Indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem

Model nadtlenku wodoru jest prostym i skutecznym podejściem do oceny działania przeciwutleniającego czynników, które mogą być przydatne w leczeniu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem lub podobnych chorób neurodegeneracyjnych. Środek utleniający, nadtlenek wodoru, jest dostarczany w jednym impulsie, dzięki czemu jest szybszy i prostszy do wykonania niż modele, w których leczenie nadtlenkiem wodoru należy powtarzać przez kilka dni. Ponieważ liczba wysianych komórek wpływa na efekt oksydacyjny zabiegu, ważne jest, aby dokładnie policzyć komórki przed ich hodowlą.

Procedurę zademonstruje Thais Bascuas, doktor habilitowany z laboratorium Gabriele Thumann. W przypadku przygotowania kondycjonowanej pożywki, 28 dni po transfekcji z PEDF, GM-CSF lub oba, wysiewa się kolby ludzkiej linii komórkowej ARPE-19 T-75 z 500 000 komórek na mililitr całkowitego stężenia pożywki. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, zastąp supernatant świeżą, kompletną pożywką i zbierz nowy supernatant po 24 godzinach.

Aby oczyścić znakowane histydyną białka GM-CSF i PEDF, odwiruj supernatant w celu wyeliminowania potencjalnych pozostałych komórek i odłóż próbkę na bok. Następnie dodaj 30 mikrolitrów roztworu niklu NTA do 1,5 mililitrowej probówki. Po odwirowaniu wyrzuć niklowy przepływowy NTA i przemyj osad dwa razy 200 mikrolitrami buforu inkubacyjnego 1X na mycie.

Po drugim przemyciu ponownie zawiesić osad w 40 mikrolitrach buforu inkubacyjnego 4X i 900 mikrolitrach odwirowanej, kondycjonowanej pożywki. Inkubować kondycjonowany roztwór pożywki przez godzinę w temperaturze pokojowej i 70 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę i przemyć osad dwa razy 175 mikrolitrami 1X inkubacji na przemycie.

Po drugim płukaniu dodać 20 mikrolitrów buforu elucyjnego na 20-minutową inkubację przy 70 obrotach na minutę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę. Odstawić na bok supernatant i określić ilościowo całkowite białko eluowane w teście białka BCA zgodnie ze standardowymi protokołami.

W celu traktowania nietransfekowanych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki kondycjonowaną pożywką i nadtlenkiem wodoru, należy wysiać 3000 komórek w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do 24-godzinnej inkubacji w inkubatorze hodowli komórkowych. Następnego ranka zastąp supernatanty 200 mikrolitrami kondycjonowanej pożywki na studzienkę i wróć do inkubatorów do hodowli komórkowych na 10 dni. W 11 dniu hodowli należy traktować komórki 350-mikromolowym nadtlenkiem wodoru w kompletnej pożywce przez 24 godziny.

W przypadku traktowania nietransfekowanych komórek RPE oczyszczonym lub dostępnym w handlu PEDF i/lub GM-CSF, należy wysiać 3000 komórek w 200 mikrolitrach kompletnej pożywki uzupełnionej 500 nanogramami na mililitr rekombinowanego PEDF i/lub 50 nanogramami na mililitr rekombinantu do GM-CSF na studzienkę przez 48-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty kompletną pożywką zawierającą 350 mikromolowy nadtlenek wodoru i 500 nanogramów na mililitr PEDF i/lub 50 nanogramów na mililitr GM-CSF na studzienkę przez 24 godziny. W przypadku leczenia nadtlenkiem wodoru transfekowanych komórek RPE, należy wyhodować 5 000 transfekowanych komórek w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża na dołek przez 24 godziny w inkubatorze hodowli komórkowych, a następnie poddać komórki działaniu 350 mikromolowego nadtlenku wodoru, jak pokazano.

Aby zmierzyć poziomy glutationu wytwarzanego w transfekowanych komórkach z nadmierną ekspresją PEDF i / lub GM-CSF, lub komórkach nietransfekowanych wstępnie potraktowanych czynnikiem wzrostu po leczeniu nadtlenkiem wodoru, zastąp supernatant w każdym dołku 100 mikrolitrami świeżo przygotowanej mieszanki odczynników 1X na studzienkę i mieszaj komórki z mieszaniną odczynników przez 14 sekund z prędkością 500 obrotów na minutę na wytrząsarce orbitalnej. Po wstrząśnięciu inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed dodaniem 100 mikrolitrów odczynnika do wykrywania lucyferyny do każdej studzienki. Mieszaj roztwór przez 15 sekund na shakerze, a następnie 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji załaduj płytkę do czytnika płytek i wybierz opcję Zmień układ. W zakładce Parametry podstawowe należy wybrać płytkę 96-dołkową i optykę górną, a opóźnienie pozycjonowania ustawić na 0,1, czas rozpoczęcia pomiaru na zero, czas interwału pomiaru na jeden, a czas normalizacji wyników na zero. Zdefiniuj ślepe próby, wzorce i próbki, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiar.

Następnie wyeksportuj dane jako plik arkusza kalkulacyjnego i oblicz stężenie glutationu w każdej próbce poprzez interpolację krzywej standardowej. Aby zmierzyć żywotność komórek, zastąp supernatant w każdym dołku 100 mikrolitrami kompletnej pożywki uzupełnionej 1% FBS na studzienkę i umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych do czasu analizy. Po pobraniu nietraktowanych komórek ARPE-19 z hodowli, ponownie zawiesić komórki w ilości 100 000 komórek na mililitr w pożywce DMEM Hams F-12 uzupełnionej stężeniem 1% FBS.

Następnie należy przygotować siedem seryjnych rozcieńczeń 1:1 w 200 mikrolitrach pożywki uzupełnionej 1% FBS i przenieść 100 mikrolitrów każdego wzorca do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki w dwóch egzemplarzach. Dodaj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki odczynników do wszystkich dołków i mieszaj komórki z mieszanką przez 15 sekund na wytrząsarce przed inkubacją płytki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zmierzyć luminescencję, jak pokazano.

Po uzyskaniu pomiaru dodaj 50 mikrolitrów odczynnika do lizy do każdej studzienki na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zmierz luminescencję i użyj wzoru do obliczenia procentu żywych komórek. 24-godzinne leczenie 50- i 100-mikromolowym nadtlenkiem wodoru nie wpływa na wewnątrzkomórkową produkcję glutationu, podczas gdy znaczny spadek glutationu obserwuje się, gdy komórki są traktowane 350-500 lub 700-mikromolowym nadtlenkiem wodoru koncentracja. Morfologicznie komórki poddane działaniu nadtlenku wodoru wydają się mniej rozproszone i bardziej zaokrąglone wraz ze wzrostem stężenia związku.

Efekt ten był mniej widoczny w przypadku komórek transfekowanych PEDF i GM-CSF traktowanych nadtlenkiem wodoru. Ważne jest, aby pamiętać, że liczba komórek wpływa na stres oksydacyjny za pośrednictwem nadtlenku wodoru, ponieważ poziom glutationu był statystycznie istotnie obniżony po leczeniu nadtlenkiem wodoru w studzienkach obsianych tylko 5 000 komórek. Komórki traktowane lub transfekowane w celu ekspresji PEDF i/lub GM-CSF wytwarzają znacznie więcej glutationu w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi w warunkach oksydacyjnych.

Ponadto poziom ekspresji genu UCP2 w komórkach transfekowanych PEDF i GM-CSF jest zwiększony po nadtlenku wodoru, chociaż wzrost ten nie jest statystycznie istotny. Analiza Western blot fosforylowanego AKT z lizatu komórek transfekowanych GM-CSF wystawionych na działanie nadtlenku wodoru wykazuje tylko niewielki spadek fosforylacji w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi, co wskazuje, że GM-CSF może chronić komórki przed uszkodzeniem przez stres oksydacyjny. Ważne jest, aby wysiewać komórki o odpowiedniej gęstości, używać świeżego roztworu nadtlenku wodoru i dodawać świeże białka do pożywki.

Po potwierdzeniu przeciwutleniającego działania czynników wzrostu za pomocą modelu nadtlenku wodoru, czynniki te można przetestować w modelu choroby oczu związanej ze stresem oksydacyjnym. Obecny model stresu oksydacyjnego nadtlenku wodoru pozwala na ocenę efektów przeciwutleniających, jakie mogą mieć różne czynniki, a tym samym wspiera rozwój nowych terapii genowych.