Metoda interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji w Odonata
6 lutego 2021
Udostępniamy szczegółowy protokół interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji u owadów z rzędu Odonata (ważki i ważki) przy użyciu ważki niebieskoogoniastej (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) i ważki srokatej (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Jest to protokół wideo dla metody interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji w Odonata. Ważki i ważki, należące do rzędu Odonata, należą do najbardziej pradawnych owadów. Dorosłe osobniki Odonata wykazują niezwykłą różnorodność kolorów i wzorów ciała, przeprowadzono wiele badań ekologicznych i behawioralnych.
Brakowało jednak badań genetyki molekularnej nad Odonatą, ponieważ analiza funkcjonalna genów jest bardzo trudna. Na przykład konwencjonalna metoda RNAi nie jest skuteczna w przypadku gatunków Odonata. Niedawno opracowaliśmy metodę RNAi w połączeniu z elektroporacją in vivo.
W tym miejscu udostępniamy protokół wideo dla RNAi za pośrednictwem elektroporacji zarówno u ważek, jak i ważek. Jako nasz reprezentatywny gatunek ważki używamy ważki niebieskoogoniastej, Ischnura senegalensis.
Jest to jeden z najczęstszych gatunków ważek i często spotykany w słonecznych stawach w Japonii. Po pierwsze, pokazujemy protokół RNAi ukierunkowany na brzuch ważki, Ischnura senegalensis. Po lodowatym znieczuleniu przymocuj dwie szpilki po obu stronach przedpiersia i przymocuj larwę do stałego stojaka.
Pociągnij i rozciągnij błonę międzysegmentową między siódmym a ósmym segmentem brzusznym za pomocą kleszczy. Utrzymuj membranę międzysegmentową rozciągniętą ręcznie. Włóż końcówkę przygotowanej kapilary do rozciągniętej membrany międzysegmentowej.
Wstrzyknąć 1 mikrolitr roztworu siRNA lub dsRNA. Nanieś dwie kropelki żelu ultradźwiękowego na powierzchnię larwy za pomocą kleszczy. Umieść elektrody na żelu do ultradźwięków, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się po stronie wstrzyknięcia.
Generuj 10-krotne impulsy elektroporacyjne za pomocą elektroporatora. Zetrzyj pozostały żel z powierzchni ręcznikiem papierowym. Usuń szpilki owadów i trzymaj leczone larwy na mokrym ręczniku papierowym przez około jeden dzień w celu wyzdrowienia.
Następnie pokazujemy protokół RNAi ukierunkowany na klatkę piersiową ważki, Ischnura senegalensis. Po lodowatym znieczuleniu przymocuj dwie szpilki po obu stronach przedpiersia i przymocuj larwę do stałego stojaka. Pociągnij i rozciągnij błonę międzysegmentową między przedpiersiem a synthorax za pomocą ręki.
Włóż końcówkę przygotowanej kapilary do rozciągniętej membrany międzysegmentowej. Wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu siRNA lub dsRNA. Nanieś dwie kropelki żelu ultradźwiękowego na powierzchnię larwy za pomocą kleszczy.
Umieścić elektrody na żelu ultradźwiękowym z elektrodą dodatnią po stronie wstrzyknięcia. Generuj 10-krotne impulsy elektroporacyjne za pomocą elektroporatora. Zetrzyj pozostały żel z powierzchni ręcznikiem papierowym.
Usuń szpilki owadów i trzymaj leczone larwy na mokrym ręczniku papierowym przez około jeden dzień w celu wyzdrowienia. Jako reprezentatywny gatunek ważki używamy ważki srokatej, Pseudothemis zonata.
Jest to jeden z najczęstszych gatunków ważek i często spotykany w zacienionych stawach w Japonii. Na koniec pokazujemy protokół RNAi ukierunkowany na odwłok ważki, Pseudothemis zonata. Rozciągnij błonę międzysegmentową między czwartym a piątym segmentem brzusznym.
Zrób mały otwór cienką igłą między czwartym a piątym segmentem brzucha. Włóż końcówkę przygotowanej kapilary do przygotowanego otworu. Wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu siRNA lub dsRNA.
Przymocuj larwę do stałego stojaka za pomocą szpilek. Nanieś dwie kropelki żelu ultradźwiękowego na powierzchnię larwy za pomocą kleszczy. Umieść elektrody na żelu do ultradźwięków z elektrodą dodatnią po stronie wstrzyknięcia.
Generuj 10-krotne impulsy elektroporacyjne za pomocą elektroporatora. Zetrzyj pozostały żel z powierzchni ręcznikiem papierowym. Usuń szpilki owadów i trzymaj leczone larwy na mokrym ręczniku papierowym przez około jeden dzień w celu wyzdrowienia.
Tutaj wybraliśmy gen syntezy melaniny MCO2 jako gen docelowy i EGFP lub bla jako cel kontroli negatywnej. MCO2 jest niezbędny do tworzenia czarnego koloru u różnych owadów. Najpierw pokazujemy wyniki w jamie brzusznej Ischnura senegalensis.
Białe groty strzałek wskazują obszary stłumionej czarnej pigmentacji, w których elektroda dodatnia została umieszczona podczas elektroporacji. Hamowanie pigmentacji obserwowano zarówno po leczeniu siRNA, jak i dsRNA. Wielkość i lokalizacja fenotypu RNAi różniły się znacznie u poszczególnych osób.
Bez elektroporacji nie zaobserwowano fenotypów RNAi, co wskazuje, że elektroporacja jest niezbędna dla RNAi u tego gatunku. Następnie pokazujemy wyniki w klatce piersiowej Ischnura senegalensis. Podobnie zaobserwowano zahamowanie czarnej pigmentacji w okolicy, w której po elektroporacji umieszczono elektrodę dodatnią.
Na koniec pokazujemy wyniki w jamie brzusznej Pseudothemis zonata. Zgodnie z oczekiwaniami, fenotyp RNAi wykryto wokół obszaru, w którym elektroda dodatnia została umieszczona podczas elektroporacji. Potwierdzamy, że metoda RNAi za pośrednictwem elektroporacji jest bardzo przydatna w Odonata.
Może indukować miejscową supresję genów niemal 100% skuteczności przynajmniej w naskórku, gdy dobierzemy odpowiednie etapy rozwojowe. Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z metodą CRISPR/Cas9.
Na przykład obszar, w którym pojawiają się fenotypy RNAi, może być kontrolowany przez położenie elektrody dodatniej podczas elektroporacji, a fenotypy RNAi można łatwo porównać z fenotypami kontrolnymi obok siebie u tej samej osoby. Co więcej, metoda ta nie wymaga mikroiniekcji do maleńkich jaj, dzięki czemu obserwacja fenotypu jest znacznie łatwiejsza i szybsza niż metoda CRISPR/Cas9.
Ponadto metodę tę można zastosować do owadów, których nowo złożone jaja są trudne do zebrania. Na przykład samice Pseudothemis zonata składają jaja podczas lotu, więc bardzo trudno jest zebrać nowo złożone jaja.
Spodziewamy się, że protokół ten może mieć ogólne zastosowanie do organizmów niemodelowych, gdy konwencjonalne RNAi nie działa wydajnie.
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy protokół interferencji RNA (RNAi) z wykorzystaniem elektroporacji u przedstawicieli rzędu Odonata, ze szczególnym uwzględnieniem widłoćki senegalskiej (Ischnura senegalensis) oraz ważki Pseudothemis zonata. Metoda ta pozwala rozwiązać problemy związane z funkcjonalną analizą genów u tych owadów, zapewniając wiarygodną technikę do prowadzenia badań z zakresu genetyki molekularnej.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genetyka
- Fizjologia owadów
Wstęp
- Odonata należą do jednych z najbardziej prymitywnych owadów.
- Konwencjonalne metody RNAi są nieskuteczne u tych gatunków.
- Elektroporacja oferuje nowatorskie podejście do supresji genów.
- Poprzednie badania podkreśliły potrzebę stosowania skutecznych technik molekularnych u organizmów niemodelowych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu RNAi z wykorzystaniem elektroporacji u Odonata.
- Wykazanie skuteczności tej metody w analizie funkcjonalnej genów.
- Dostarczenie szczegółowego, powtarzalnego protokołu dla badaczy.
Zastosowane metody
- RNAi za pomocą elektroporacji ukierunkowana na konkretne segmenty ciała.
- Wykorzystanie roztworów siRNA lub dsRNA do supresji genów.
- Zastosowanie żelu do USG oraz impulsów elektroporacyjnych.
- Odzyskiwanie poddanych zabiegowi larw w celu obserwacji fenotypów RNAi.
Główne wyniki
- Odnotowano skuteczne wyciszanie genów u gatunków równoskrzydełków i ważek.
- Elektroporacja umożliwiła ukierunkowany RNAi z wysoką wydajnością.
- Fenotypy różniły się między osobnikami, co wskazuje na skuteczność metody.
- Porównanie z fenotypami kontrolnymi wykazało wyraźne wyniki.
Wnioski
- RNAi z wykorzystaniem elektroporacji jest cennym narzędziem do badania funkcji genów u Odonata.
- Metoda ta jest prostsza i szybsza niż tradycyjne podejścia CRISPR/Cas9.
- Można ją zastosować u innych organizmów niemodelowych, w których konwencjonalne RNAi okazuje się nieskuteczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Interferencja RNA (RNAi) indukowana elektroporacją u Odonata umożliwia genomikę funkcjonalną w systemach owadziego, które wcześniej były niepodatne na badania, wypełniając krytyczną lukę w walidacji celów dla organizmów niemodelowych. Metoda ta zapewnia solidną platformę do analizy funkcji genów w szlakach rozwoju, pigmentacji i morfogenezy, zwiększając pewność predykcyjną w wczesnych punktach zwrotnych procesu odkrywania. Jej zastosowanie u gatunków o trudnych cyklach życiowych rozszerza portfolio dostępnych modeli dla badawczo-rozwojowych działań w branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji genów w linii przodków owadów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie przestrzennie kontrolowanej supresji genów.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów w systemach, w których konwencjonalne RNAi jest nieskuteczne.
- Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie powiązań między szlakami a fenotypami u organizmów niedowlanych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych etapów procesów screeningu fenotypowego.
- Zapewnia powtarzalne, zlokalizowane wyciszanie genów w celu ilościowej oceny fenotypu.
- Umożliwia bezpośrednie porównanie fenotypów kontrolnych i eksperymentalnych w obrębie tego samego organizmu.
- Redukuje bariery techniczne w standaryzacji testów w trudnych modelach owadzych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie badań nad funkcją genów z szlakami rozwojowymi i pigmentacyjnymi istotnymi dla przebiegu chorób.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w systemach o zróżnicowanej ewolucyjnie budowie.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka poprzez wyjaśnianie relacji gen-fenotyp.
- Oferuje predykcyjną redukcję ryzyka dla celów terapeutycznych konserwowanych w modelach owadów i kręgowców.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół RNAi oparty na elektroporacji wpisuje się w proces badawczy – od wczesnej weryfikacji hipotez po opracowanie modeli przedklinicznych, w szczególności w przypadku gatunków niemodelowych i istotnych ekologicznie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę funkcji genów opartą na hipotezach oraz mapowanie szlaków sygnałowych u Odonata.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty fenotypów supresji genów.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie efektów pigmentacji i morfogenezy w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy genomikę funkcjonalną owadów niebędących organizmami modelowymi z szerszymi wnioskami przedklinicznymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Ustanawia wielokrotnego użytku schemat postępowania w zakresie supresji genów u gatunków, w których tradycyjne RNAi zawodzi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły supresji genów w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w organizmach niemodelowych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez rozszerzenie dostępnych systemów modelowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów zwalidowanych w różnorodnych kontekstach biologicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z owadami, mikroiniekcji oraz technikach elektroporacji.
- Wymaga dostępu do elektroporatorów, aparatury do mikroiniekcji oraz narzędzi do obrazowania fenotypowego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności protokołu i porównywalności danych.
- Może wymagać adaptacji dla różnych stadiów rozwojowych lub gatunków owadów.
- Wydajność i zmienność fenotypu zależą od rozmieszczenia elektrod oraz czasu rozwojowego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:01
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Abdomen of Damselfly (Ischnura senegalensis)
4:21
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Thorax of Damselfly (Ischnura senegalensis)
6:54
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Abdomen of Dragonfly (Pseudothemis zonata)
10:16
Representative Results
11:51
Discussion
