji. Po wygenerowaniu trzech niedotlenionych chipów z rakiem na chipach, przenieś chipy do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę, aby usieciować biotusze kolagenowe.
Po wydrukowaniu wszystkich niedotlenionych rakoserii na chipach, delikatnie przetrzyj szkła nakrywkowe na wierzchu barier przepuszczalnych dla gazów za pomocą skrobaka do komórek, aby uzyskać ścisłe połączenie. Aby odświeżyć pożywkę do hodowli komórkowej do chipów bez odłączania konstruktu rakowego, przechyl chipy i użyj pipety, aby wprowadzić 1,5 mililitra pożywki do wzrostu komórek śródbłonka z boku każdego chipa. Niedotlenienie nowotworu na chipie zostało zaprojektowane w postaci koncentrycznych pierścieni, aby naśladować promieniową dyfuzję i zubożenie tlenu obserwowane w tkankach nowotworowych.
Po zdefiniowaniu objętości kontrolnej przestrzeni, w której tlen jest dyfundowany i zużywany przez komórki, można określić odpowiednią gęstość komórkową do generowania centralnej hipoksji za pomocą obliczeniowej analizy elementów skończonych. Po wydrukowaniu komórek 3D można utworzyć koncentryczną strukturę pierścienia rakowo-zrębowego w celu odtworzenia cech anatomicznych raka litego. Ilościowo, żywotność komórek po wydrukowaniu jest zwykle większa niż 96%, co potwierdza, że warunki produkcji są odpowiednie dla komórek rakowych i zrębowych.
W tej reprezentatywnej analizie porównano dwie grupy pod względem obecności i braku gradientu tlenu, aby zweryfikować wpływ gradientu hipoksyjnego na progresję raka. W obu warunkach dojrzałe komórki śródbłonka CD31 dodatnie były obecne w regionach obwodowych, co wskazuje, że żywe konstrukty o przestrzennym wzorze zostały wytworzone przy użyciu technologii biodruku 3D. W porównaniu z ujemnym stanem gradientu tlenu, stan dodatni gradientu wykazał gradient niedotlenienia, wskazujący na stopniową ekspresję HIF1 alfa.
Zaobserwowano również komórki pseudopalisadowe SHMT2 dodatnie i komórki pluripotencjalne SOX2-dodatnie, co wskazuje na obecność agresywnych cech patofizjologicznych raka litego. Niedotleniony rak na chipie jest użytecznym narzędziem do badania patofizjologicznych cech nowotworów litych oraz dynamicznego wzajemnego oddziaływania między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem sprzyjającym nowotworzeniu. Ponieważ metodologia ta może zostać dostosowana do projektowania leków dostosowanych do potrzeb pacjenta w rozsądnych ramach czasowych, oczekuje się, że podejście to wypełni lukę między modelami raka in vivo i in vitro.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia opracowanie hipoksycznego modelu nowotworu na chipie (cancer-on-a-chip) z wykorzystaniem technologii biodruku 3D. Podkreślono w nim znaczenie hipoksji w progresji nowotworu oraz jej wpływ na przewidywanie skuteczności leków i diagnostykę raka.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia nowotworów
- Biodruk 3D
- Badania nad hipoksją
Wstęp
- Hipoksja jest krytycznym czynnikiem w mikrośrodowisku nowotworowym.
- Przyczynia się ona do niestabilności genomowej i tumorigenzy.
- Zrozumienie mechanizmów hipoksji może pomóc w opracowaniu celowanych terapii przeciwnowotworowych.
- Biodruk 3D oferuje innowacyjne podejścia do modelowania warunków nowotworowych.
Cel badania
- Stworzenie modelu symulującego warunki hipoksji w nowotworach.
- Ocena skuteczności leków w kontrolowanym środowisku.
- Ułatwienie szybkiej diagnostyki agresywnych nowotworów.
Zastosowane metody
- Technologia biodruku 3D do wytwarzania modelu raka na chipie (cancer-on-a-chip).
- Wykorzystanie bariery przepuszczalnej dla gazów w celu stworzenia gradientu hipoksji.
- Przygotowanie zneutralizowanego roztworu pre-żelu kolagenowego do hodowli komórkowej.
- Testy in vitro w celu oceny odpowiedzi na leki w warunkach hipoksji.
Główne wyniki
- Skuteczne odtworzenie niedotlenienia centralnego w modelu solidnego nowotworu.
- Wykazany potencjał w przewidywaniu skuteczności leków.
- Umożliwienie stworzenia ram dla personalizowanego doboru leków przeciwnowotworowych dla pacjentów.
- Wsparcie możliwości szybkiej diagnostyki agresywnych nowotworów.
Wnioski
- Hipoksyjny model nowotworu na chipie (cancer-on-a-chip) jest cennym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Technologia ta może usprawnić podejścia w ramach medycyny spersonalizowanej.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w onkologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten trójwymiarowy, wydrukowany komórkowo model niedotlenionego raka na chipie (cancer-on-a-chip) odpowiada na krytyczną potrzebę stworzenia fizjologicznie istotnych systemów in vitro, które odwzorowują czynniki mikrośrodowiska nowotworowego, takie jak hipoksja, bezpośrednio wpływające na przeżywalność, inwazyjność i chemiooporność nowotworów. Dzięki zapewnieniu precyzyjnej przestrzennej kontroli nad gradientami tlenu oraz oddziaływaniami między stroma a rakiem, platforma ta umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów terapeutycznych i zwiększa pewność prognostyczną w ocenie odpowiedzi na leki w badaniach przedklinicznych. Model ten niweluje lukę translacyjną między uproszczonymi modelami in vitro a patologią in vivo, oferując możliwość wielokrotnego wykorzystania w procesach odkrywania leków w onkologii, skoncentrowanych na mechanizmach guzów litych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków tumorigenicznych napędzanych przez hipoksję poprzez przestrzennie kontrolowane gradienty tlenu, które odtwarzają heterogeniczność wewnątrzguza.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów zaangażowanych w adaptację do hipoksji, takich jak HIF1α, SHMT2 i SOX2, za pomocą obserwowalnych markerów patofizjologicznych w wydrukowanych strukturach koncentrycznych pierścieni.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu poprzez powiązanie fenotypów molekularnych z agresywnym zachowaniem nowotworu w kontrolowanych warunkach hipoksji, co wspomaga priorytetyzację celów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na tworzenie zestandaryzowanych, powtarzalnych mikrośrodowisk hipoksycznych z żywotnością komórek po drukowaniu powyżej 96%, co umożliwia wiarygodny screening związków w warunkach istotnych z punktu widzenia patofizjologii.
- Wyniki ilościowe: Ułatwia pomiar biomarkerów zależnych od hipoksji (np. gradientu HIF1α, tworzenia pseudopalisad) jako ilościowych punktów końcowych do oceny odpowiedzi na lek.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Bariera przepuszczalna dla gazów oraz system bioatramentu na bazie kolagenu pozwalają na adaptację do różnych typów nowotworów i konfiguracji zrębu, wspierając skalowalny rozwój analiz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Odzwierciedla wzorce radialnej dyfuzji i ubytku tlenu obserwowane w guzach litych, zwiększając zdolność modelu do badania progresji złośliwości napędzanej przez mikrośrodowisko.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia analizę dynamicznych interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu (np. śródbłonkowymi, glejowymi) w formacie dostosowalnym do pacjenta, co wspiera prekliniczną walidację powiązaną z biomarkerami.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Zapewnia ramy do oceny chemioporności i fenotypów inwazyjnych w warunkach hipoksji, dostarczając informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w rozwoju preklinicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w ciąg procesu odkrywania leków, umożliwiając walidację celów modulowanych przez hipoksję we wczesnej fazie odkrywania, dostarczając systemy gotowe do testów przesiewowych oraz generując wyniki translacyjne, które stanowią podstawę dla przedklinicznej oceny ryzyka.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących indukowanej hipoksją tumorigenozy oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kontrolowane gradienty tlenu i przedzielone architektury nowotwór-stroma.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzację testów i reprodukowalne warunki hipoksji, co pozwala na spójną ocenę związków w różnych partiach i laboratoriach.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę markerów zależnych od hipoksji (HIF1α, SHMT2, SOX2) oraz fenotypów strukturalnych (pseudopalisady, wzorce naczyniowe) jako odczytów o jakości decyzyjnej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkrywcze z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie ekologii guza istotnej dla pacjenta oraz interakcji stromy w skalowalnym formacie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przepływ pracy biodruku 3D, bariera przepuszczalna dla gazów oraz system zneutralizowanego bioatramentu kolagenowego stanowią platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do wielu typów nowotworów litych i kokultur stromy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej dotyczącej roli hipoksji w progresji nowotworu i oporności terapeutycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i skalowalność dzięki zdefiniowanym protokołom przygotowania bioatramentu, parametrów drukowania oraz wytwarzania barier.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w odniesieniu do celów związanych z hipoksją, ograniczając niepowodzenia na późnych etapach wynikające z niemodelowanych efektów mikrośrodowiskowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na leki w oparciu o analizę ryzyka na podstawie wyników w systemach odtwarzających hipoksję, dostosowując postępy prac do prognostycznych biomarkerów agresywności.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie biodruku 3D, sterylnego obchodzenia się z komórkami oraz biologii hipoksji, aby zapewnić prawidłowe przygotowanie bioatramentu i utworzenie gradientu.
- Metoda zależy od dostępu do precyzyjnych drukarek pneumatycznych, przepuszczalnych dla gazów materiałów do formowania (PEVA), sprzętu do odlewów z PDMS oraz systemów inkubacyjnych kompatybilnych z warunkami hipoksji.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania bioatramentu, parametrów drukowania oraz kontroli jakości (np. weryfikacja żelowania, testy żywotności) w ramach zespołów badawczych w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wymagane jest uwzględnienie adaptacji przy rozszerzaniu modelu poza układy glejaka i komórek śródbłonka na inne kombinacje nowotwór-stroma (np. rak-fibroblasty, rak-komórki odpornościowe).
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ręcznego umieszczania szkiełka przykrywnego w celu uszczelnienia komory hipoksyjnej oraz potencjalną zmienność żelowania kolagenu między partiami, co musi być kontrolowane poprzez etapy kontroli jakości przed żelowaniem.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:56
Collagen Pre-Gel Solution Preparation
1:47
1% Neutralized Collagen Pre-Gel Solution pH Adjustment
3:12
Gas-Permeable Barrier 3D Printing
4:20
Polydimethylsiloxane (PDMS) Barrier Casting
5:29
1% Neutralized Collagen Pre-Gel Solution Cell Mixing
6:19
Cancer-Stroma Concentric Ring 3D Cell Printing
7:39
Hypoxic Cancer-on-a-Chip Maintenance
8:11
Results: Representative Solid Pathologic Cancer Progression on a 3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip
10:06
Conclusion
