Metoda interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji w Odonata
February 6th, 2021
Udostępniamy szczegółowy protokół interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji u owadów z rzędu Odonata (ważki i ważki) przy użyciu ważki niebieskoogoniastej (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) i ważki srokatej (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Jest to protokół wideo dla metody interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji w Odonata. Ważki i ważki, należące do rzędu Odonata, należą do najbardziej pradawnych owadów. Dorosłe osobniki Odonata wykazują niezwykłą różnorodność kolorów i wzorów ciała, przeprowadzono wiele badań ekologicznych i behawioralnych.
Brakowało jednak badań genetyki molekularnej nad Odonatą, ponieważ analiza funkcjonalna genów jest bardzo trudna. Na przykład konwencjonalna metoda RNAi nie jest skuteczna w przypadku gatunków Odonata. Niedawno opracowaliśmy metodę RNAi w połączeniu z elektroporacją in vivo.
W tym miejscu udostępniamy protokół wideo dla RNAi za pośrednictwem elektroporacji zarówno u ważek, jak i ważek. Jako nasz reprezentatywny gatunek ważki używamy ważki niebieskoogoniastej, Ischnura senegalensis.
Jest to jeden z najczęstszych gatunków ważek i często spotykany w słonecznych stawach w Japonii. Po pierwsze, pokazujemy protokół RNAi ukierunkowany na brzuch ważki, Ischnura senegalensis. Po lodowatym znieczuleniu przymocuj dwie szpilki po obu stronach przedpiersia i przymocuj larwę do stałego stojaka.
Pociągnij i rozciągnij błonę międzysegmentową między siódmym a ósmym segmentem brzusznym za pomocą kleszczy. Utrzymuj membranę międzysegmentową rozciągniętą ręcznie. Włóż końcówkę przygotowanej kapilary do rozciągniętej membrany międzysegmentowej.
Wstrzyknąć 1 mikrolitr roztworu siRNA lub dsRNA. Nanieś dwie kropelki żelu ultradźwiękowego na powierzchnię larwy za pomocą kleszczy. Umieść elektrody na żelu do ultradźwięków, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się po stronie wstrzyknięcia.
Generuj 10-krotne impulsy elektroporacyjne za pomocą elektroporatora. Zetrzyj pozostały żel z powierzchni ręcznikiem papierowym. Usuń szpilki owadów i trzymaj leczone larwy na mokrym ręczniku papierowym przez około jeden dzień w celu wyzdrowienia.
Następnie pokazujemy protokół RNAi ukierunkowany na klatkę piersiową ważki, Ischnura senegalensis. Po lodowatym znieczuleniu przymocuj dwie szpilki po obu stronach przedpiersia i przymocuj larwę do stałego stojaka. Pociągnij i rozciągnij błonę międzysegmentową między przedpiersiem a synthorax za pomocą ręki.
Włóż końcówkę przygotowanej kapilary do rozciągniętej membrany międzysegmentowej. Wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu siRNA lub dsRNA. Nanieś dwie kropelki żelu ultradźwiękowego na powierzchnię larwy za pomocą kleszczy.
Umieścić elektrody na żelu ultradźwiękowym z elektrodą dodatnią po stronie wstrzyknięcia. Generuj 10-krotne impulsy elektroporacyjne za pomocą elektroporatora. Zetrzyj pozostały żel z powierzchni ręcznikiem papierowym.
Usuń szpilki owadów i trzymaj leczone larwy na mokrym ręczniku papierowym przez około jeden dzień w celu wyzdrowienia. Jako reprezentatywny gatunek ważki używamy ważki srokatej, Pseudothemis zonata.
Jest to jeden z najczęstszych gatunków ważek i często spotykany w zacienionych stawach w Japonii. Na koniec pokazujemy protokół RNAi ukierunkowany na odwłok ważki, Pseudothemis zonata. Rozciągnij błonę międzysegmentową między czwartym a piątym segmentem brzusznym.
Zrób mały otwór cienką igłą między czwartym a piątym segmentem brzucha. Włóż końcówkę przygotowanej kapilary do przygotowanego otworu. Wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu siRNA lub dsRNA.
Przymocuj larwę do stałego stojaka za pomocą szpilek. Nanieś dwie kropelki żelu ultradźwiękowego na powierzchnię larwy za pomocą kleszczy. Umieść elektrody na żelu do ultradźwięków z elektrodą dodatnią po stronie wstrzyknięcia.
Generuj 10-krotne impulsy elektroporacyjne za pomocą elektroporatora. Zetrzyj pozostały żel z powierzchni ręcznikiem papierowym. Usuń szpilki owadów i trzymaj leczone larwy na mokrym ręczniku papierowym przez około jeden dzień w celu wyzdrowienia.
Tutaj wybraliśmy gen syntezy melaniny MCO2 jako gen docelowy i EGFP lub bla jako cel kontroli negatywnej. MCO2 jest niezbędny do tworzenia czarnego koloru u różnych owadów. Najpierw pokazujemy wyniki w jamie brzusznej Ischnura senegalensis.
Białe groty strzałek wskazują obszary stłumionej czarnej pigmentacji, w których elektroda dodatnia została umieszczona podczas elektroporacji. Hamowanie pigmentacji obserwowano zarówno po leczeniu siRNA, jak i dsRNA. Wielkość i lokalizacja fenotypu RNAi różniły się znacznie u poszczególnych osób.
Bez elektroporacji nie zaobserwowano fenotypów RNAi, co wskazuje, że elektroporacja jest niezbędna dla RNAi u tego gatunku. Następnie pokazujemy wyniki w klatce piersiowej Ischnura senegalensis. Podobnie zaobserwowano zahamowanie czarnej pigmentacji w okolicy, w której po elektroporacji umieszczono elektrodę dodatnią.
Na koniec pokazujemy wyniki w jamie brzusznej Pseudothemis zonata. Zgodnie z oczekiwaniami, fenotyp RNAi wykryto wokół obszaru, w którym elektroda dodatnia została umieszczona podczas elektroporacji. Potwierdzamy, że metoda RNAi za pośrednictwem elektroporacji jest bardzo przydatna w Odonata.
Może indukować miejscową supresję genów niemal 100% skuteczności przynajmniej w naskórku, gdy dobierzemy odpowiednie etapy rozwojowe. Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z metodą CRISPR/Cas9.
Na przykład obszar, w którym pojawiają się fenotypy RNAi, może być kontrolowany przez położenie elektrody dodatniej podczas elektroporacji, a fenotypy RNAi można łatwo porównać z fenotypami kontrolnymi obok siebie u tej samej osoby. Co więcej, metoda ta nie wymaga mikroiniekcji do maleńkich jaj, dzięki czemu obserwacja fenotypu jest znacznie łatwiejsza i szybsza niż metoda CRISPR/Cas9.
Ponadto metodę tę można zastosować do owadów, których nowo złożone jaja są trudne do zebrania. Na przykład samice Pseudothemis zonata składają jaja podczas lotu, więc bardzo trudno jest zebrać nowo złożone jaja.
Spodziewamy się, że protokół ten może mieć ogólne zastosowanie do organizmów niemodelowych, gdy konwencjonalne RNAi nie działa wydajnie.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji (RNAi) w Odonata, szczególnie ukierunkowany na smukłą ważkę niebieskoogonkową (Ischnura senegalensis) i ważkę Pseudothemis zonata. Metoda radzi sobie z wyzwaniami w analizie funkcji genów u tych owadów, zapewniając niezawodną technikę do badań molekularno-genetycznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Fizjologia owadów
Tło
- Odonata należą do najbardziej pierwotnych owadów.
- Konwencjonalne metody RNAi są nieskuteczne u tych gatunków.
- Elektroporacja oferuje nowatorskie podejście do supresji genów.
- Poprzednie badania podkreśliły potrzebę skutecznych technik molekularnych u organizmów niemodelowych.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnego protokołu RNAi za pomocą elektroporacji u Odonata.
- Wykazanie skuteczności tej metody w analizie funkcji genów.
- Dostarczenie szczegółowego, możliwego do powtórzenia protokołu dla badaczy.
Stosowane metody
- Interferencja RNA za pośrednictwem elektroporacji ukierunkowana na określone segmenty ciała.
- Zastosowanie roztworów siRNA lub dsRNA do supresji genów.
- Zastosowanie żelu ultradźwiękowego i impulsów elektroporacji.
- Odzyskanie traktowanych larw w celu obserwacji fenotypów RNAi.
Główne wyniki
- Skuteczna supresja genów obserwowana u obu gatunków ważek.
- Elektroporacja umożliwiła ukierunkowaną RNAi z wysoką efektywnością.
- Fenotypy różniły się między osobnikami, co wskazuje na skuteczność metody.
- Porównanie z fenotypami kontrolnymi wykazało wyraźne wyniki.
Wnioski
- Interferencja RNA za pośrednictwem elektroporacji jest cennym narzędziem do badania funkcji genów u Odonata.
- Ta metoda jest łatwiejsza i szybsza niż tradycyjne podejścia CRISPR/Cas9.
- Może być zastosowana do innych organizmów niemodelowych, gdzie konwencjonalna RNAi nie działa.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Electroporation-mediated RNA interference (RNAi) in Odonata enables functional genomics in previously intractable insect systems, addressing a critical gap in target validation for non-model organisms. This method provides a robust platform for dissecting gene function in developmental, pigmentation, and morphogenesis pathways, supporting predictive confidence at early discovery inflection points. Its applicability to species with challenging life cycles expands the portfolio of tractable models for biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in ancestral insect lineages.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing spatially controlled gene suppression.
- Supports functional target validation in systems where conventional RNAi is ineffective.
- Improves predictive confidence for pathway and phenotype linkage in non-model organisms.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, localized gene suppression for quantitative phenotype assessment.
- Enables side-by-side comparison of control and experimental phenotypes within the same organism.
- Reduces technical barriers for assay standardization in challenging insect models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene function studies with disease-relevant developmental and pigmentation pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in evolutionary diverse systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying gene-phenotype relationships.
- Offers predictive de-risking for targets conserved across insect and vertebrate models.
Pipeline & Workflow Integration
This electroporation-mediated RNAi protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model development, particularly for non-model and ecologically relevant species.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene function analysis and pathway mapping in Odonata.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts of gene suppression phenotypes.
- Analytics: Enables statistical comparison of pigmentation and morphogenesis outcomes across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges functional genomics in non-model insects to broader preclinical insights.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for gene suppression in species where traditional RNAi fails.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes gene suppression protocols for reproducibility and scalability in non-model organisms.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by expanding tractable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets validated in diverse biological contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect handling, microinjection, and electroporation techniques.
- Needs access to electroporators, microinjection apparatus, and phenotypic imaging tools.
- Demands cross-team standardization for protocol reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different developmental stages or insect species.
- Efficiency and phenotype variability depend on electrode placement and developmental timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:01
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Abdomen of Damselfly (Ischnura senegalensis)
4:21
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Thorax of Damselfly (Ischnura senegalensis)
6:54
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Abdomen of Dragonfly (Pseudothemis zonata)
10:16
Representative Results
11:51
Discussion
