Name: Nowoczesne urządzenie rozgrzewające/ograniczające do skutecznych iniekcji żył ogonowych w mysim modelu sepsy grzybiczej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj nowoczesną metodę iniekcji żył ogonowych u myszy z wykorzystaniem urządzenia rozgrzewającego i ograniczającego. Technika zapewnia precyzyjne podawanie substancji przy minimalnym stresie zwierząt w modelu sepsy grzybiczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację LSUHSC (PLF), a częściowo przez U54 GM104940 z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health, który finansuje Louisiana Clinical and Translational Science Center.

Wszystkie protokoły dla zwierząt, w tym wstrzykiwanie żył ogonowych i stosowanie urządzenia rozgrzewającego/krępującego, zostały sprawdzone i zatwierdzone przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (IACUC).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Zwierzęta należy zaaklimatyzować w pomieszczeniach inwentarskich przez co najmniej 1 tydzień i zapewnić im jedzenie i wodę ad libitum. 
	UWAGA: Dla większości nowych użytkowników tej techniki wstrzykiwania preferowane mogą być odmiany zwierząt o białym lub jasnym futrze, ponieważ żyły ogonowe są łatwo widoczne przez skórę. Ciemne szczepy myszy (np. C57BL/6) lub szczurów (np. Brown Norway) mają głęboko pigmentowane ogony, co skutkuje słabym kontrastem kolorystycznym z żyłą. Zdecydowanie zaleca się, aby nowi użytkownicy przeszli odpowiednie szkolenie do momentu osiągnięcia biegłości.</li>
	<li>Środki do iniekcji żył ogonowych
	<ol>
		<li>Przygotować wszystkie badane czynniki i roztwory w sposób aseptyczny. Podczas podawania organizmów lub materiałów komórkowych należy zachować środki ostrożności na wszystkich etapach przetwarzania, aby utrzymać warunki wolne od pirogenów.</li>
		<li>Do wstrzykiwania żyły ogonowej należy używać wyłącznie soli fizjologicznej (0,9% w/v chlorku sodu) lub zrównoważonych roztworów soli, takich jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), jako nośników do wstrzykiwań do żyły ogonowej. 
		UWAGA: Nigdy nie używaj wody, oleju ani lepkich roztworów ze względu na potencjalne ryzyko uszkodzenia naczyń krwionośnych. Szeroki zakres pH (4,5–8,0) jest tolerowany ze względu na buforujące działanie krwi i szybkie tempo przepływu krwi u gryzoni. Jednak silnie kwaśne lub zasadowe roztwory mogą powodować niepotrzebne uszkodzenie tkanek w miejscu wstrzyknięcia i należy tego unikać.</li>
		<li>Należy ograniczyć objętość i częstotliwość wstrzykiwania do minimum. Stosować zalecane objętości dla myszy i szczurów (odpowiednio ≤200 μl i ≤500 μl) w temperaturze ciała przed wstrzyknięciem, aby zminimalizować stres u zwierzęcia3.</li>
		<li>Upewnić się, że każde przygotowanie strzykawki i igły jest wolne od pęcherzyków powietrza w roztworze; jeśli pęcherzyki są obecne, należy je całkowicie oczyścić, aby zapobiec ryzyku zatoru. 
		UWAGA: Zazwyczaj strzykawki o pojemności 1 ml z igłami 27 G, 1/2 cala są odpowiednie do większości wstrzyknięć do żył ogonowych.</li>
		<li>Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) wymaganych przez lokalny IACUC z minimalną ilością jednorazowych lub dedykowanych fartuchów oraz rękawic lateksowych lub nitrylowych. Stosowanie okularów ochronnych jest wysoce zalecane podczas wykonywania iniekcji do żyły ogonowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Urządzenie rozgrzewające i przytrzymujące
	<ol>
		<li>Przed użyciem dokładnie sprawdź wszystkie komponenty, aby upewnić się, że urządzenie jest wolne od jakichkolwiek wad (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Inicjalizacja urządzenia grzewczego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)
		<ol>
			<li>Umieść urządzenie grzewcze na czystym, płaskim blacie i włącz urządzenie. Upewnij się, że wskaźnik zasilania termostatu lamp świeci na zielono. Umieść materiały ściółkowe w komorze grzewczej, aby obszar był suchy i zatrzymywał ciepło.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Konfiguracja urządzenia przytrzymującego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B)
		<ol>
			<li>Umieść jednostkę przytrzymującą obok jednostki grzewczej i określ odpowiednie rozmiary stożków dla zwierzęcia. W razie potrzeby ręcznie wyreguluj szerokość podstawy giętkiego aluminiowego stożka, aby zapewnić zwierzęciu odpowiednie unieruchomienie. Alternatywnie zastąp stożek modelami dopasowanymi na zamówienie, aby pomieścić myszy lub szczury o różnych rozmiarach ciała.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Iniekcja żyły ogonowej
<ol>
	<li>Regulacja aparatury
	<ol>
		<li>Ustawianie temperatury wewnętrznej
		<ol>
			<li>Za pomocą pokrętła sterującego ustaw termostat na żądaną temperaturę. Upewnij się, że wskaźnik grzejnika świeci na czerwono i że żarówka się świeci. Uważnie monitoruj wyświetlacz temperatury wewnętrznej, gdy żarówka jest zapalona (ogrzewanie). Termostat automatycznie dezaktywuje żarówkę po osiągnięciu temperatury docelowej, około 10–15 min. 
			UWAGA: Ustawienie temperatury wyższej niż temperatura otoczenia aktywuje grzałkę. Ogólnie rzecz biorąc, zalecana temperatura w pomieszczeniu w standardowych warunkach wiwarium waha się od 20 do 26 °C, podczas gdy neutralna (tj. komfortowa) temperatura dla myszy laboratoryjnych wynosi od 30 do 32 °C42. Dlatego zaleca się, aby temperatura wewnętrzna komory grzewczej była nieco wyższa niż termoneutralność, w przybliżeniu 32–36 °C. Nigdy nie ustawiaj termostatu powyżej temperatury ciała.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustawianie platformy przytrzymującej
		<ol>
			<li>Za pomocą pokrętła regulacji wysokości dostosuj wysokość stożka do optymalnego poziomu dla użytkownika.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka cieplna (<klasa mocna="xfig">Rysunek 3A)
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu temperatury docelowej (32–36 °C) delikatnie przenieść zwierzęta z klatki do komory grzewczej. 
		UWAGA: Obróbka cieplna przez 5–10 minut jest wystarczająca, aby wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych i poprawić widoczność żył ogonowych. Jednak zwierzęta mogą być bezpiecznie trzymane w komorze termoregulowanej przez cały czas trwania zabiegu (zwykle 20-30 minut bez oznak hipertermii). W komorze grzewczej może bezpiecznie pomieścić 4–6 myszy lub jednego szczura.</li>
		<li>Monitoruj zwierzę pod kątem wszelkich oznak ostrego stresu cieplnego (np. szybkiego oddychania, letargu, ucieczki podczas skakania). 
		UWAGA: Zwierzęta wykazujące objawy hipertermii powinny zostać ponownie umieszczone w klatce i monitorowane do momentu wznowienia normalnej aktywności przed ponownym użyciem. Jeśli jest to spowodowane przekroczeniem optymalnego zakresu temperatury wewnętrznej, upewnij się, że urządzenie grzewcze jest wyłączone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etapy wtrysku
	<ol>
		<li>Podnieś zwierzę za podstawę ogona i wyjmij je z komory grzewczej. Wprowadzić zwierzę do otworu w kształcie stożka jednostki przytrzymującej. 
		UWAGA: Nigdy nie podnoś myszy z ogona; Może to spowodować poważne obrażenia. W przypadku myszy otyłych lub ciężarnych należy stosować alternatywne metody postępowania z nimi28.</li>
		<li>Gdy zwierzę chwyta się przednimi kończynami dalszej krawędzi stożka, delikatnie pociągnij ogon do tyłu i przełóż ogon przez otwartą szczelinę. Zabezpiecz tylny koniec zwierzęcia u podstawy stożka tak, aby jedna tylna noga wystająca ze stożka była pokazana w pozycji godziny 12. Każda tylna noga może być wysunięta, ponieważ istnieją dwie boczne żyły, po jednej z każdej strony (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B).</li>
		<li>Chwyć ogon od połowy do dwóch trzecich długości ręką niedominującą między kciukiem a palcem wskazującym, lekko napinając żyłę boczną, aby utrzymać pozycję ogona i rozszerzenie naczyń krwionośnych. 
		UWAGA: Zwiększona widoczność rozszerzonych żył dzięki obróbce cieplnej umożliwia użytkownikowi szybkie określenie miejsca wstrzyknięcia w celu uzyskania najlepszych wyników (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
		<li>Przetrzeć skórę w miejscu wstrzyknięcia gąbką z gazy lub podkładką zwilżoną 70% alkoholem. Czyść tak delikatnie i szybko, jak to możliwe, aby uniknąć podrażnień ogona. 
		UWAGA: Procedura ta może zostać pominięta według uznania instytucjonalnego IACUC.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę ręką dominującą i ustawić igłę równolegle do ogonka. Wbij igłę w kierunku przepływu krwi, skoś pod kątem 10–15° (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 5A–B) i się dalej w głąb światła żyły, penetrując 2–4 mm (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 5C–D). Powoli wstrzykiwać roztwór. 
		UWAGA: Jeśli wstrzyknięcie się powiedzie, nie powinien być wyczuwalny żaden opór na tłoku, a płyn może być widoczny przepływający przez żyłę. W przypadku oporu lub białych pęcherzy powyżej miejsca wstrzyknięcia, należy usunąć igłę i podjąć próbę drugiego wstrzyknięcia w miejsce powyżej pierwotnego umieszczenia igły. Nie należy próbować wstrzykiwać leku poniżej początkowego miejsca wstrzyknięcia, ponieważ płyn będzie uwalniany przez miejsce początkowe. Jeśli wstrzyknięcie jednej żyły bocznej nie powiedzie się, należy przestawić zwierzę na przeciwną stronę i podjąć więcej prób na żyle przeciwległej. Maksymalna liczba prób zależy od miejsca, w którym rozpoczyna się próbę wstrzyknięcia wzdłuż żyły i obrzęku, który może wystąpić w przypadku nieudanych prób. Zapoznaj się z instytucjonalnymi przepisami IACUC w przypadku błędnych wstrzyknięć i związanych z nimi urazów.</li>
		<li>Wyjąć igłę i mocno docisnąć kciukiem, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętego roztworu i (lub) krwi. Kontynuuj delikatne uciskanie czystą gazą/chusteczką lub chusteczką, aż krwawienie ustanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
		<li>Umieść zwierzę z powrotem w klatce i monitoruj przez co najmniej 5 minut. Upewnij się, że zwierzę wznowiło normalną aktywność bez dalszego krwawienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mysi model grzybiczego zakażenia krwi i sepsy
<ol>
	<li>Szczepy myszy
	<ol>
		<li>Aklimatyzuj samice szwajcarskich myszy niehodowlanych Webster w wieku 6 tygodni zgodnie z instytucjonalnie zalecanymi wytycznymi. Alternatywnie, użyj szczepów wsobnych/genetycznie zmodyfikowanych (np. tło C57BL/6) dla tego protokołu ze zmodyfikowanymi inokulantami (patrz UWAGA). 
		UWAGA (zobacz Dyskusję w celu uzyskania szczegółów): Żyły ogonowe myszy z ciemnym futrem są często mniej widoczne niż tych z jaśniejszym futrem ze względu na głęboko pigmentowany ogon (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Istnieje różna podatność na sepsę/śmiertelność grzybicza wśród różnych szczepów myszy. Wykorzystanie szczepów myszy innych niż Swiss Webster może wymagać dodatkowej optymalizacji protokołu poprzez uwzględnienie odpowiednich czynników (np. tła genetycznego, wieku, płci, wielkości ciała), które mogą wpływać na status immunologiczny gospodarza. Na przykład śmiertelne wyzwanie u myszy C57BL/6 zazwyczaj wymaga wyższej dawki szczepionki (do 10 razy), aby osiągnąć poziom śmiertelności obserwowany u szwajcarskich myszy Webster.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mikroorganizmy
	<ol>
		<li>W przypadku śmiertelnego prowokacji (sepsa) zamrożone zapasy Candida albicans szczep DAY185 (lub szczepy z wyboru) należy umieścić na agarze z dekstrozą Sabouraud i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Przenieść pojedynczą kolonię do 10 ml bulionu z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą i hodować do stacjonarnej fazy wzrostu przez 18 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory inokulum
	<ol>
		<li>W dniu śmiertelnego wyzwania zbierz kulturę bulionową i umyj osad 3 razy przez odwirowanie (800 × g) w sterylnym PBS.</li>
		<li>Zidentyfikuj żywe komórki drożdży przez wykluczenie niebieskiego barwnika trypana i policz za pomocą hemocytometru. Dostosuj stężenie komórek do 1 x 106 komórek/ml w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Każde zwierzę otrzyma 100 μL roztworu inokulum. Przygotować nadmiar objętości inokulum (>500 μl), aby umożliwić potencjalną utratę podczas procedury wstrzykiwania. Końcowe inokulum to 1 x 105 komórek na mysz. Objętość inokulum można zwiększyć do 200 μl, odpowiednio dostosowując stężenie komórek. 
		UWAGA: Roztwór inokulum grzybów musi być przechowywany w temperaturze pokojowej przed wstrzyknięciem. Podgrzanie roztworu inokulum do temperatury ciała może wywołać zmianę morfologiczną z komórek drożdży na strzępki. Z drugiej strony, podawanie w bolusie dożylnym roztworów zimna może szybko obniżyć temperaturę ciała zwierzęcia i należy tego unikać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja dożylna
	<ol>
		<li>Ogrzać zwierzęta i wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w punkcie 2.</li>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl roztworu inokulum do żyły ogonowej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G, 1/2 cala.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitorowanie po inokulacji
	<ol>
		<li>Monitoruj zwierzęta pod kątem następujących oznak zachorowalności wywołanej sepsą: i) aspekt sierści (np. gładka, potargana), ii) aktywność (np. swobodne poruszanie się, brak reakcji), iii) postawa (np. zgarbiony, sztywny), iv) zachowanie (np. powolne, brak przemieszczenia), v) ruchy klatki piersiowej (np. normalny oddech, duszność), vi) powieki (np. otwarte, zamknięte)43.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena sepsy
	<ol>
		<li>Oceń zaobserwowaną chorobowość zgodnie ze zmodyfikowanym wynikiem oceny klinicznej sepsy u myszy (M-CASS) w czteropunktowej skali ocen od 0 do 3 w każdej kategorii: 0, normalna; 1, łagodna; 2, umiarkowana; 3, ciężka43.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół fakultatywny: Szczepienie przeciwko posocznicy grzybiczej
	<ol>
		<li>Czternaście dni przed śmiertelnym wyzwaniem zaszczepić myszy szczepem Candida dubliniensis Wü284 lub atenuowanymi szczepami C. albicans, takimi jak mutant Δefg1 / Δcph1 (1x105 komórek na mysz), jak opisano w sekcjach 3.2–3.4 zamiast C. albicans DAY185.</li>
		<li>Przeprowadzić śmiertelną prowokację u zaszczepionych myszy, jak opisano w punktach 3.2–3.4, i monitorować objawy chorobowości wywołanej sepsą opisane w punktach 3.5–3.6.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Konsekwentne i dokładne dozowanie jest kluczowym wymogiem dla wiarygodności eksperymentu w modelach zwierzęcych. Jest to szczególnie ważne w przypadkach podawania dożylnego, gdzie ogólnoustrojowa biodostępność wstrzykiwanych leków jest znacznie wyższa/szybsza niż w przypadku innych dróg podania3. W związku z tym błędy w iniekcji do żyły ogonowej mogą mieć szkodliwy wpływ na wyniki badania. Historycznie rzecz biorąc, wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.), a nie dożylnie, było najczęstszą metodą dostępu ogólnoustrojowego u gryzoni ze względu na prostotę techniczną i wygodę. Jednak drogi podania stają się bardziej kluczowe przy przekładaniu odczytów przedklinicznych ze zwierząt na warunki kliniczne. W związku z tym istnieje potrzeba ciągłego doskonalenia protokołów leczenia gryzoni, które mogłyby ułatwić skuteczne wstrzyknięcie żyły ogonowej.
Kluczowym postępem w obecnym protokole jest innowacyjne termoregulowane urządzenie rozgrzewające, które umożliwia skuteczną indukcję rozszerzenia naczyń krwionośnych u gryzoni, co znacznie poprawia widoczność żył ogonowych i wyrównanie igieł. Metody ogrzewania, które są słabo termoregulowane (np. lampy), miejscowe leki rozszerzające naczynia krwionośne lub drażniące skórę (np. ksyleny) są nie tylko zawodne, ale także niebezpieczne dla zwierzęcia i należy ich unikać44. W przeciwieństwie do innych konwencjonalnych metod, takich jak zanurzanie ogona w ciepłej wodzie, zdolność autoregulacji tego urządzenia może bezpiecznie kondycjonować wiele zwierząt jednocześnie. Ponadto protokół ten jest dodatkowo wzmocniony dzięki zastosowaniu optymalnie zaprojektowanego urządzenia krępującego i umożliwiającego szybkie i bezpieczne unieruchomienie zwierzęcia w pozycji, która najlepiej pokazuje boczną żyłę ogonową.
Przezroczyste formaty rurek widoczne w wielu obecnych krępach, choć praktycznie dobrze zaprojektowane, wymagają więcej czasu na obchodzenie się z każdym zwierzęciem, co wydłuża proces krępowania45. Może to być bardziej problematyczne w przypadku szczepów gryzoni o cechach agresywnych, które oferują ograniczoną współpracę46,47. W przeciwieństwie do tego, częściowo zamknięta stożkowa konstrukcja urządzenia przytrzymującego umożliwia szybkie ułożenie zwierzęcia i pomaga zminimalizować czas trwania unieruchomienia. Uproszczony protokół wykorzystujący innowacyjny, wysoce zoptymalizowany system ocieplania/krępowania przyspiesza procedurę wstrzykiwania, umożliwiając szybkie i skuteczne dawkowanie dużym grupom zwierząt. W naszym laboratorium zazwyczaj wykonujemy całą procedurę wstrzykiwania 30 myszy, od obróbki cieplnej do monitorowania po wstrzyknięciu, w ciągu 1 godziny przy użyciu tego protokołu.
Pomimo zaawansowanych funkcji, urządzenie to ma pewne oczywiste wady: pierwszą z nich jest koszt urządzenia i rutynowa wymiana żarówki w komorze grzewczej. Jednak oprócz skuteczności i szybkości wstrzykiwań, urządzenie jest trwałe do wielokrotnego użytku i kompatybilne z większością popularnych środków dezynfekujących, co pozwala na dokładne czyszczenie urządzenia między użyciami. Razem kompensuje to początkową inwestycję. Ponadto, w sytuacjach o ograniczonej przestrzeni roboczej, wadą tego protokołu może być wymóg wydzielonej powierzchni stołu wystarczająco dużej, aby umieścić dwie jednostki obok siebie podczas wykonywania iniekcji. Ponieważ jednak urządzenie może być szeroko stosowane w kilku protokołach dla gryzoni, w tym wstrzyknięciach dożylnych, możliwe jest, że urządzenie może służyć jako podstawowe narzędzie, podobne do innych wspólnych urządzeń wiwariowych, takich jak waporyzatory izofluranowe. Niezależnie od tego, obie jednostki są łatwe do przenoszenia i można je łączyć i przechowywać, gdy nie są używane.
Opisany w tym protokole model dożylnie śmiertelnej prowokacji mysiej posocznicy grzybiczej ściśle naśladuje infekcje krwi C. albicans u ludzi i był szeroko stosowany do badania zjadliwości grzybów, testowania skuteczności terapii przeciwgrzybiczych i charakteryzowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza na infekcję 37,39,48. Aby osiągnąć powtarzalną infekcję, inokulacja dożylna poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej jest najważniejszym krokiem protokołu zapewniającym dokładne dostarczanie organizmów do krwiobiegu. W rzeczywistości zwierzęta reagują bardzo różnie na różne poziomy wyzwań związanych z Candida i.v.; Podanie zbyt małej ilości inokulum spowoduje niepożądane spontaniczne wyzdrowienia, podczas gdy zwierzęta otrzymujące zbyt wysokie dawki przedwcześnie umrą. Specyficzne okno wielkości inokulum dla danego organizmu w celu wywołania stałego poziomu sepsy/śmiertelności w dużej mierze zależy zarówno od szczepów grzybów, jak i szczepów myszy.
Obecny protokół wykorzystujący szwajcarskie myszy Webster w inokulum 1 x 105 C. albicans typu dzikiego w sposób powtarzalny indukował początek zachorowalności na sepsę w ciągu 1 dnia, a następnie postępującą śmiertelność prowadzącą do 100% śmiertelności w ciągu 5-7 dni. W przeciwieństwie do tego, szczepionki wyższe niż 1 x 105 zazwyczaj prowadzą do przyspieszonych zgonów (tj. 1-2 dni przy 1 x 106, 3-4 dni przy 5 x 105), a te niższe niż 1 x 105 są subletalne. Zgodnie z licznymi doniesieniami w literaturze, stosowanie gatunków Candida innych niż albicans zamiast C. albicans skutkuje znacznie zmniejszoną śmiertelnością40,49. Ponadto wybór szczepów myszy, a nawet pochodzenie kolonii, może mieć znaczący wpływ na wyniki infekcji ze względu na różną podatność między szczepami myszy, jak donoszą inni 39,40,41,50,51,52,53,54,55. W związku z tym oba te czynniki powinny być brane pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów.
Po śmiertelnym prowokacji dożylnie komórki grzybów szybko rozprzestrzeniają się w krwiobiegu i zaczynają atakować wiele narządów, wśród których najbardziej dotknięte są nerki41. Inne dotknięte narządy to mózg, śledziona i szpik kostny48,56. Niezależnie od tego, ostra sepsa jest ostateczną przyczyną zgonu we wczesnych punktach czasowych37. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, nasilenie sepsy można ocenić ilościowo za pomocą mysiego wyniku oceny klinicznej sepsy (M-CASS) na podstawie wykazanych objawów sepsy u zwierząt prowokowanych43,57. Wśród kilku zastępczych markerów śmiertelnej sepsy, hipotermia została zasugerowana jako krytyczny predyktor rychłej śmierci zarówno w klinicznej, jak i eksperymentalnej sepsie 43,58,59.
Chociaż nie przeprowadzono żadnych formalnych badań w celu bezpośredniego porównania myszy wsobnych i niekrewniaczych w tym modelu, dane uzyskane z obecnego protokołu przy użyciu niekrewniaczych szwajcarskich myszy Webster są wyjątkowo powtarzalne pod względem różnych parametrów sepsy, pomimo przypuszczalnej heterogeniczności genetycznej. Ogólnie rzecz biorąc, wzorzec śmiertelności, który przypada w ciągu 3-5 dni, jest mocnym modelem ostrej sepsy, o czym świadczy szybki wzrost zachorowalności na sepsę i poziom markerów stanu zapalnego w ciągu kilku godzin po poletalnym prowokacji50,51. W przypadku dłuższych okresów przeżycia (7–10 dni) śmiertelność jest prawdopodobnie wynikiem obciążenia mikrobiologicznego prowadzącego do śmiertelnego uszkodzenia tkanek w narządach docelowych i ośrodkowym układzie nerwowym. Wybór sepsy lub obciążenia mikrobiologicznego może być stosowany w razie potrzeby do oceny funkcji immunologicznych lub odpowiedzi na schematy przeciwzapalne lub terapie/szczepionki przeciwgrzybicze, w zależności od zastosowanego inokulum.
Oprócz modelu śmiertelnego prowokacji dożylnej, wewnątrzbrzuszne zakażenie C. albicans u myszy za pomocą prowokacji i.p. może również prowadzić do rozsianej kandydozy i późniejszej sepsy, chociaż jednoczesne zaszczepienie patogenem bakteryjnym, Staphylococcus aureus, synergistycznie zwiększa śmiertelność w porównaniu z monoinfekcją C. albicans 51,60,61. W modelu i.p. lethal challenge znacznie wyższa inokulacja mikrobiologiczna (1,75 x 107 C. albicans/8 x 107 S. aureus na mysz) jest wymagana do wywołania wielobakteryjnego zapalenia otrzewnej i rozprzestrzenienia się organizmów z jamy brzusznej do krwiobiegu. Podobnie, zakażenie przewodu pokarmowego C. albicans u myszy leczonych środkami immunosupresyjnymi i / lub uszkadzającymi błony śluzowe prowadzi do translokacji komórek grzyba do krwiobiegu i powoduje posocznicę grzybiczą62,63. Pomimo charakterystycznych dróg inokulacji, mechanizm wynikającej z sepsy grzybiczej jest w dużej mierze analogiczny między trzema modelami choroby, obejmując niekontrolowaną ogólnoustrojową odpowiedź prozapalną na Candida, która prowadzi do niewydolności narządowej 37,51,61. Podobnie u ludzi to właśnie ten proces odpowiedzi gospodarza, a nie tylko kandydemia, powoduje wysoką zachorowalność/śmiertelność związaną z hematogennie rozsianą kandydozą nabytą w placówkach opieki zdrowotnej64,65.
Korzystając z obecnego modelu sepsy grzybiczej, wykazujemy tutaj, że ochronę przed śmiertelnym zakażeniem C. albicans można osiągnąć poprzez dożylne szczepienie wstępne/szczepienie C. dubliniensis (avirulent) lub atenuowane mutanty C. albicans, przy jednoczesnym znacznym zmniejszeniu zachorowalności na sepsę. W ochronie pośredniczą wrodzone komórki supresorowe Gr-1 + pochodzące z szpiku, które wydają się być indukowane w szpiku kostnym jako forma wytrenowanej odporności wrodzonej66,67. Trwają prace nad poszerzeniem wiedzy na temat tej nowej formy wrodzonej ochrony immunologicznej przed zakażeniami krwi C. albicans.
Podsumowując, innowacyjne urządzenie do ocieplania/krępowania gryzoni odegrało zasadniczą rolę w zwiększaniu naszej zdolności do wykonywania iniekcji dożylnych w ramach zakrojonych na szeroką skalę wielogrupowych badań na zwierzętach w wydajny i skuteczny sposób. W związku z tym ukuliśmy termin Mouse a Minute dla tego urządzenia. Specyfikacje urządzenia są dostępne u autora korespondencyjnego na żądanie w przypadku zamówienia podobnego urządzenia. Zademonstrowane tu techniki mogą posłużyć jako użyteczne narzędzie w modelach gryzoni wykorzystujących iniekcje do żył ogonowych w szerokim zakresie obszarów badawczych.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych z udziałem gryzoni było podstawą badań biomedycznych. Liczne szczepy wsobne i niekrewniacze, a także linie genetycznie modyfikowane, są dostępne i rutynowo stosowane w laboratoriach na całym świecie. Iniekcja do żyły ogonowej jest jedną z podstawowych metod w modelach gryzoni wymagających dożylnego (dożylnego) podawania środków eksperymentalnych. Ogólnie rzecz biorąc, iniekcje dożylne mają duże zalety w porównaniu z innymi drogami podawania, takie jak wysokie wskaźniki wchłaniania poprzez ominięcie lokalnych tkanek i przewodu pokarmowego oraz wysoka tolerancja na roztwory o szerokim zakresie stężeń lub niefizjologiczne pH1,2,3,4. Wśród innych żywotnych dróg dożylnych (np. żyły odpiszczelowe, zatoki żylne zaoczodołowe), żyły ogonowe są uważane za najbezpieczniejsze i najłatwiej dostępne naczynie krwionośne u gryzoni2,3,5,6. W związku z tym iniekcja żył ogonowych jest szeroko stosowana w wielu modelach gryzoni, w tym w modelach chorób zakaźnych7,8,9, transplantacja materiałów biologicznych10,11, ocena terapii przedklinicznych12,13 oraz analizy toksykologiczne14,15.
Konsekwencja i dokładność dawkowania są kluczowym wymogiem w udanych iniekcjach do żył ogonowych. Co zaskakujące, ilościowa i jakościowa ocena iniekcji do żył ogonowych w literaturze sugeruje częste błędne iniekcje16,17. Badanie wykazało, że dwanaście z trzydziestu wstrzyknięć wykonanych przez przeszkolonych wstrzykiwaczy pozostawiło ponad 10% wstrzykniętych dawek w tail18. Ponadto bezpieczeństwo i komfort zwierzęcia otrzymującego zastrzyki do żył ogonowych powinno być głównym problemem podczas zabiegu. Niewłaściwe unieruchomienie może prowadzić do urazów i szeregu patologii związanych ze stresem (np. utrata masy ciała, upośledzona odpowiedź immunologiczna), które mogą wprowadzać istotne zmienne w jakości próbki19,20. Błędy te mogą powodować zwiększoną zmienność danych i słabą odtwarzalność, wpływając w ten sposób negatywnie na wyniki badania.
Indukcja rozszerzenia naczyń krwionośnych u zwierzęcia jest często konieczna podczas wykonywania iniekcji do żyły ogonowej ze względu na małą średnicę naczynia, szacowaną na 300 μm u myszy21. Rozszerzenie naczyń krwionośnych poprawia widoczność żył ogonowych i pomaga w osiągnięciu optymalnego ułożenia igły-żyła w świetle żylu. Laboratoria opisały różne metody, takie jak zanurzenie ogona w ciepłej wodzie22, ogrzewanie ogona za pomocą ciepłej zasłony, lampy lub suszarki do włosów23,24, lub umieszczenie zwierzęcia w ciepłym otoczeniu za pomocą poduszki grzewczej, inkubatora lub pudełka połączonego z jednym z tych źródeł ciepła25. Urządzenia mogą być wykonane samodzielnie do określonych celów lub dostępne u dostawców komercyjnych. Jednak wielu z nich nie ma zdolności termoregulacyjnych, a jeśli w ogóle, temperatura urządzenia jest źle utrzymywana i często podlega wahaniom temperatury pokojowej. Podobnie, użycie urządzenia krępującego jest konieczne w przypadku iniekcji do żyły ogonowej, ponieważ stosowanie znieczulenia nie jest zalecane26,27. Opracowano kilka rodzajów urządzeń krępujących specyficznych dla laboratoriów lub komercyjnych. Zazwyczaj zwierzę umieszcza się w jednorazowej stożkowej tubie o pojemności 50 ml4, szczelinowych ściankach z pleksiglasu, tunelu lub stożku 28, z których wszystkie pozwalają na duże odsłonięcie ogona, jednocześnie ograniczając ruchy zwierzęcia. Jednak większość ograniczników ma ograniczenia rozmiarowe ze względu na sztywność materiałów. Co więcej, nowoczesne urządzenia o wysokim stopniu złożoności, pomimo praktycznych i wyrafinowanych konstrukcji, nie wydają się być wykonalne do wstrzykiwań z udziałem dużych grup zwierząt22.
Mysie modele infekcji krwi i związanej z nią sepsy są doskonałym przykładem sytuacji wymagających użycia tej techniki. Spośród wszystkich mikrobiologicznych etiologii ciężkiej klinicznej sepsy, sepsa grzybicza jest często stanem śmiertelnym, ze śmiertelnością na poziomie >40% pomimo terapii przeciwgrzybiczej29. W rzeczywistości zakażenie Candida albicans zostało zgłoszone jako czwarta najczęstsza przyczyna szpitalnego zakażenia krwi (kandydemia)30,31. W kandydozie wewnątrzbrzusznej mikroorganizmy w przewodzie pokarmowym mogą rozprzestrzeniać się przez krwiobieg i powodować posocznicę wielodrobnoustrojową z jeszcze większą śmiertelnością32,33,34. Ponieważ większość przypadków kandydemii szpitalnej wynika z zanieczyszczonych cewników linii centralnej lub urządzeń medycznych na stałe35,36, inokulacja dożylna C. albicans przez wstrzyknięcie żyły ogonowej może ściśle odzwierciedlać rozwój sepsy u ludzi i była podstawową metodą w mysim modelu hematogennie rozsianej kandydozy37,38. W tym modelu śmiertelność wyrażona w dniach może zostać wydłużona lub skrócona, dostosowując inokulum C. albicans i.v. class39,40,41.
Ostatnio nasze laboratorium opracowało innowacyjny protokół optymalnie usprawnionego wstrzykiwania żyły ogonowej za pomocą innowacyjnego urządzenia wyposażonego w termoregulowaną jednostkę grzewczą, połączoną z regulowaną jednostką ograniczającą, w jednym wygodnym systemie. Protokół ten pozwala naukowcom na wykonywanie iniekcji do żył ogonowych w dokładny i terminowy sposób, podczas gdy zwierzęta mogą być bezpiecznie kondycjonowane i przytrzymywane do zabiegu przy minimalnym stresie. Zademonstrowane tu techniki, z wykorzystaniem zaawansowanego urządzenia ocieplającego i krępującego, mogą posłużyć jako użyteczne narzędzie w różnych obszarach badawczych wykorzystujących modele gryzoni.

<table><tbody><tr><td>Candida albicans szczep DAY185</td><td>Carnegie Melon University</td><td>N/A</td><td>dostarczony przez laboratorium Aarona Mitchella</td></tr><tr><td>Candida albicans szczep efg1&Delta;/&Delta; cph1&Delta;/&Delta; </td><td>Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee</td><td>N/A</td><td>dostarczone przez laboratorium Glen Palmer</td></tr><tr><td>Candida dubliniensis szczep W&uuml; 284</td><td>Trinity College, Dublin, Irlandia</td><td>Nie dotyczy dostarczone</td><td>przez laboratorium Gary'ego Morana</td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Charles River Laboratories</td><td>551NCICr:SW</td><td>Samica Swiss Webster; 6-8 tygodniowe</td></tr><tr><td>myszy</td><td>Charles River Laboratories</td><td>556NCIC57BL/6</td><td>Samica C57BL/6; 6-8 tygodni</td></tr><tr><td>Igły, 27G, &frac12;-in</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td>mogą być zastąpione od innych dostawców</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>GE</td><td>SH30028.02</td><td>można zastąpić u innych dostawców Urządzenie</td></tr><tr><td>do ogrzewania i krępowania gryzoni (Mouse a Minute)</td><td>LSU Health</td><td>na zamówienie niestandardowe</td><td>Mysz na minutę jest dostępna do niestandardowego zamówienia w LSU Health</td></tr><tr><td>Sabouraud agar dekstrozowy (SDA)</td><td>Becton Dickinson</td><td>211584</td><td>można zastąpić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Strzykawki, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>można zastąpić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowy bulion dekstronowy peptonowy (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2469</td><td>można zastąpić u innych dostawców</td></tr></tbody></table>

nowoczesne urządzenie rozgrzewające/ograniczające do skutecznych iniekcji żył ogonowych w mysim modelu sepsy grzybiczej

A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

W modelach gryzoni, iniekcje do żył ogonowych są ważnymi metodami dożylnego podawania środków eksperymentalnych. Zastrzyki do żył ogonowych zazwyczaj obejmują ogrzewanie zwierzęcia w celu rozszerzenia naczyń krwionośnych, co pomaga zarówno w identyfikacji naczyń krwionośnych, jak i umieszczeniu igły w świetle naczynia, jednocześnie bezpiecznie krępując zwierzę. Chociaż iniekcje do żył ogonowych są powszechnymi procedurami w wielu protokołach i nie są uważane za wysoce techniczne, jeśli są wykonywane prawidłowo, dokładne i konsekwentne zastrzyki mają kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników i zminimalizowania zmienności. Konwencjonalne metody wywoływania rozszerzenia naczyń krwionośnych przed wstrzyknięciem żył ogonowych zazwyczaj zależą od użycia źródła ciepła, takiego jak lampa grzewcza, elektryczne/ładowalne poduszki grzewcze lub wstępnie podgrzana woda o temperaturze 37 °C. Pomimo tego, że narzędzia te są łatwo dostępne w standardowych warunkach laboratoryjnych, wyraźnie cierpią z powodu słabej/ograniczonej zdolności termoregulacyjnej. Podobnie, chociaż różne formy urządzeń krępujących są dostępne na rynku, muszą być one używane ostrożnie, aby uniknąć urazów u zwierząt. Te ograniczenia obecnych metod tworzą niepotrzebne zmienne w eksperymentach lub skutkują różnymi wynikami między eksperymentami i/lub laboratoriami.
W tym artykule pokazujemy ulepszony protokół wykorzystujący innowacyjne urządzenie, które łączy niezależne, regulowane termicznie, ogrzewające urządzenie z regulowaną jednostką ograniczającą w jeden system do efektywnego, usprawnionego wstrzykiwania żył ogonowych. Przykładem, którego używamy, jest dożylny model grzybiczego zakażenia krwi, które prowadzi do sepsy. Aparat grzewczy składa się z odbijającej ciepło akrylowej skrzynki zainstalowanej z regulowanym automatycznym termostatem w celu utrzymania temperatury wewnętrznej na ustalonym progu. Podobnie, szerokość i wysokość stożka przytrzymującego stożek można regulować, aby bezpiecznie dostosować się do różnych rozmiarów gryzoni. Dzięki zaawansowanym i wszechstronnym funkcjom urządzenia, przedstawiona tutaj technika może stać się użytecznym narzędziem w wielu obszarach badawczych obejmujących modele gryzoni, które wykorzystują iniekcje do żył ogonowych.

Temperatura wewnątrz komory grzewczej jest stale monitorowana przez wewnętrzny czujnik i automatycznie regulowana przez termostat. Najpierw pokrętło sterujące termostatu ustawiono na 78, 85, 90 lub 95 °F (26, 29, 32 lub 35 °C), aby wybrać pożądane temperatury. Po aktywacji grzejnika (Rysunek 7, żółte kropki), emisja ciepła przez żarówkę szybko podniosła temperaturę wewnętrzną w ciągu pierwszych 5–15 min, w zależności od ustawionej temperatury. Grzejnik wyłączał żarówkę, gdy wykryta temperatura wewnętrzna przekroczyła temperaturę zadaną (szare kropki). Początkowe temperatury szczytowe powinny wzrosnąć o 5–7 °C powyżej wartości zadanych we wszystkich grupach, aby zrekompensować utratę ciepła podczas przenoszenia zwierząt. Następnie urządzenie automatycznie powtarza cykl grzania, utrzymując w komorze grzewczej zadaną temperaturę.
Przykład danych eksperymentalnych uzyskanych dzięki pomyślnym iniekcjom do żyły ogonowej zgodnie z niniejszym protokołem przedstawiono na Rysunku 8. W modelu mysim kandydozy krwiobiegu prowadzącej do sepsy, wyzwanie i.v. z Candida albicans (1 x 105 komórek na mysz) u myszy Swiss Webster spowodowało szybki rozwój sepsy i rozsianie drobnoustrojów, co doprowadziło do wysokiej śmiertelności w ciągu 3–4 dni (puste kropki) (Rysunek 8A). W przeciwieństwie do tego, zwierzęta mogły zostać chronione przed sepsą dzięki wcześniejszej preimmunizacji/szczepieniu i.v. awirulentnym szczepem drożdży, Candida dubliniensis, co pozwoliło osiągnąć &gt;95% przeżywalności po letalnym wyzwaniu i.v. z wirulentnym C. albicans (pełne kropki). Wyniki te dotyczące progresywnej śmiertelności w porównaniu z ochroną indukowaną szczepionką uzyskano powtarzalnie w czterech niezależnych eksperymentach (Rysunek dodatkowy 1). Podobną ochronę można było osiągnąć, stosując inne awirulentne szczepy drożdży, takie jak atenuowane mutanty C. albicans (Δefg1/Δcph1) (dane niepokazane). Monitorowano również przebieg sepsy i korelowano go ze śmiertelnością; u nieszczepionych zwierząt z letalną infekcją odnotowano znaczący wzrost zachorowalności wywołanej sepsą, natomiast grupa zaszczepiona wykazywała minimalne objawy po letalnym wyzwaniu (Rysunek 8B).
<img alt="Układ spektroskopowy; schemat z wzbudzeniem optycznym, absorpcją przejściową; opisany sprzęt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Opis urządzenia do ogrzewania i unieruchamiania gryzoni. (A) przedstawia widok zewnętrzny urządzenia grzewczego, które składa się z:
<ol>
	<li>Osłona termostatu – podnieść za uchwyt, aby odsłonić termostat</li>
	<li>Obudowa elektryczna – trwale zamknięta w celu zapewnienia ochrony</li>
	<li>Pokrywa komory – podnieść podczas przenoszenia zwierząt do komory lub z niej</li>
	<li>Komora grzewcza – wyjmowana, przed użyciem należy wyścielić dno ściółką</li>
	<li>Urządzenie do unieruchamiania – można przechowywać wraz z urządzeniem grzewczym, gdy nie jest używane</li>
	<li>Włącznik zasilania – wbudowany przełącznik kołyskowy do głównych funkcji włączania/wyłączania</li>
	<li>Kabel zasilający – napięcie/natężenie: 120V/10A</li>
</ol>
(B) przedstawia wnętrze urządzenia grzewczego:
<ol>
	<li>Żarówka wolframowa – moc świetlna 100 W</li>
	<li>Osłona ochronna żarówki – demontowalna w celu wymiany żarówki</li>
	<li>Sonda czujnika temperatury – umieszczona wewnątrz komory</li>
	<li>Wewnętrzny termometr – umieszczony wewnątrz komory do monitorowania temperatury</li>
</ol>
(C) przedstawia komponenty termostatu urządzenia do ogrzewania:
<ol>
	<li>Wewnętrzny termometr temperatury</li>
	<li>Termostat – automatycznie reguluje grzałkę</li>
	<li>Dźwignia ustawiania wartości zadanej – minimum/maksimum: 78 °F/108 °F (25 °C/42 °C)</li>
	<li>Wskaźnik zasilania termostatu – zielone światło oznacza prawidłową pracę</li>
	<li>Wskaźnik grzałki termostatu – świeci na czerwono podczas cyklu grzania</li>
</ol>
(D) przedstawia elementy urządzenia ograniczającego:
<ol>
	<li>Stożek – giętka aluminiowa blacha przeznaczona do unieruchamiania gryzoni</li>
	<li>Kanał na ogon – ukształtowany w sposób umożliwiający płynne ustawienie ogona</li>
	<li>Platforma podnosząca stożek – zapewnia stabilne uniesienie podstawy stożka</li>
	<li>Pokrętło regulacji wysokości – przeznaczone do ręcznej regulacji wysokości</li>
	<li>Podnośnik nożycowy – zakres wysokości od 45–140 mm (1.77-5.52”)</li>
	<li>Płyta wspierająca – wyposażona w gumowe stopki w celu zapewnienia stabilności <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a></li>
</ol>
<img alt="Układ spektroskopowy do analizy DNA; wzbudzenie optyczne, obserwacja emisji; obraz z eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Urządzenie do ogrzewania i unieruchamiania gryzoni. (A) Przed użyciem dwie części urządzenia są ułożone obok siebie na czystym blacie laboratoryjnym. (B) Po włączeniu urządzenia grzewczego termostat aktywuje grzałkę. Żarówka pozostaje zapalona i emituje ciepło, dopóki komora grzewcza nie osiągnie zadanej temperatury. Urządzenie grzewcze automatycznie powtarza cykl grzania w celu utrzymania temperatury wewnętrznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ do analizy zachowania myszy (A) z systemem śledzenia oraz pomiar wagi (B) w eksperymencie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Myszy (C57BL/6) umieszczone w urządzeniu do ogrzewania i unieruchamiania. (A) Myszy poddawane obróbce cieplnej w celu rozszerzenia naczyń krwionośnych. Zwierzęta (4–6 myszy na jedną procedurę) są przenoszone z klatki hodowlanej do komory grzewczej urządzenia i ogrzewane przez minimum 5–10 min. (B) Mysz unieruchomiona do wstrzyknięcia dożylnie do ogona. Mysz jest przenoszona z komory grzewczej do otworu stożkowego urządzenia unieruchamiającego, a jej ogon przechodzi przez szczelinę. Myszy delikatnie odciąga się do tylnej krawędzi stożka, aż nasada ogona dotrze do wierzchołka stożka. Podczas wciągania zwierzęcia w stronę podstawy stożka przy łagodnej rotacji bocznej, jedna tylna kończyna jest ustawiona w górę tak, aby wystawała ze szczeliny, co pozwala na ustawienie bocznej żyły ogonowej na godzinie 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Test ucisku nerwu ogona gryzonia, metoda porównująca różne punkty ucisku, analiza eksperymentalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Identyfikacja bocznych żył ogonowych u myszy. (A) Ogon nieleczonej myszy rasy Swiss Webster. Mysz została umieszczona w urządzeniu ograniczającym ruchy bez wcześniejszej obróbki cieplnej w celu wywołania rozszerzenia naczyń. Boczną żyłę ogonową można zidentyfikować jako cienkie, ciemne naczynie biegnące pod skórą. (B) Ogon myszy Swiss Webster poddanej działaniu urządzenia grzewczego przez 10 min. Mysz po obróbce cieplnej jest unieruchomiona w celu wykonania wstrzyknięcia do żyły ogonowej. Boczna żyła ogonowa jest wyraźnie widoczna przez skórę ze względu na zwiększenie średnicy naczynia wywołane wazodylatacją. (C) Ogon myszy C57BL/6 poddanej działaniu urządzenia grzewczego przez 10 min i unieruchomionej w celu wykonania wstrzyknięcia do żyły ogonowej. Rozszerzenie naczyń poprawia widoczność żyły ogonowej przez silnie pigmentowaną skórę, choć żyła nie jest tak łatwo dostrzegalna jak u jasnych myszy Swiss Webster ze względu na słaby kontrast kolorystyczny względem żyły. Czerwone strzałki wskazują położenie bocznej żyły ogonowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie miejsc wstrzyknięć domięśniowych w eksperymencie na myszach w celu analizy skuteczności leku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Iniekcja do żyły ogonowej wykonana u myszy (Swiss Webster) poddanych działaniu ciepła.(A–B) Wprowadzenie igły do bocznej żyły ogonowej w miejscu wstrzyknięcia. Igłę (27 G, ½-in) ustawia się równolegle do żyły ogonowej, ściętym końcem do góry i skierowanym zgodnie z kierunkiem przepływu krwi, a następnie wprowadza. (C–D) Umieszczenie igły w żyle ogonowej i iniekcja. Koniuszek igły posuwa się dalej o 2–4 mm do światła żyły. Kciuk kładzie się na tłoku strzykawki i powolnym, jednostajnym naciskiem podaje pożądaną objętość. Owale wskazują miejsca wstrzyknięcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Biopsja ogona myszy; wizualizacja procesu; metoda pobierania próbek; procedura eksperymentalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Procedura po iniekcji. (A) Obszar krwawienia w miejscu iniekcji. Krwawienie i cofanie się wstrzykniętego roztworu występują natychmiast po usunięciu igły. Można to zminimalizować poprzez mocny ucisk miejsca iniekcji kciukiem. (B) Formowanie się skrzepu krwi w miejscu iniekcji. Delikatny ucisk czystą gazą/wycieraczką ułatwia krzepnięcie krwi w ranie po iniekcji. Strzałki wskazują miejsca iniekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres temperatury w komorze; czas vs. °C; cykl grzałki; zaznaczony zakres optymalny; dane eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Temperatura wewnętrzna komory grzewczej podczas użytkowania. Urządzenie grzewcze zostało aktywowane w celu ogrzewania do wyznaczonych temperatur nastawy. Monitorowano temperaturę powietrza wewnątrz komory grzewczej urządzenia i rejestrowano cykle grzania (żarówka włączona/żółte kropki, wyłączona/szare kropki) przez 45 min. Pomarańczowy obszar wskazuje optymalny zakres temperatury dla indukcji wazodylatacji u gryzoni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy przeżywalności i wskaźnika sepsy; wyzwanie letalne, od Cd do Ca, analiza danych odpowiedzi immunologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Śmiertelność z powodu sepsy w stosunku do ochrony indukowanej szczepionką po letalnym wyzwaniu Candida albicans. Myszy (samice Swiss Webster w wieku 8 tygodni) szczepiono dożylnie awirulentnym żywym szczepem Candida dubliniensis Wü284 (Cd), a następnie, po 14 dniach, poddano letalnemu wyzwaniu dożylnemu z użyciem szczepu dzikiego C. albicans DAY 185 (1 x 105 komórek na mysz). (A) Śmiertelność oceniano przez 10 dni po letalnym wyzwaniu. (B) Monitorowano zachorowalność zwierząt na sepsę i oceniano je zgodnie z zmodyfikowaną skalą klinicznej oceny sepsy u myszy (Mouse Clinical Assessment Score for Sepsis, M-CASS)43. Dane stanowią sumę z 4 niezależnych eksperymentów z 10 myszami w grupie i zostały przeanalizowane przy użyciu testu log-ranka Mantela-Coxa. **** p &lt; 0.0001. SEM, błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek dodatkowy 1: Powtarzalność śmiertelności w sepsie i przeżywalności indukowanej szczepionką po wyzwaniu Candida albicans w krwiobiegu. Każdy panel przedstawia dane z czterech niezależnych eksperymentów, które włączono do wyniku skumulowanego pokazanego na Rysunku 8A. Każdy eksperyment przeprowadzono z użyciem 10 myszy na grupę i przeanalizowano za pomocą testu log-ranka Mantela-Coxa. Ca, Candida albicans. Cd, Candida dubliniensis. **** p &lt; 0.0001. *** p &lt; 0.01. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61961/supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>

Tutaj prezentujemy skuteczną i efektywną metodę wstrzykiwania żył ogonowych gryzoni za pomocą unikalnie zaprojektowanego urządzenia rozgrzewającego/krępującego. Usprawniając inicjację procesów rozszerzania naczyń krwionośnych i ograniczania, protokół ten umożliwia dokładne i terminowe wstrzyknięcia dożylne dużym grupom zwierząt przy minimalnym stresie.

Nowoczesne urządzenie rozgrzewające/ograniczające do skutecznych iniekcji żył ogonowych w mysim modelu sepsy grzybiczej

In rodent models, tail vein injections are important methods for intravenous administration of experimental agents. Tail vein injections typically involve ...

Urządzenie grzewcze i krępujące oferuje uproszczoną technikę skutecznego przeprowadzania dożylnych iniekcji do żyły ogonowej, zapewnia ogrzewanie w kontrolowanym środowisku i skuteczną obsługę w celu przeprowadzenia dożylnego wstrzyknięcia żyły ogonowej. Przed wypróbowaniem tej techniki ważne jest, aby zapoznać się z protokołem i poćwiczyć wstrzykiwanie soli fizjologicznej. Demonstracja wizualna daje możliwość pokazania wskazówek i zastrzeżeń, które pomogą w procedurze.Junko Yano, adiunkt w moim laboratorium, ustawi sprzęt, a ja zademonstruję procedurę. Aby zainicjować urządzenie grzewcze, kontroluj urządzenie grzewcze na czystym płaskim blacie stołu i włącz je, upewniając się, że wskaźnik mocy termostatu lamp świeci na zielono. Następnie umieść materiał ściółkowy w komorze grzewczej, aby obszar był suchy i zatrzymywał ciepło.W przypadku ustawienia urządzenia przytrzymującego należy umieścić jednostkę przytrzymującą obok jednostki grzewczej i określić odpowiednie rozmiary stożków dla zwierzęcia. Ręcznie wyreguluj szerokości podstawy giętkiego aluminiowego stożka, aby zapewnić zwierzęciu odpowiednie unieruchomienie. Alternatywnie zastąp stożek modelami dopasowanymi na zamówienie, aby pomieścić zwierzęta o różnych rozmiarach.Ustaw termostat na żądaną temperaturę za pomocą pokrętła sterującego, upewniając się, że wskaźnik grzałki świeci na czerwono i że żarówka jest włączona. Uważnie monitoruj wyświetlacz temperatury wewnętrznej, gdy żarówka jest włączona. Aktywuje się automatycznie po osiągnięciu temperatury docelowej.Ustawić wysokość stożka platformy przytrzymującej na optymalnym poziomie dla użytkownika za pomocą pokrętła regulacji wysokości. Po osiągnięciu temperatury docelowej delikatnie przenieść zwierzęta z klatki do komory grzewczej. W komorze grzewczej można bezpiecznie przechowywać od czterech do sześciu myszy lub jednego szczura przez maksymalnie 20 do 30 minut.Obróbka cieplna przez 5 do 10 minut wystarczy, aby wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych i poprawić widoczność żył ogonowych. Monitoruj zwierzę pod kątem wszelkich oznak ostrego stresu cieplnego, takich jak szybkie oddychanie, letarg lub skakanie. Wyjmij zwierzę z komory, podnosząc je za podstawę ogona i umieść na otworze stożkowym jednostki krępującej.Gdy zwierzę chwyta przednimi łapami daleką krawędź stożka, delikatnie pociągnij ogon do tyłu i przełóż ogon przez otwartą szczelinę. Zabezpiecz jedną z tylnych nóg wystających ze stożka tak, aby żyła boczna była widoczna w miejscu godziny 12. Chwyć ogon od połowy do 2/3 długości ręką niedominującą między kciukiem a palcem wskazującym, wywierając lekkie napięcie na żyłę boczną, aby utrzymać pozycję ogona i rozszerzenie naczyń krwionośnych.Przetrzeć skórę w miejscu wstrzyknięcia gąbką z gazy lub wacikiem zwilżonym 70% alkoholem. Trzymać strzykawkę ręką dominującą i ustawić igłę równolegle do ogonka. Włóż igłę w kierunku przepływu krwi pod kątem od 10 do 25 stopni i wsuń się dalej w światło żyły, penetrując od dwóch do czterech milimetrów.Powoli wstrzykiwać roztwór. W przypadku oporu lub białych pęcherzy powyżej miejsca wstrzyknięcia, należy usunąć igłę i podjąć próbę drugiego wstrzyknięcia w miejsce powyżej pierwotnego umieszczenia igły. Jeśli wstrzyknięcie jednej żyły bocznej nie powiedzie się, należy przestawić zwierzę na przeciwną stronę i podjąć więcej prób na żyle przeciwległej.Wyjąć igłę i mocno docisnąć kciukiem miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętego roztworu lub krwi. Kontynuuj delikatny ucisk czystą gazą lub chusteczką higieniczną, aż krwawienie zostanie zatrzymane. Wróć zwierzę do klatki i monitoruj je przez pięć minut, upewniając się, że zwierzę wznawia normalną aktywność bez dalszego krwawienia.Po uruchomieniu grzałki komory grzewczej, emisja ciepła przez żarówkę gwałtownie podnosi temperaturę wewnętrzną w ciągu pierwszych 5 do 15 minut, w zależności od temperatury docelowej. Grzałka dezaktywuje żarówkę, jeśli wykryta temperatura wewnętrzna przekroczy ustawioną temperaturę. Następnie urządzenie automatycznie powtarza cykl grzewczy, aby utrzymać temperaturę wewnętrzną.W mysim modelu kandydozy krwioobiegu prowadzącej do sepsy, dożylne podanie Candida albicans u szwajcarskich myszy Webster spowodowało szybki początek sepsy i rozprzestrzenianie się organizmów, prowadząc do wysokiej śmiertelności w ciągu trzech do czterech dni. Natomiast zwierzęta mogą być chronione przed sepsą poprzez wstępne szczepienie lub szczepienie awirulentowym szczepem Candida dubliniensis, osiągając ponad 95% przeżywalności po śmiertelnym prowokacji dożylnej zjadliwymi C. albicans. Nieszczepione zwierzęta ze śmiertelną infekcją miały znaczny wzrost zachorowalności wywołanej sepsą, podczas gdy grupa zaszczepiona wykazywała minimalne objawy po śmiertelnym prowokacji.Wyniki dotyczące postępującej śmiertelności w porównaniu z ochroną za pośrednictwem szczepionki uzyskano w sposób powtarzalny w czterech niezależnych eksperymentach. Zachowaj ostrożność podczas ustawiania zwierzęcia w stożku, aby prawidłowo ustawić igłę, aby uzyskać dostęp do żyły, wyregulować igłę do żyły i wstrzyknąć żyłę. Ta usprawniająca technika oferuje wydajny i skuteczny sposób przeprowadzania iniekcji do żył ogonowych, co poprawi wyniki naukowe badaczy.

a-contemporary-warmingrestraining-device-for-efficient-tail-vein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania oznaczonych komórek rakowych za pomocą iniekcji żyły ogonowej do modelu mysiego. Ponadto monitorujemy powstawanie i wzrost przerzutów raka piersi za pomocą obrazowania żywych zwierząt w czasie rzeczywistym.

Wstrzyknięcie żyły ogonowej: metoda podawania komórek rakowych do badań przerzutowych w modelu mysim

Ten film opisuje protokół dosercowego wstrzykiwania retrowirusów do transgenicznej myszy, aby zapewnić transfer genów do proliferujących zmian trzustkowych β przednowotworowych. Metoda ta może również pomóc w ocenie funkcji genów kandydujących w przerzutach nowotworowych.

Dosercowe dostarczanie wektorów wirusowych: technika wstrzykiwania wektorów wirusowych dosierdziowo w celu zbadania przerzutów do trzustki w modelu mysim

W tym filmie komórki czerniaka są wstrzykiwane dożylnie przez żyłę ogonową w modelu mysim. Komórki czerniaka przemieszczają się dalej przez układ krążenia, przystosowując się do odległego mikrośrodowiska i powodując przerzuty w narządach, takich jak płuca.

Eksperymentalny mysi model czerniaka z przerzutami: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek czerniaka w płucach

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Hydrodynamiczne wstrzykiwanie wektorów integracji opartych na transpozonach do żyły ogonowej umożliwia stabilną transfekcję mysich hepatocytów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół dla systemów transfekcji, który umożliwia długotrwałą konstytutywną ekspresję pojedynczego transgenu lub połączoną konstytutywną i indukowaną doksycykliną ekspresję transgenu lub miR-shRNA w wątrobie.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Tutaj prezentujemy metodę walidacji iniekcji do żył ogonowych u szczurów poprzez wykorzystanie danych obrazowania fluorescencji w bliskiej podczerwieni z barwników włączonych do środków lub sond biologicznych. Ogon jest obrazowany przed i po iniekcji, sygnał fluorescencyjny jest określany ilościowo i dokonywana jest ocena jakości iniekcji.

Nowa najlepsza praktyka walidacji iniekcji do żył ogonowych u szczurów za pomocą środków znakowanych w bliskiej podczerwieni

Przetoka aortalno-bębenkowa powstała poprzez przebicie mysiej aorty podnerkowej przez obie ściany do żyły głównej dolnej, a następnie powstało zwężenie w jej odpływie poprzez częściowe podwiązanie żyły głównej dolnej. Ten powtarzalny model może być wykorzystany do badania zwężenia żyły centralnej.

Mysi model zwężenia żyły centralnej z wykorzystaniem przetoki aortalno-caval ze zwężeniem odpływu

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Obrzęk limfatyczny to obrzęk kończyn spowodowany dysfunkcją układu limfatycznego. Opisujemy przewlekły model obrzęku limfatycznego mysiego ogona i nowatorskie zastosowanie technologii nanotransfekcji tkanek (TNT) do dostarczania ładunku genetycznego do ogona.

Model obrzęku limfatycznego mysiego ogona

Wyrafinowany model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej (TVT) u znieczulonych myszy jest czułą metodą in vivo do oceny krwawienia hemofilowego. Ten zoptymalizowany model krwawienia TVT wykorzystuje utratę krwi i czas krwawienia jako punkty końcowe, udoskonalając inne modele i unikając śmierci jako punkt końcowy.

Model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią A w pełni znieczuloną

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Poznaj nowoczesną metodę iniekcji żył ogonowych u myszy z wykorzystaniem urządzenia rozgrzewającego i ograniczającego. Technika zapewnia precyzyjne podawanie substancji przy minimalnym stresie zwierząt w modelu sepsy grzybiczej.

Nowoczesne urządzenie rozgrzewające/ograniczające do skutecznych iniekcji żył ogonowych w mysim modelu sepsy grzybiczej

Przeglądaj więcej filmów