Name: Indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę indukcji stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocą H2O2. Protokół umożliwia ocenę działania antyoksydacyjnego białek w leczeniu zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Greggowi Sealy'emu i Alainowi Conti za doskonałą pomoc techniczną oraz prof. Zsuzsannie Izsvák z Centrum Maxa-Delbrücka w Berlinie za uprzejme dostarczenie plazmidów pSB100X i pT2-CAGGS-Venus. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauk i Komisję Europejską w ramach siódmego programu ramowego. Projekt Z.I został sfinansowany przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

<ol><li>Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+ARPE-19+cultures%3A+Do+melanosomes+confer+cytoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection.</a> Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).</li>
<li>Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+macular+carotenoid+lutein+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells.</a> Antioxidants. 6 (4), (2017).</li>
<li>Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+current+and+future+management+of+geographic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Review of current and future management of geographic atrophy.</a> Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).</li>
<li>Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Interventions+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Recent developments in age-related macular degeneration: a review.</a> Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).</li>
<li>Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+complement+membrane+attack+complex+in+dry+and+wet+AMD+-+From+hypothesis+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials.</a> Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).</li>
<li>Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and reactive oxygen species.</a> Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).</li>
<li>Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Alhasani, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gypenosides+protect+retinal+pigment+epithelium+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress.</a> Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).</li>
<li>National Institute of Health. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics">https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics</a> (2020).</li>
<li>Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).</li>
<li>He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+improves+mitochondrial+function+in+RPE+cells+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).</li>
<li>Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytokine+profiles+of+human+retinal+pigment+epithelium%3A+Oxidant+injury+and+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence.</a> Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).</li>
<li>Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+expression+affects+the+oxidative+and+inflammatory+state+of+choroidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells.</a> Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).</li>
<li>Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolato%2C+F+%22Retinal+Degenerative+Diseases%22">Retinal Degenerative Diseases</a>. , Springer. 699-706 (2016).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+the+ERK1%2F2+pathways+and+protects+injured+retinal+ganglion+cells+from+induced+death%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death.</a> Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+protects+rat+photoreceptors+from+death+by+activating+the+SRC-dependent+signalling+and+elevating+anti-apoptotic+factors+and+neurotrophins%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Archives+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins.</a> Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).</li>
<li>Thumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+PEDF-expressing+primary+pigment+epithelial+cells+by+the+SB+transposon+system+delivered+by+pFAR4+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).</li>
<li>Garcia-Garcia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+PEDF+release+in+rat+iris+and+retinal+epithelial+cells+after+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+and+neurogenic+activities+of+Sleeping+Beauty-mediated+PEDF-transfected+RPE+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+H2O2-%2C+HNE-%2C+or+tBH-treated+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).</li>
<li>Allen, R. G., Tresini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and gene regulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).</li>
<li>Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+H2O2+induce+catalase+and+metallothionein+gene+expression+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).</li>
<li>Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide in the human body.</a> FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).</li>
<li>Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+correlation+between+the+levels+of+ascorbic+acid+and+H2O2+in+aqueous+humor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor.</a> Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).</li>
<li>Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KGF+prevents+oxygen-mediated+damage+in+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).</li>
<li>Campochiaro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+gene+transfer+of+endostatin%2Fangiostatin+for+macular+degeneration+%28GEM%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study.</a> Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).</li>
<li>Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+affects+retinal+pigment+epithelial+cell+survival+through+epidermal+growth+factor+receptor%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway.</a> International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).</li>
<li>Tu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allicin+attenuates+H2O2+-+induced+cytotoxicity+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+by+regulating+the+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species.</a> Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).</li>
<li>Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piceatannol+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+hydrogen+peroxide+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+through+modulating%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating.</a> Nutrients. 11, 1-13 (2019).</li>
<li>Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+causes+significant+mitochondrial+DNA+damage+in+human+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells.</a> Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+overexpression+of+uncoupling+protein+2+attenuates+salt-induced+vascular+dysfunction+by+inhibition+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress.</a> American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li>
<li>Mátés, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html">https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html</a> (2020).</li>
<li>Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx">https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx</a> (2020).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%5E%28-%CE%94%CE%94CT%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).</li>
<li>Bascuas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-virally+transfected+primary+human+pigment+epithelium+cells+overexpressing+the+oxidative+stress+reduction+factors+PEDF+and+GM-CSF+to+treat+retinal+neurodegeneration+neurodegenerationl%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).</li>
<li>Zhuge, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fullerenol+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+stress-induced+premature+senescence+via+activating+SIRT1%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).</li>
<li>Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+H2O2+Availability+to+ARPE-19+cultures+in+models+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).</li>
<li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+oxidative+stress+via+upregulation+of+UCP2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).</li>
<li>Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCP2%2C+a+mitochondrial+protein+regulated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół oferuje podejście do analizy funkcji antyoksydacyjnej i ochronnej PEDF i GM-CSF wytwarzanych przez transfekowane komórki, które można zastosować do komórek transfekowanych dowolnym przypuszczalnie korzystnym genem. W genowych strategiach terapeutycznych, które mają na celu dostarczanie białek do tkanek poprzez przeszczepianie genetycznie zmodyfikowanych komórek, kluczowe znaczenie ma uzyskanie informacji na temat poziomu ekspresji białka, długowieczności ekspresji i skuteczności wyrażonego bi...

Opisany tutaj model oferuje użyteczne podejście do oceny skuteczności środków biofarmaceutycznych w zmniejszaniu stresu oksydacyjnego w komórkach. Wykorzystaliśmy model do zbadania ochronnego wpływu PEDF i GM-CSF na stres oksydacyjny za pośrednictwemH2O2na komórki nabłonka barwnikowego siatkówki, które są narażone na wysoki poziomO2 i światło widzialne, oraz fagocytozę błon zewnętrznych segmentów fotoreceptorów, generując znaczne poziomy reaktywnych form tlenu (ROS)1, 2. Uważa się, że są one głównym czynnikiem przyczyniającym się do patogenezy beznaczyniowego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (aAMD)3,4,5,6,7,8. Poza tym następuje spadek czynników neuroprotekcyjnych syntetyzowanych przez RPE, w szczególności czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego (PEDF), insulinopodobnych czynników wzrostu (IGF) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF), co prowadzi do dysfunkcji i utraty komórek RPE, a następnie do śmierci fotoreceptorów i komórek zwojowych siatkówki (RGC)3,4,5. AMD jest złożoną chorobą, która wynika z interakcji między czynnikami metabolicznymi, funkcjonalnymi, genetycznymi i środowiskowymi4. Brak leczenia aAMD jest główną przyczyną ślepoty u pacjentów w wieku powyżej 60 lat w krajach uprzemysłowionych9,10. Odtworzenie neuroprotekcyjnego i neurogennego środowiska siatkówki poprzez podsiatkówkowe przeszczepienie genetycznie zmodyfikowanych komórek RPE z nadekspresją PEDF i GM-CSF może potencjalnie zapobiegać zwyrodnieniu siatkówki poprzez łagodzenie skutków stresu oksydacyjnego, hamowanie stanu zapalnego i wspieranie przeżycia komórek11,12,13,14,15,16. Mimo że istnieje kilka metodologii dostarczania genów do komórek, wybraliśmy niewirusowy, nadpobudliwy system transpozonów Sleeping Beauty, aby dostarczyć geny PEDF i GM-CSF do komórek RPE ze względu na jego profil bezpieczeństwa, integrację genów z genomem komórek gospodarza i skłonność do integracji dostarczonych genów w miejscach nieaktywnych transkrypcyjnie, jak pokazaliśmy wcześniej17, 18,19.
Stres oksydacyjny w komórkach hodowanych in vitro może być indukowany przez kilka czynników utleniających, w tym nadtlenek wodoru (H2O2), 4-hydroynonenal (HNE), tertbutylohydronadtlenek (tBH), wysokie napięcia tlenu i światło widzialne (pełne spektrum lub promieniowanie UV)20,21. Wysokie napięcie tlenu i światło wymagają specjalnego sprzętu i warunków, co ogranicza możliwość przenoszenia do innych systemów. Czynniki takie jakH2O2, HNE i tBH indukują nakładające się na siebie zmiany molekularne i komórkowe stresu oksydacyjnego. WybraliśmyH2O2do przetestowania aktywności przeciwutleniającej PEDF i GM-CSF, ponieważ jest to wygodne i biologicznie istotne, ponieważ jest wytwarzane przez komórki RPE jako reaktywny produkt pośredni tlenu podczas fagocytozy zewnętrznego segmentu fotoreceptora22 i znajduje się w tkankach oka in vivo23. Ponieważ utlenianie glutationu może być częściowo odpowiedzialne za produkcjęH2O2w oku, w naszych badaniach przeanalizowaliśmy poziomy GSH/glutationu, które są związane ze stresem oksydacyjnym wywołanym przezH2O2i zdolnością regeneracyjną komórek21,22. Analiza poziomu glutationu jest szczególnie istotna, ponieważ uczestniczy on w antyoksydacyjnych mechanizmach ochronnych w klasie eye<sup="xref">24. Narażenie naH2O2 jest często używane jako model do badania podatności na stres oksydacyjny i aktywności przeciwutleniającej komórek RPE1,25,26,27,28,29,30, a dodatkowo wykazuje podobieństwa do uszkodzeń spowodowanych stresem oksydacyjnym wywołanym światłem, "fizjologicznym" źródłem stresu oksydacyjnego21.
Aby ocenić funkcjonalność i skuteczność czynników neuroprotekcyjnych, opracowaliśmy model in vitro, który pozwala na analizę w celu ilościowego określenia antyoksydacyjnego wpływu czynników wzrostu wyrażanych przez komórki genetycznie zmodyfikowane do nadekspresji PEDF i GM-CSF. Tutaj pokazujemy, że komórki RPE transfekowane genami PEDF i GM-CSF są bardziej odporne na szkodliwe działanieH2O2niż nietransfekowane komórki kontrolne, o czym świadczy morfologia komórki, gęstość, żywotność, wewnątrzkomórkowy poziom glutationu i ekspresja genu UCP2, który koduje mitochondrialne białko rozprzęgające 2, które, jak wykazano, redukuje reaktywne formy tlenu (ROS)31.

<table><tbody><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe</td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana biała z przezroczystym płaskim dnem&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3610</td><td>Pozwala na sprawdzenie komórek przed pomiarem luminescencji (test GSH-Glo)</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Akrylamid 40%</td><td>Biorad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>AMIMED</td><td>4-05F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GMCSF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PA5-24184</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie IgG/IgA/IgM&nbsp;</td><td>Przeciwciało Agilent</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>anty-PEDF&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-390172</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-penta-His&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fosfo-Akt</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG H & L-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko królikowi Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>ThermoFisher Naukowy&nbsp;</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało kozie anty-myszy Alexa 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa ARPE-19</td><td></td><td>ATCC CRL-2302</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td>Szkiełka szklane <td>komorowe Sigma-Aldrich</td><td>A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>354118</td><td></td></tr><tr><td>Test cytotoksyczności CytoTox-Glo&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Duo Set Zestaw ELISA</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>DY215-05</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>ELISAzestaw ilościowy</td><td>BioProducts MD</td><td>PED613-10-Ludzkie</td><td></td></tr><tr><td>oczy (człowiek)</td><td>Lwy Dar Wzroku Bank Oczu (Saint Paul, MN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Wodny środek montażowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek FLUOstar Omega&nbsp;</td><td>Oprogramowanie BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (wersja 8.0)</td><td>Oprogramowanie GraphPad, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test glutationu GSH-Glo</td><td>Promega</td><td>V6912</td><td></td></tr><tr><td>nadtlenek wodoru (H2O2)</td><td>Oprogramowanie Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (program do przetwarzania obrazu)</td><td>W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997&ndash; 2014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol&nbsp;</td><td>Mikroskop Axonlab</td><td>A1378.0010</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI4000B&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SW1.5.1</td><td>Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Axonlab</td><td>3468.1000</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>System Transfekcji Neonowej 10 & mikro; L Zestaw</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Komora Neubauer</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-3197</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania żelowego Omega Lum G</td><td>Aplegen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quantabio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA&nbsp;</td><td>Podkłady ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td>Patrz tabela 1 w materiałach uzupełniających</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&mikro; L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute; t&eaostry; S i wsp., 2009. Dostarczone przez prof. Zsuzsanna Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-Jego plazmidowe DNA (250 ng/&mikro; L)</td><td></td><td></td> <td>Skonstruowany przy użyciu istniejącego plazmidu pT2-CMV-PEDF-EGFP opisanego w Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-Jego plazmidowe DNA (250 ng/&mikro; L)</td><td></td><td></td> <td>Skonstruowany przy użyciu istniejącego plazmidu pT2-CMV-PEDF-EGFP opisanego w Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany hGM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany hPEDF&nbsp; &nbsp;</td><td>BioProductsMD</td><td>004-096</td><td></td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Miniprep</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNaz bez RNaz</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Transfer półsuchy system do WB&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperMix qScript</td><td>Quantabio</td><td>95048-025</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tween AppliChem&nbsp;</td><td>A1390</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże WesternBright ECL HRP</td><td>Advansta</td><td>K-12045-D50</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa Whatman</td><td>Chemie Brunschwig</td><td>MNSC04530301</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach zwyrodnieniowych, w tym w zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), patologii, która dotyka ~30 milionów pacjentów na całym świecie. Prowadzi to do zmniejszenia liczby czynników neuroprotekcyjnych syntetyzowanych przez nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE), np. czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego (PEDF) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), a następnie utraty komórek RPE, a ostatecznie śmierci fotoreceptorów i komórek zwojowych siatkówki (RGC). Stawiamy hipotezę, że odtworzenie neuroprotekcyjnego i neurogennego środowiska siatkówki przez podsiatkówkowy przeszczep transfekowanych komórek RPE z nadekspresją PEDF i GM-CSF może potencjalnie zapobiegać zwyrodnieniu siatkówki poprzez łagodzenie skutków stresu oksydacyjnego, hamowanie stanu zapalnego i wspieranie przeżycia komórek. Korzystając z systemu transpozonów Sleeping Beauty (SB100X), ludzkie komórki RPE zostały transfekowane genami PEDF i GM-CSF i wykazały stabilną integrację genów, długoterminową ekspresję genów i wydzielanie białek za pomocą qPCR, western blot, ELISA i immunofluorescencji. Aby potwierdzić funkcjonalność i siłę działania PEDF i GM-CSF wydzielanych przez transfekowane komórki RPE, opracowaliśmy test in vitro w celu ilościowego określenia redukcji stresu oksydacyjnego wywołanego przezH2O2na komórkach RPE w hodowli. Ochronę komórek oceniano, analizując morfologię komórki, gęstość, wewnątrzkomórkowy poziom glutationu, ekspresję genu UCP2 i żywotność komórek. Zarówno transfekowane komórki RPE z nadekspresją PEDF i / lub GM-CSF, jak i komórki nietransfekowane, ale wstępnie potraktowane PEDF i / lub GM-CSF (dostępne na rynku lub oczyszczone z transfekowanych komórek) wykazywały znaczną ochronę komórek przeciwutleniających w porównaniu z kontrolami nieleczonymi. Obecny modelH2O2-Model jest prostym i skutecznym podejściem do oceny działania przeciwutleniającego czynników, które mogą być skuteczne w leczeniu AMD lub podobnych chorób neurodegeneracyjnych.

Indukcja stresu oksydacyjnego w ludzkich komórkach nabłonka pigmentowego siatkówki 
Komórki ARPE-19 oraz pierwotne komórki hRPE poddano działaniu różnych stężeń H2O2 przez 24 h, a następnie oznaczono wewnątrzkomórkowy poziom antyoksydacyjnego glutationu (Rycina 2A,B). Stężenia H2O2 wynoszące 50 µM i 100 µM nie wpłynęły na produkcję glutationu, podczas gdy przy stężeniu 350 µM odn...

Przedstawiamy protokół rozwoju i wykorzystania modelu stresu oksydacyjnego poprzez traktowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocąH2O2, analizując morfologię komórek, żywotność, gęstość, glutation i poziom UCP-2. Jest to użyteczny model do badania działania przeciwutleniającego białek wydzielanych przez komórki transpozonowe w celu leczenia zwyrodnienia neuroretinalnego.

Indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Model nadtlenku wodoru jest prostym i skutecznym podejściem do oceny działania przeciwutleniającego czynników, które mogą być przydatne w leczeniu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem lub podobnych chorób neurodegeneracyjnych. Środek utleniający, nadtlenek wodoru, jest dostarczany w jednym impulsie, dzięki czemu jest szybszy i prostszy do wykonania niż modele, w których leczenie nadtlenkiem wodoru należy powtarzać przez kilka dni. Ponieważ liczba wysianych komórek wpływa na efekt oksydacyjny zabiegu, ważne jest, aby dokładnie policzyć komórki przed ich hodowlą.Procedurę zademonstruje Thais Bascuas, doktor habilitowany z laboratorium Gabriele Thumann. W przypadku przygotowania kondycjonowanej pożywki, 28 dni po transfekcji z PEDF, GM-CSF lub oba, wysiewa się kolby ludzkiej linii komórkowej ARPE-19 T-75 z 500 000 komórek na mililitr całkowitego stężenia pożywki. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, zastąp supernatant świeżą, kompletną pożywką i zbierz nowy supernatant po 24 godzinach.Aby oczyścić znakowane histydyną białka GM-CSF i PEDF, odwiruj supernatant w celu wyeliminowania potencjalnych pozostałych komórek i odłóż próbkę na bok. Następnie dodaj 30 mikrolitrów roztworu niklu NTA do 1,5 mililitrowej probówki. Po odwirowaniu wyrzuć niklowy przepływowy NTA i przemyj osad dwa razy 200 mikrolitrami buforu inkubacyjnego 1X na mycie.Po drugim przemyciu ponownie zawiesić osad w 40 mikrolitrach buforu inkubacyjnego 4X i 900 mikrolitrach odwirowanej, kondycjonowanej pożywki. Inkubować kondycjonowany roztwór pożywki przez godzinę w temperaturze pokojowej i 70 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę i przemyć osad dwa razy 175 mikrolitrami 1X inkubacji na przemycie.Po drugim płukaniu dodać 20 mikrolitrów buforu elucyjnego na 20-minutową inkubację przy 70 obrotach na minutę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę. Odstawić na bok supernatant i określić ilościowo całkowite białko eluowane w teście białka BCA zgodnie ze standardowymi protokołami.W celu traktowania nietransfekowanych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki kondycjonowaną pożywką i nadtlenkiem wodoru, należy wysiać 3000 komórek w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do 24-godzinnej inkubacji w inkubatorze hodowli komórkowych. Następnego ranka zastąp supernatanty 200 mikrolitrami kondycjonowanej pożywki na studzienkę i wróć do inkubatorów do hodowli komórkowych na 10 dni. W 11 dniu hodowli należy traktować komórki 350-mikromolowym nadtlenkiem wodoru w kompletnej pożywce przez 24 godziny.W przypadku traktowania nietransfekowanych komórek RPE oczyszczonym lub dostępnym w handlu PEDF i/lub GM-CSF, należy wysiać 3000 komórek w 200 mikrolitrach kompletnej pożywki uzupełnionej 500 nanogramami na mililitr rekombinowanego PEDF i/lub 50 nanogramami na mililitr rekombinantu do GM-CSF na studzienkę przez 48-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty kompletną pożywką zawierającą 350 mikromolowy nadtlenek wodoru i 500 nanogramów na mililitr PEDF i/lub 50 nanogramów na mililitr GM-CSF na studzienkę przez 24 godziny. W przypadku leczenia nadtlenkiem wodoru transfekowanych komórek RPE, należy wyhodować 5 000 transfekowanych komórek w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża na dołek przez 24 godziny w inkubatorze hodowli komórkowych, a następnie poddać komórki działaniu 350 mikromolowego nadtlenku wodoru, jak pokazano.Aby zmierzyć poziomy glutationu wytwarzanego w transfekowanych komórkach z nadmierną ekspresją PEDF i / lub GM-CSF, lub komórkach nietransfekowanych wstępnie potraktowanych czynnikiem wzrostu po leczeniu nadtlenkiem wodoru, zastąp supernatant w każdym dołku 100 mikrolitrami świeżo przygotowanej mieszanki odczynników 1X na studzienkę i mieszaj komórki z mieszaniną odczynników przez 14 sekund z prędkością 500 obrotów na minutę na wytrząsarce orbitalnej. Po wstrząśnięciu inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed dodaniem 100 mikrolitrów odczynnika do wykrywania lucyferyny do każdej studzienki. Mieszaj roztwór przez 15 sekund na shakerze, a następnie 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji załaduj płytkę do czytnika płytek i wybierz opcję Zmień układ. W zakładce Parametry podstawowe należy wybrać płytkę 96-dołkową i optykę górną, a opóźnienie pozycjonowania ustawić na 0,1, czas rozpoczęcia pomiaru na zero, czas interwału pomiaru na jeden, a czas normalizacji wyników na zero. Zdefiniuj ślepe próby, wzorce i próbki, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiar.Następnie wyeksportuj dane jako plik arkusza kalkulacyjnego i oblicz stężenie glutationu w każdej próbce poprzez interpolację krzywej standardowej. Aby zmierzyć żywotność komórek, zastąp supernatant w każdym dołku 100 mikrolitrami kompletnej pożywki uzupełnionej 1% FBS na studzienkę i umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych do czasu analizy. Po pobraniu nietraktowanych komórek ARPE-19 z hodowli, ponownie zawiesić komórki w ilości 100 000 komórek na mililitr w pożywce DMEM Hams F-12 uzupełnionej stężeniem 1% FBS.Następnie należy przygotować siedem seryjnych rozcieńczeń 1:1 w 200 mikrolitrach pożywki uzupełnionej 1% FBS i przenieść 100 mikrolitrów każdego wzorca do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki w dwóch egzemplarzach. Dodaj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki odczynników do wszystkich dołków i mieszaj komórki z mieszanką przez 15 sekund na wytrząsarce przed inkubacją płytki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zmierzyć luminescencję, jak pokazano.Po uzyskaniu pomiaru dodaj 50 mikrolitrów odczynnika do lizy do każdej studzienki na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zmierz luminescencję i użyj wzoru do obliczenia procentu żywych komórek. 24-godzinne leczenie 50- i 100-mikromolowym nadtlenkiem wodoru nie wpływa na wewnątrzkomórkową produkcję glutationu, podczas gdy znaczny spadek glutationu obserwuje się, gdy komórki są traktowane 350-500 lub 700-mikromolowym nadtlenkiem wodoru koncentracja. Morfologicznie komórki poddane działaniu nadtlenku wodoru wydają się mniej rozproszone i bardziej zaokrąglone wraz ze wzrostem stężenia związku.Efekt ten był mniej widoczny w przypadku komórek transfekowanych PEDF i GM-CSF traktowanych nadtlenkiem wodoru. Ważne jest, aby pamiętać, że liczba komórek wpływa na stres oksydacyjny za pośrednictwem nadtlenku wodoru, ponieważ poziom glutationu był statystycznie istotnie obniżony po leczeniu nadtlenkiem wodoru w studzienkach obsianych tylko 5 000 komórek. Komórki traktowane lub transfekowane w celu ekspresji PEDF i/lub GM-CSF wytwarzają znacznie więcej glutationu w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi w warunkach oksydacyjnych.Ponadto poziom ekspresji genu UCP2 w komórkach transfekowanych PEDF i GM-CSF jest zwiększony po nadtlenku wodoru, chociaż wzrost ten nie jest statystycznie istotny. Analiza Western blot fosforylowanego AKT z lizatu komórek transfekowanych GM-CSF wystawionych na działanie nadtlenku wodoru wykazuje tylko niewielki spadek fosforylacji w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi, co wskazuje, że GM-CSF może chronić komórki przed uszkodzeniem przez stres oksydacyjny. Ważne jest, aby wysiewać komórki o odpowiedniej gęstości, używać świeżego roztworu nadtlenku wodoru i dodawać świeże białka do pożywki.Po potwierdzeniu przeciwutleniającego działania czynników wzrostu za pomocą modelu nadtlenku wodoru, czynniki te można przetestować w modelu choroby oczu związanej ze stresem oksydacyjnym. Obecny model stresu oksydacyjnego nadtlenku wodoru pozwala na ocenę efektów przeciwutleniających, jakie mogą mieć różne czynniki, a tym samym wspiera rozwój nowych terapii genowych.

induction-analysis-oxidative-stress-sleeping-beauty-transposon

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Metodą przesiewową służącą do wykrywania utleniającego środowiska wewnątrzkomórkowego jest pomiar utleniania CM-H2DCFDA. Po utlenieniu wewnątrz komórki CM-H2DCFDA zmienia się z związku niewykazującego fluorescencji w związek fluorescencyjny. Zmianę fluorescencji mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala określić liczbę komórek znajdujących się w środowisku utleniającym.

Test przesiewowy stresu oksydacyjnego w linii komórkowej astrocytów kotów, G355-5

Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru stresu oksydacyjnego u żywych zarodków danio pręgowanego. Procedura ta umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w całych tkankach zarodka, jak i w populacjach pojedynczych komórek. W ramach tego protokołu zostaną przeprowadzone zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe.

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Niekoherentne światło ksenonowe było przepuszczane przez wąskopasmowe filtry interferencyjne i neutralne gęstości, aby dostarczyć światło o różnej długości fali i intensywności do hodowanych komórek. Protokół ten został wykorzystany do oceny wpływu terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na produkcję form reaktywnych in vitro: nie zaobserwowano żadnych efektów przy użyciu badanych parametrów.

Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Obecny protokół opisuje metodę wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania jakościowego i cytometrii ilościowej. Prace te mogą być potencjalnie rozszerzone na inne sondy fluorescencyjne w celu zbadania wpływu wybranych związków na ROS.

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Wprowadzamy nowatorskie urządzenie do pomiaru wskaźników zużycia tlenu (OCR) w hodowlach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Urządzenie może mierzyć OCR przez wiele tygodni na RPE hodowanym na standardowych płytkach do hodowli komórkowych ze standardowymi pożywkami, podczas gdy płytki znajdują się w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.

Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki

Opisano metodę identyfikacji nieznanych czynników powodujących kancerogenezę przy użyciu bezstronnego podejścia.  Metoda wykorzystuje transpozon Śpiącej Królewny jako losowy mutagen skierowany do określonych tkanek.  Mapowanie genomowe insercji transpozonów, które napędzają powstawanie nowotworów, identyfikuje nowe onkogeny i geny supresorowe...

Identyfikacja insercji transpozonów Śpiącej Królewny w guzach litych za pomocą PCR za pośrednictwem łącznikera

Poznaj metodę indukcji stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocą H2O2. Protokół umożliwia ocenę działania antyoksydacyjnego białek w leczeniu zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem.

Indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem

Przeglądaj więcej filmów