Name: Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj model myszy do badania nawracających zakażeń dróg moczowych wywołanych przez Escherichia coli i Gardnerella vaginalis. Metoda pozwala analizować mechanizmy reaktywacji bakterii z rezerwuarów w pęcherzu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Lynne Foster za pomoc techniczną w eksperymentach z infekcjami, Jamesowi Fitzpatrickowi z Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) za dostęp do SEM, Scottowi Hultgrenowi za szczep UTI89kanR UPEC oraz Davidowi Hunstadowi za krytyczną lekturę manuskryptu.
Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), przez Center for Women's Infectious Disease Research w Washington University School of Medicine (Nagroda za badania pilotażowe dla NMG), przez American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) i #14POST20020011 (NMG), oraz przez National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) i NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projekt II PI:ALL) oraz K01 DK110225-01A1 (NMG). Niektóre z badań na zwierzętach przeprowadzono w placówce wspieranej przez grant NCRR C06 RR015502. Centrum Obrazowania Komórkowego Uniwersytetu Waszyngtońskiego (WUCCI; gdzie przeprowadzono SEM) i MSJ były wspierane przez Washington University School of Medicine, Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) oraz National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów w związku z tym badaniem.

Pierwszy krytyczny krok w tym modelu ma na celu identyfikację myszy, które nie usunęły bakteriurii UPEC podczas pierwotnej fazy ZUM. Myszy te muszą zostać usunięte z eksperymentu, ponieważ w przeciwnym razie zakłóciłyby wskaźniki bakteriurii UPEC po ekspozycji na G. vaginalis. Po początkowym zaszczepieniu UPEC mocz powinien być pobierany co tydzień w celu monitorowania klirensu bakteryjnego. Około 65-80% myszy C57BL/6 usunie infekcję UTI89kanR w ciągu 4 tygodni. Inne wsobne szczepy myszy mają różne skłonności do klirensu UPEC 42,43 i tworzenia zbiornika, a zatem mogą nie być odpowiednie dla tego modelu. Drugim krytycznym punktem jest to, że badania empiryczne wykazały, że dwie sekwencyjne inokulacje G. vaginalis (w odstępie 12 godzin lub 1 tygodnia) są konieczne, aby wywołać znaczące pojawienie się rezerwuaru powyżej spontanicznego pojawienia się tła, które występuje u myszy kontrolnych narażonych tylko na PBS. Inne okresy czasu między dwiema sekwencyjnymi ekspozycjami nie zostały przetestowane, ale mogą dać podobne wyniki. Należy zauważyć, że zmniejszenie miana pęcherza moczowego UPEC zaobserwowano tylko w modelu, w którym ekspozycję na G. vaginalis podano w odstępie 1 tygodnia39. Chociaż można podać więcej niż dwie ekspozycje, dowody empiryczne sugerują, że samo wielokrotne cewnikowanie zwiększa pojawianie się, co może zakłócić interpretację wyników lub wymagać większej liczby zwierząt do rozróżnienia różnic między grupami narażenia a grupą kontrolną. Wreszcie, metoda mocowania pęcherza moczowego in situ składa się z kilku krytycznych etapów. Wymagana jest pewna umiejętność, aby zapewnić, że utrwalacz pozostanie w zaciśniętych pęcherzach. Opróżnione pęcherze będą trudniejsze do zobrazowania za pomocą SEM. Ważne jest również, aby zachować bardzo delikatność podczas wstrzykiwania utrwalacza do pęcherza moczowego, ponieważ zeskrobanie nabłonka dróg moczowych za pomocą cewnika zawierającego utrwalacz może wywołać złuszczanie dróg moczowych niezależnie od tego, co jest wywoływane przez G. vaginalis. Wszystkie stężenia wymienione w koktajlu utrwalającym są stężeniami końcowymi. Niewłaściwe proporcje tych czynników mogą skutkować niewystarczającym utrwaleniem i pęcznieniem lub kurczeniem się komórek. Utrwalacze należy ogrzać do temperatury fizjologicznej, aby uniknąć szoku temperaturowego w komórkach i tkankach. Ocieplenie zapewnia również nieznaczną poprawę szybkości dyfuzji utrwalaczy przez błony plazmatyczne. Chociaż barwienie osmem można często pominąć w przypadku próbek przygotowanych do analizy SEM, jest to niezbędny krok w tym protokole, aby ustabilizować lipidy i zapobiec pękaniu błon komórkowych podczas suszenia w punkcie krytycznym.
Protokół ten może być modyfikowany w celu przetestowania innych szczepów UPEC i/lub G. vaginalis pod kątem ich zdolności do tworzenia rezerwuarów i wywoływania ich pojawiania się. Można również dodać inne czynniki eksperymentalne, takie jak narażenie na inne bakterie pochwy (np. Lactobacillus crispatus PVAS100) lub zabity termicznie G. vaginalis, z których żaden nie wykazuje patologii w tym modelu39. Przy wyborze innych szczepów bakteryjnych do testowania, ważne jest, aby wykazać stały wzrost, tak aby standardowe stężenie inokulum mogło być stosowane we wszystkich eksperymentach. Wzrost JCP8151BSmR został zoptymalizowany w komorze beztlenowej. Szczep ten mógłby być prawdopodobnie uprawiany w beztlenowym systemie GasPak, ale wymagałoby to optymalizacji, aby zapewnić solidny wzrost bakterii. Na koniec może być możliwe zmodyfikowanie czasu niektórych kroków w modelu. Na przykład, mocz może być zbierany we wcześniejszych punktach czasowych podczas fazy tworzenia zbiornika UPEC w celu monitorowania reakcji CFU lub gospodarza. W modelu tym nie zaobserwowano niekorzystnego wpływu pobierania próbek moczu we wczesnych punktach czasowych (3, 6, 12 hpi) na postęp infekcji lub tworzenie rezerwuarów. Donoszono, że pojawienie się zbiorników UPEC następuje po dwóch JCP8151B dawkachSmR podanych 12 godzin lub 1 tygodniu, ale inne odstępy czasu nie zostały jeszcze przetestowane. Możliwe jest również skrócenie całkowitego czasu trwania modelu poprzez skrócenie fazy tworzenia się zbiornika UPEC do 2 tygodni (zamiast 4 tygodni), ponieważ wiele myszy usuwa bakteriurię do tego czasu. W poprzednich badaniach oceniających pojawienie się UPEC po ekspozycji pęcherza moczowego na chemiczne środki złuszczające stosowano 1 lub 2 tygodnie fazy tworzenia zbiornika UPEC17,18. Jednak skrócenie czasu usuwania bakteriurii UPEC może odbywać się kosztem konieczności uboju większej liczby zwierząt z doświadczenia. Wreszcie, analizę SEM pęcherza moczowego można przeprowadzić w dodatkowych punktach czasowych, aby obserwować czas trwania działania G. vaginalis na nabłonek dróg moczowych.
Jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii, szczególnie w odniesieniu do analizy SEM pęcherza moczowego. W zależności od użytego tła myszy i ilości obecnego stanu zapalnego, niektóre pęcherze będą miały bardzo cienkie ścianki. Pęcherze te mają tendencję do zwijania się bardziej podczas wysychania w punkcie krytycznym i mogą powodować kształt przypominający muszlę cowrie. Jeśli tak się stanie, najlepszą metodą jest przecięcie pęcherza w kształcie muszli na pół wzdłuż zwiniętego interfejsu, a następnie drugi raz, aby usunąć większość zwisającej tkanki. Cięcie działa najlepiej za pomocą obosiecznej żyletki pokrytej PTFE. Nadmiar tłuszczu może czasami rozpuszczać się podczas etapów barwienia osmu. Może to spowodować powstawanie niepożądanych nierozpuszczalnych kropelek tłuszczu, które mogą nie zmyć się podczas etapów płukania i odwadniania i które mogą osadzać się na powierzchni pęcherza podczas późniejszego suszenia. Kropelki te mogą wyglądać zarówno jako małe kule, jak i struktury przypominające dysk rozrzucone po próbce (ryc. 4D). Można to złagodzić, upewniając się, że jak najwięcej tkanki tłuszczowej zostanie usunięte z okolic pęcherza. Powłokę irydową można zastąpić platyną, ale grubość powinna być ograniczona do minimum, aby zmniejszyć maskowanie drobnych szczegółów strukturalnych. Zdecydowanie zaleca się stosowanie stolika obrotowego podczas powlekania.
Jednym z ograniczeń tego modelu jest to, że wymaga on dużej liczby myszy. Tylko 65-80% myszy C57BL/6 usunie bakteriurię UPEC i będzie nadawać się do późniejszej inokulacji G. vaginalis lub PBS (patrz ryc. 2C). Aby uzyskać 10-12 myszy na grupę (inokulacja G. vaginalis vs. PBS), ~30 myszy powinno być początkowo zainfekowanych UPEC. Co więcej, prawdopodobnie konieczne będzie przeprowadzenie wielu eksperymentów w celu uzyskania kontrprób biologicznych niezbędnych do wykrycia istotności statystycznej. Gdy ekspozycje podawano w odstępie 1 tygodnia, pojawienie się UPEC wystąpiło u 14% myszy narażonych na PBS (Figura 3B). Tak więc wykrycie znacznego wzrostu UPEC rUTI u myszy narażonych na kontakt z G. vaginalis w porównaniu z kontrolami PBS (zasilanymi na poziomie 0,8; alfa = 0,05 [jednostronnie]) wymaga przetestowania łącznej sumy co najmniej 40 myszy dla każdej grupy ekspozycji. Dodatkową kwestią jest to, że eksperymenty te są kosztowne i pracochłonne. Myszy muszą być monitorowane co tydzień pod kątem klirensu UPEC, a czas trwania eksperymentu wynosi 4-5 tygodni w zależności od tego, czy G. vaginalis podaje się dwa razy w ciągu 12 godzin, czy dwa razy w odstępie 1 tygodnia. SEM jest pracochłonny i może być kosztowny, w zależności od dostępności mikroskopu i opłat za serwis. Przygotowanie całego pęcherza moczowego do SEM dostarcza obfitego materiału do analizy, ale wadą jest to, że analiza każdego pęcherza może być czasochłonna. W związku z tym jest prawdopodobne, że tylko ograniczona liczba pęcherzy może być analizowana przez SEM w porównaniu z wyższą liczbą zwierząt używaną do określania miana moczu i tkanek. Ponadto uzyskanie wysokiej jakości obrazów zakrzywionych powierzchni "bańek" pęcherza moczowego wymaga umiejętności ze względu na cienie, które mogą utrudniać widoczność. Chociaż SEM pęcherza moczowego jest przydatnym narzędziem do wizualizacji złuszczania urotelialnego, ta metoda jest w dużej mierze jakościowa. Ponieważ próbka jest utrwalona w okrągłym kształcie i ze względu na zastosowanie aldehydu glutarowego w utrwalaczu, badania przesiewowe w kierunku bakterii wykazujących ekspresję fluorescencji za pomocą mikroskopii świetlnej nie są możliwe. Barwienie immunologiczne i barwniki chemiczne są niekompatybilne z tym procesem ze względu na zastosowanie aldehydu glutarowego, który sieciuje większość antygenów i osm, a także maskuje miejsca antygenu i ciemni tkankę. To powiedziawszy, technika SEM jest przydatna w przypadku parametrów, które można ocenić ilościowo bez użycia dodatkowych sond, takich jak rozmiar komórki48,49.
Model ten oferuje kilka zalet wykraczających poza wcześniej opisane metody. Pozwala to na zbadanie mechanizmów UPEC rUTI spowodowanych wydostaniem się z rezerwuarów pęcherza moczowego, w przeciwieństwie do ponownego wprowadzenia do pęcherza moczowego ze źródła zewnętrznego. Inne modele rUTI spowodowane wydostaniem się ze zbiorników pęcherza moczowego wykorzystują środki chemiczne (siarczan protaminy lub chitozan) w celu wywołania złuszczania urotelialnego17,18, które nie byłyby wyzwalaczami rUTI u kobiet. G. vaginalis jest rozpowszechnioną bakterią układu moczowo-płciowego, którą wykryto w moczu pobranym bezpośrednio z pęcherza moczowego poprzez cewnikowanie lub aspirację nadłonową u niektórych kobiet23,26. Fakt ten, w połączeniu ze znanym związkiem między BV (w którym G. vaginalis zarasta w pochwie) a ZUM, sugeruje, że G. vaginalis jest klinicznie prawdopodobnym czynnikiem wyzwalającym rUTI. Wreszcie, metoda mocowania pęcherza moczowego in situ zachowuje ultrastrukturę pęcherza moczowego i ogranicza uszkodzenia, zapewniając, że warstwy pęcherza moczowego nie oddzielają się od siebie. Poprzednie metody wizualizacji nabłonka dróg moczowych tradycyjnie polegały na tym, że użytkownik aseptycznie zbierał, przecinał, rozciągał i przypinał pęcherz moczowy do tacki preparacyjnej przed zanurzeniem rozciągniętego pęcherza w utrwalaczu48. Ta metoda daje bardzo płaską próbkę, ale nie zapewnia równomiernego ani naturalnego rozciągania tkanki i może powodować nadmierne i niedostateczne rozciąganie obszarów (co skutkuje silnie pomarszczoną tkanką) i może powodować oddzielanie się warstwy pęcherza. Ponadto te fizyczne manipulacje pęcherza moczowego w celu rozciągnięcia i przygwożdżenia tkanki mogą powodować uszkodzenia, w tym złuszczanie dróg moczowych. Inną metodą jest zanurzenie nienaruszonych pęcherzy w utrwalaczu przed zatopieniem w parafinie i pobraniem cienkich skrawków za pomocą mikrotomu. Cienkie przekroje są nieocenione w eksperymentach immunohistochemicznych w celu zbadania lokalizacji bakterii i białek gospodarza, ale cienkie przekroje nie pozwalają na wizualizację powierzchni urotelialnej. Ta metoda SEM pozwala na jednoczesne zbadanie powierzchni całego pęcherza moczowego.
Jak opisano, przyszłe zastosowania tego modelu obejmują testowanie innych szczepów UPEC w celu określenia, czy tworzą one rezerwuary wewnątrzkomórkowe oraz testowanie innych szczepów G. vaginalis w celu oceny, czy wywołują one złuszczanie i pojawienie się UPEC powodujące zakażenie układu moczowego. Inne szczepy myszy poza myszami C57BL / 6 mogą być również testowane, chociaż myszy z dużą skłonnością do rozwoju przewlekłego zapalenia pęcherza moczowego (takie jak myszy na tle C3H) nie są zalecane, ponieważ zbyt wiele myszy musiałoby zostać usuniętych z eksperymentu. Dodatkową zaletą myszy C57BL/6 jest to, że na rynku dostępnych jest wiele szczepów z nokautem genetycznym. Takie szczepy dają możliwość zbadania czynników żywicielskich zaangażowanych w tworzenie się zbiorników i/lub powstawanie.

Infekcje dróg moczowych (UTI) stanowią znaczne obciążenie zdrowotne na całym świecie, wpływając na jakość życia milionów ludzi każdego roku, zwłaszcza kobiet1. Uropatogenne Escherichia coli (UPEC) są najczęstszą przyczyną ZUM1. Wielu pacjentów (około 20-30%), u których rozwinie się ZUM, doświadczy nawrotu ZUM (rUTI) w ciągu 6 miesięcy, pomimo ustąpienia początkowej infekcji za pośrednictwem antybiotyków2. Niestety, aż 5% kobiet przed menopauzą cierpi na 3 lub więcej rUTI każdego roku3,4. Sekwencyjne epizody rUTI mogą być spowodowane utrzymywaniem się tego samego szczepu UPEC z indeksu case5,6,7,8. Dane z próbek pobranych od ludzi i modeli mysich sugerują, że zakażenie układu moczowego tego samego szczepu może być spowodowane przez UPEC znajdujący się w zbiornikach spoczynku w pęcherzu moczowym. U ludzi UPEC wykryto w komórkach nabłonka i biopsjach pęcherza moczowego pacjentów z ZUM9,10,11,12,13. Badania na myszach C57BL/6 wykazały, że niektóre szczepy UPEC mogą tworzyć spoczynkowe rezerwuary wewnątrzkomórkowe w pęcherzu moczowym, wykryte za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz homogenizacji i hodowli tkanki pęcherza moczowego, które utrzymują się przez miesiące po ustąpieniu bakteriurii14,15,16. Leczenie pęcherza moczowego środkami indukującymi złuszczanie nabłonka pęcherza moczowego (urotelium), np. siarczan protaminy17 lub chitozan18, wyzwalają pojawienie się UPEC ze zbiorników w celu wywołania rUTI. Dane te sugerują, że u kobiet posiadających rezerwuary UPEC w pęcherzu moczowym z powodu wcześniejszej infekcji, ekspozycja na pęcherz, która prowadzi do złuszczania dróg moczowych, może wywołać rUTI.
Istnieje coraz więcej dowodów na to, że mikrobiota pochwy przyczynia się do infekcji dróg moczowych19,20. Gardnerella vaginalis jest częstym członkiem zarówno mikrobioty pochwy, jak i układu moczowego21,22,23,24,25,26,27,28,29. W pochwie obecność wysokiego poziomu G. vaginalis jest związana z dysbiozą mikrobiologiczną znaną jako bakteryjne zapalenie pochwy (BV), która dotyka ~30% kobiet30,31,32. Kobiety z BV są bardziej narażone na wystąpienie ZUM w porównaniu z kobietami, u których społeczność pochwy jest zdominowana przez Lactobacillus33,34,35,36,37. W modelach mysich G. vaginalis powoduje złuszczanie nabłonka zarówno w pochwie38, jak i w pęcherzu moczowym39. U myszy C57BL/6 zawierających zbiorniki pęcherza moczowego UPEC, dwie sekwencyjne ekspozycje pęcherza moczowego na G. vaginalis - ale nie na PBS - powodują ponowne pojawienie się UPEC z rezerwuarów, powodując UPEC rUTI. O pojawieniu się dowodów świadczy pojawienie się mian UPEC w moczu myszy, które wcześniej ustąpiły z bakteriurii UPEC, a następnie spadek miana homogenatu pęcherza UPEC przy uśmierceniu w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi narażonymi na PBS39. Co ciekawe, nie ma trwałej kolonizacji przez G. vaginalis w pęcherzu moczowym. W zdecydowanej większości przypadków dwie krótkie ekspozycje, z których każda zawierała mniej niż 12 (h) żywotnej G. vaginalis w moczu, są wystarczające, aby wywołać złuszczanie dróg moczowych i sprzyjać zakażeniu dróg moczowych.
Ten protokół opisuje mysi model rUTI spowodowany przez UPEC rezydujący w wewnątrzkomórkowych zbiornikach pęcherza, wykorzystujący inokulację pęcherza G. vaginalis do wywołania nawrotu. Postęp osiągnięty dzięki temu modelowi polega na tym, że G. vaginalis jest klinicznie istotnym biologicznym czynnikiem wyzwalającym rUTI w porównaniu z wcześniej stosowanymi środkami chemicznymi. Co więcej, stosunkowo krótkie przeżycie G. vaginalis w drogach moczowych myszy pozwala na zbadanie wpływu przejściowej ekspozycji na drobnoustroje na błonę dróg moczowych, która może wystąpić po aktywności seksualnej. Oprócz nakreślenia modelu rUTI, protokół ten opisuje również metody cytologii moczu oraz utrwalania pęcherza moczowego in situ i obrazowania nabłonka moczowego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
Ten protokół nawracających UTI wywołanych przez G. vaginalis, wykorzystuje szczep UPEC UTI89 z kasetą odporną na kanamycynę (UTI89kanR)40. Nie wszystkie testowane szczepy UPEC były w stanie tworzyć wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne podczas ostrej fazy infekcji u myszy41 i nie wiadomo jeszcze, czy wszystkie szczepy UPEC mają zdolność do tworzenia utajonych rezerwuarów wewnątrzkomórkowych. Tworzenie się zbiornika powinno zostać potwierdzone przed użyciem innych szczepów UPEC w modelu. W protokole tym wykorzystuje się spontaniczny izolat G. vaginalis oporny na streptomycynę, JCP8151BSmR38. Indukcja rUTI przez JCP8151BSmR wymaga dwóch kolejnych szczepień G. vaginalis, podanych w odstępie 12 godzin lub 7 dni (d)39. To, czy inne szczepy G. vaginalis wywołują złuszczanie i/lub UPEC rUTI, pozostaje do ustalenia w przypadku tego modelu. Konieczne jest stosowanie szczepów UPEC i G. vaginalis o znanej oporności na antybiotyki (takich jak kanamycyna lub spektynomycyna w przypadku UPEC i streptomycyna w przypadku G. vaginalis), ponieważ do płytek agarowych można dodawać antybiotyki, aby zapobiec wzrostowi endogennej mikroflory myszy, która w przeciwnym razie mogłaby zakłócać liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) w celu monitorowania infekcji. Jest to szczególnie ważne w przypadku hodowli próbek moczu, ponieważ mocz myszy często zawiera inne bakterie, które mogą przerastać na płytkach hodowlanych bez antybiotyków. Pochodzenie tych endogennych bakterii w moczu myszy jest nieznane, ale prawdopodobnie odzwierciedla bakterie okołocewkowe i moczowo-płciowe zebrane podczas zbierania moczu.
G. vaginalis jest fakultatywną bakterią beztlenową i dlatego ten protokół opisuje hodowlę G. vaginalis JCP8151BSmR w komorze beztlenowej. Jeśli komora beztlenowa nie jest dostępna, można zastosować inne metody utrzymania beztlenowych warunków wzrostu (takie jak woreczek GasPak w hermetycznym pojemniku). Alternatywnie, niektóre szczepy G. vaginalis (w tym JCP8151BSmR) będą rosły w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (5% CO2 ). Tak jak użycie szczepów G. vaginalis innych niżJCP8151B SmR wymaga testów w celu zapewnienia, że bakterie zachowują się podobnie w tym modelu, zmieniające się warunki wzrostu wymagają empirycznego określenia idealnych czasów trwania hodowli (na płytkach i w płynie) i ekwiwalentów gęstości optycznej (OD)600 w celu osiągnięcia pożądanych stężeń żywotnego inokulum. Ponadto nie wiadomo, czy warunki wzrostu wpływają na patobiologię G. vaginalis.
Na koniec, rozważając, czy wykorzystać ten model, badacze powinni być świadomi, że może on wymagać większej liczby zwierząt w grupie niż typowe modele myszy UTI. Dzieje się tak częściowo dlatego, że indukcja rUTI wymaga, aby myszy ustąpiły bakteriurii UPEC spowodowanej początkową infekcją pęcherza. W związku z tym każda mysz, która nie usunie bakteriurii (fenotyp zwykle wskazujący na trwającą infekcję nerek), nie jest uwzględniana w fazie rUTI protokołu. Na liczbę myszy potrzebnych do zasilania tych badań wpływa również szybkość "spontanicznego" pojawiania się UPEC w moczu (średnio 12-14%). Wreszcie, różne szczepy myszy mają różne skłonności do rozwoju przewlekłej bakteriurii w porównaniu z tworzeniem rezerwuarów wewnątrzkomórkowych42,43. W przypadku stosowania w tym modelu szczepów myszy innych niż C57BL/6 należy potwierdzić, że zwierzęta rozwijają spoczynkowe zbiorniki wewnątrzkomórkowe UPEC.

<table><tbody><tr><td>Igły 30G x 1/2</td><td>BD</td><td>305106</td><td>do cewników</td></tr><tr><td>5 1/2 "prosty kleszcz hemostat</td><td>McKesson</td><td>487377</td><td>in situ mocowanie pęcherza</td></tr><tr><td>ACE 600 Napylarka</td><td>Leica</td><td></td><td>SEM Przetwarzanie próbek</td></tr> aluminium <tr><td>SEM Ted</td><td>Pella</td><td>16111</td><td>Przetwarzanie próbek SEM</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>In situ Mocowanie pęcherza</td></tr><tr><td>Przewodzący klej węglowy Tab&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td>Przetwarzanie próbek SEM</td></tr><tr><td>Przewodząca srebrna</td><td>farba Ted Pella</td><td>16034</td><td>Przetwarzanie próbek SEM</td></tr><tr><td>CPD 300 Suszarka do punktów krytycznych</td><td>Przetwarzanie próbek Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEM Metalowy klips cytolejkowy</td><td>Simport</td><td>M964B</td><td>cytospunowa analiza moczu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMS</td><td>15050</td><td>Przetwarzanie próbek SEM</td></tr><tr><td>Glukoza& nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>dla NYCIII G. vaginalis podłoże wzrostowe</td></tr><tr><td>aldehyd glutarowy</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>in situ mocowanie pęcherza</td></tr> moczowego <tr><td>Zestaw do barwienia Hema 3</td><td>Fisher</td><td>23123869</td><td>cytospun analiza moczu</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>25-060-Cl</td><td>dla NYCIII G. vaginalis podłoże wzrostowe</td></tr><tr><td>iryd</td><td>Ted Pella</td><td>91120</td><td>SEM przetwarzanie próbek</td></tr><tr><td>izofluoran</td><td></td><td></td><td>znieczulenie myszy</td></tr><tr><td>kanamycyna</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>dodać do płytek selektywnych UPEC LB (50 ug / ml)</td></tr> <tr><td>Agar Luria-Bertani</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>płytki</td></tr> <tr><td>wzrostowe UPECRosół Luria-Bertani</td><td>Pożywka</td><td>wzrostowa BD</td><td>DF0446173</td> UPEC</tr><tr><td>Merlin FE-SEM</td><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczacz wody Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>SEM Przetwarzanie próbek</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>dla pożywki wzrostowej NYCIII G. vaginalis</td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus Vanox AHBT3</td><td>Olympus</td><td></td><td>cytospun analiza moczu</td></tr><tr><td>tetratlenek osmu</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>SEM przetwarzanie próbek</td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>in situ rurki polietylenowe do mocowania pęcherza</td></tr><tr><td></td><td>moczowego Intramedic</td><td>427401</td><td>do cewników</td></tr><tr><td>Proteose Peptone #3&nbsp;</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>DF-122-17-4</td><td>dla NYCIII G. pochwy podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Żyletka z podwójną krawędzią pokryta PTFE Pęcherze</td> tnące <td>EMS</td><td>72000</td><td>do SEM</td></tr><tr><td>Shandon Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300002</td><td>cytospun do analizy moczu</td></tr><tr><td>Filtr cytolejkowy Shandon</td><td>M965FWDV</td><td>cytospunowa analiza moczu</td><td>Shandon</td></tr><tr><td>Podwójny cytolejek</td><td>Simport</td><td>M964-1D</td><td>cytospunowa analiza moczu</td></tr><tr><td>Podwójne cytoszkiełka Shandon (powlekane)</td><td>Thermo Scientific</td><td>5991055</td><td>cytospunowa analiza moczu</td></tr><tr><td>trójwodny kakodylan sodu</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>in situ spektrofotometr do utrwalania pęcherza</td></tr><tr><td></td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td><td>mierzący bakteryjną streptomycynę OD600</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>dodać do G. vaginalis płytki selektywne NYCIII (1 mg/ml)</td></tr><tr><td>strzykawka z końcówką tuberkulinową</td><td></td><td>309659</td><td>do cewników</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>do podłoża wzrostowego NYCIII G. vaginalis</td></tr></tbody></table>

nawracające zakażenie dróg moczowych escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego gardnerella vaginalis u myszy

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Nawracające infekcje dróg moczowych (rUTI) wywołane przez uropatogenną Escherichia coli (UPEC) są powszechne i kosztowne. Poprzednie artykuły opisujące modele ZUM u samców i samic myszy zilustrowały procedury inokulacji bakteryjnej i liczenia w moczu i tkankach. Podczas początkowej infekcji pęcherza moczowego u myszy C57BL/6 UPEC tworzy utajone rezerwuary w komórkach nabłonka pęcherza moczowego, które utrzymują się po usunięciu bakteriurii UPEC. Model ten opiera się na tych badaniach w celu zbadania rUTI spowodowanego pojawieniem się UPEC w utajonych zbiornikach pęcherza moczowego. Bakteria układu moczowo-płciowego Gardnerella vaginalis jest używana jako wyzwalacz zakażenia układu moczowego w tym modelu, ponieważ jest często obecna w drogach moczowo-płciowych kobiet, zwłaszcza w kontekście dysbiozy pochwy, która jest związana z ZUM. Ponadto opisano metodę unieruchamiania pęcherza moczowego in situ, a następnie analizę tkanki pęcherza moczowego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), która może znaleźć zastosowanie w innych badaniach dotyczących pęcherza moczowego.

Po inokulacji miana UPEC są wykrywalne w moczu (Rysunek 2B). Brak wysiewu próbek moczu na podłoża selekcyjne zawierające kanamycynę prawdopodobnie doprowadzi do przerostu endogennej mikrobioty myszy kontaminującej mocz. Poziom bakteriurii UPEC będzie prawdopodobnie wysoki w dniu 1. i może wzrosnąć w ciągu pierwszego tygodnia, a następnie zmaleć w późniejszych punktach czasowych (Rysunek 2C). Około 65-80% myszy nie będzie wykazywać obecności UPEC w moczu do 28. dnia po inokulacji (dpi) (Rysunek 2C, zielone koło). Myszy te mogą być wykorzystane w kolejnych etapach modelu. Myszy, u których utrzymuje się bakteriuria (Rysunek 2C, czerwona elipsa), powinny zostać wyeliminowane z eksperymentu.
Dwie sekwencyjne ekspozycje na G. vaginalis podane w odstępie 12 h (Rysunek 3A) lub 1 tyg. (Rysunek 3B) prowadzą do wydostania się UPEC z rezerwuarów wewnątrzkomórkowych, co wywołuje nawracającą bakteriurię. Zarówno poziom bakteriurii UPEC (test Manna-Whitneya), jak i odsetek myszy wykazujących rUTI wywołane przez UPEC (dokładny test Fishera) są znacznie wyższe u myszy eksponowanych na G. vaginalis w porównaniu z grupą kontrolną PBS. Analiza cytologiczna moczu wykazała obecność PMN w moczu myszy eksponowanych na G. vaginalis, u których stwierdzono wydostanie się UPEC (Rysunek 3C). W modelu z dwiema ekspozycjami podanymi w odstępie 1 tyg., miana UPEC w tkance pęcherza są niższe u myszy eksponowanych na G. vaginalis w porównaniu do grupy PBS (Rysunek 3D), co prawdopodobnie wynika z wydostania się UPEC z rezerwuarów i następującego po tym oczyszczenia organizmu z bakterii.
Wizualizacja utrwalonej in situ tkanki pęcherza za pomocą SEM wykazuje duże powierzchowne komórki parasolowe urothelium wyściełające powierzchnię pęcherza u myszy kontrolnych eksponowanych wyłącznie na PBS (Rycina 4A). Eksfoliacja urothelium przejawia się utratą powierzchownych komórek parasolowych, odsłaniając mniejsze, podścielające je przejściowe komórki nabłonkowe u myszy eksponowanych na G. vaginalis (Rycina 4B). Wkrótce po inokulacji UPEC, podczas tworzenia się rezerwuarów wewnątrzkomórkowych, UPEC są widoczne na urothelium oraz w postaci filamentów wychodzących z eksfoliujących komórek (Rycina 4C).

<img alt="Analiza wzrostu bakterii: tworzenie kolonii na agarze, seria rozcieńczeń, oś czasu infekcji myszy, wykres danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Monitorowanie miana UPEC w moczu podczas Fazy 1 (tworzenie rezerwuaru). (A) Schemat wysiewu jednostek tworzących kolonie (CFU). (B) Reprezentatywne zdjęcie miana UPEC w moczu na podłożu LB+kanamycyna. Czarne okręgi wskazują kropki z próbkami moczu, które należy policzyć w celu obliczenia CFU/mL. (C) Przebieg czasowy bakteriurii UPEC u myszy C57BL/6. Każda linia reprezentuje pojedynczą mysz, śledząc miano UPEC w moczu w czasie. Linia przerywana wskazuje granicę wykrywalności (1000 CFU/mL). Czerwna elipsa wskazuje cztery myszy (z 20), u których nie ustąpiła bakteriuria UPEC, a zatem nie zostałyby one wykorzystane w modelu rUTI indukowanego przez G. vaginalis. Z kolei zielony okrąg wskazuje myszy, u których bakteriuria UPEC ustąpiła i które przeszły do kolejnych faz. (D) Tabela z danymi wykorzystanymi do sporządzenia wykresu w panelu C. Kolor żółty: wykrywalne CFU; kolor zielony: brak CFU. (E) Randomizacja myszy do grup ekspozycyjnych na podstawie punktu czasowego, w którym CFU UPEC nie były już wykrywane w moczu („Dzień ustąpienia”). Numery myszy w lewej kolumnie panelu D są tymi samymi numerami myszy podanymi w panelu E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ilościowe oznaczenie UPEC, analiza testem Manna-Whitneya; wykresy i obraz mikroskopowy; badanie infekcji pęcherza moczowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3. G. vaginalis wywołuje rUTI przez UPEC. Miana UPEC w moczu po dwóch sekwencyjnych ekspozycjach dróg moczowych na PBS (koła) lub G. vaginalis (Gvag; kwadraty) podanych w odstępie 12 h (A) lub 1 tyg. (B). Każdy symbol reprezentuje pojedynczą mysz. Wykreślono najwyższe wartości CFU/mL UPEC wykryte u każdej myszy między 1. a 3. dobą po drugiej ekspozycji. Myszy bez wykrywalnej bakteryurii zaznaczono na granicy wykrywalności (linia przerywana). (C) Analiza cytologiczna moczu wykazująca UPEC (groty strzałek) oraz komórki wielojądrzaste (PMN) (strzałki). Pasek skali = 20 μm. (D) Miana UPEC w tkankach pęcherza moczowego pobranych 3 dni po dwóch sekwencyjnych ekspozycjach dróg moczowych podanych w odstępie 1 tyg. Każdy symbol reprezentuje inną mysz, a wartości zerowe wykreślono na granicy wykrywalności (linia przerywana). Na wykresach A, B i D ramki odpowiadają pierwszemu i trzeciemu kwartalowi, zaznaczono medianę, a wąsy obejmują zakres od minimum do maksimum. Testy U Manna-Whitneya * P &lt; 0.05; ** P &lt; 0.01; **** P &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Skaningowa mikroskopia elektronowa struktur powierzchni pęcherza; analiza mikrograficzna wzorów komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Analiza SEM pęcherzy utrwalonych in situ. Pęcherze pobrano od myszy 3 h po dwóch ekspozycjach (w odstępie 12 h) na PBS (A) lub G. vaginalis (C). Linie przerywane ilustrują pojedynczą komórkę nabłonka moczowego, która jest mniejsza w pęcherzach eksponowanych na G. vaginalis, ponieważ duże komórki powierzchniowe uległy złuszczeniu, odsłaniając leżący pod nimi nabłonek przejściowy. (B) Pęcherz pobrany 6 h po początkowym zaszczepieniu UPEC, podczas Fazy 1 modelu, wykazujący złuszczanie urothelium i pozakomórkowe UPEC. (D) Przykład nierozpuszczalnych kropel tłuszczu obecnych na powierzchni pęcherza. Paski skali wynoszą 20 μm na głównych obrazach i 2 μm w powiększeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Nawracające infekcje dróg moczowych stanowią poważny problem zdrowotny. Ten protokół pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób krótkotrwałe narażenie na bakterie układu moczowo-płciowego powoduje uszkodzenie pęcherza moczowego i wywołuje nawracające ZUM E.Coli. Zaletą tego modelu jest to, że złuszczanie pęcherza moczowego i nawracające ZUM są wywoływane przez bakterię moczowo-płciową Gardnerella vaginalis, która często występuje obficie u kobiet, które doświadczają nawracających ZUM.Zacznij od cyklicznego przełączenia szczepu G.vaginalis z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do komory beztlenowej. Umieść bakterie na talerzu NYCIII bez antybiotyków. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza beztlenowo przez 24 godziny.W komorze beztlenowej zaszczepić pięć mililitrów beztlenowej pożywki NYCIII za pomocą jednomikrolitrowej pętli pełnej komórek z płytki NYCIII i inkubować kulturę statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach beztlenowych przez 18 godzin. Nie dodawaj antybiotyków do podłoża wzrostowego. Oznaczyć OD600 w kulturze za pomocą spektrofotometru.Następnie odwirować go w temperaturze 9 600 razy G przez jedną minutę i zassać pożywkę. Zawiesić osad bakteryjny w PBS do pożądanego stężenia i seryjnie rozcieńczyć i płytkować inokulum. Dodaj 10 mikrolitrów moczu do 90 mikrolitrów PBS w kasecie cytolejkowej z dołączonym filtrem.Umieść kasety w cytowirówce ze szkiełkiem i obracaj je z prędkością od 600 do 800 razy G przez sześć minut z dużym przyspieszeniem. Po wyjęciu szkiełek i pozostawieniu ich do wyschnięcia przez noc, zabarwić szkiełka zestawem do barwienia hematologicznego i przeanalizować je za pomocą mikroskopii świetlnej pod kątem obecności PMN i komórek nabłonka. Po założeniu strzykawki z końcówką tuberkulinową z utrwalaczem, przymocuj cewnik do końca, skosem skierowanym w stronę przeciwną do oznaczeń strzykawki.Odetnij nadmiar rurki w odległości od jednego do dwóch milimetrów od końca igły, uważając, aby nie odsłonić końcówki igły. Trzepotnąć strzykawką, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie nacisnąć tłok, aby usunąć powietrze. Następnie napełnij cewnik utrwalaczem nad probówką mikrowirówki Po znieczuleniu i poświęceniu myszy, po zabezpieczeniu nóg, otwórz obszar miednicy myszy za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić pęcherz.Ostrożnie odsuń na bok sąsiedni tłuszcz, ale pozostaw pęcherz na miejscu. Trzymać strzykawkę ręką dominującą, z igłą skierowaną w dół. Zanurz końcówkę cewnika w sterylnym smarze i umieść końcówkę cewnika w otworze cewki moczowej, przytrzymując cylinder strzykawki pod kątem 30 do 45 stopni nad ciałem myszy.Uciskaj w dół lekkim ruchem zgodnie z ruchem wskazówek zegara i delikatnie włóż cewnik do cewki moczowej Gdy końcówka cewnika wchodzi, odchyl strzykawkę w kierunku ogona myszy, kontynuując wsuwanie cewnika głębiej w cewkę moczową, aż cylinder strzykawki będzie równoległy do powierzchni roboczej. Cały trzon igły cewnika powinien wejść do myszy, umieszczając końcówkę cewnika w świetle pęcherza. Powoli dostarczaj od 50 do 80 mikrolitrów utrwalacza, powodując nadmuchiwanie pęcherza jak balon.Utrzymać cewnik na miejscu i lekko unieść strzykawkę, przechylając końcówkę do góry. Drugą ręką otwórz hemostat i wsuń jeden bolec pod igłę cewnika na skrzyżowaniu cewki moczowej. Częściowo zamknąć hemostat, aż zetknie się z igłą.Delikatnie wysunąć igłę cewnika z pęcherza moczowego, jednocześnie zaciskając i całkowicie blokując hemostat, aby zapobiec utracie utrwalacza. Chwyć hemostat tak, aby był równoległy do powierzchni roboczej z pęcherzem spoczywającym na górze. Podnieś delikatnie i ostrożnie przetnij pod hemostatem, aby usunąć pęcherz z nadal przyczepionym hemostatem.Umieścić pęcherz moczowy i dołączony hemostat w probówce Falcon zawierającej rozgrzany utrwalacz. Upewnij się, że pęcherz jest całkowicie zanurzony w płynie i nie jest dociśnięty do ścianek rurki. Aby zobrazować pęcherz moczowy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, przeciąć strzałkowo na pół czystą, dwustronną żyletką lub skalpelem i wykonać drugie cięcie styczne do hemostatu, aby uwolnić pęcherz.W ten sposób powstają dwie miseczki półpęcherza. Jeśli na zewnątrz pęcherza znajdują się jakiekolwiek pozostałe poduszeczki tłuszczowe, delikatnie je usuń. Przepłukać połówki pęcherza trzykrotnie w buforze kakodylanu sodu.Zabarwić tkankę 1% tetratlenkiem osmu w 0,15-molowym buforze kakodylowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Wykonaj ten krok z naczyniem barwiącym owiniętym folią, aby utrzymać ciemne otoczenie. Po zabarwieniu spłucz połówki pęcherza trzy razy w ultra czystej wodzie.Jeśli na powierzchni wody widoczny jest osmoidalny olej, należy go zassać lub odpiąć, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas etapów suszenia. Po odwodnieniu tkanki przetrzyj połówki pęcherza czystą, dwustronną maszynką do golenia, aby uzyskać łącznie cztery kawałki. Po zaszczepieniu miana UPEC są wykrywalne w moczu.Poziom bakteriurii UPEC jest wysoki w pierwszym dniu i może wzrosnąć w pierwszym tygodniu, a następnie spaść w późniejszych punktach czasowych. Około 65 do 80% myszy nie będzie miało wykrywalnego UPEC w moczu do 28 dni po inokulacji. Myszy te mogą być wykorzystywane w kolejnych krokach modelu.Myszy, które pozostają bakteriotyczne, powinny zostać wyeliminowane z eksperymentu. Dwie sekwencyjne ekspozycje na G. vaginalis, w odstępie 12 godzin lub jednego tygodnia, powodują pojawienie się UPEC z rezerwuarów wewnątrzkomórkowych, powodując nawracającą bakterimocz. Analiza cytologiczna moczu może być wykorzystana do wykrycia komórek wielojądrzastych w moczu myszy narażonych na działanie G.Vaginalis z widocznym pojawieniem się UPEC.W modelu z dwiema ekspozycjami podanymi w odstępie jednego tygodnia, miana UPEC w tkance pęcherza moczowego są niższe u myszy narażonych na G. vaginalis w porównaniu z PBS, prawdopodobnie z powodu pojawienia się UPEC z rezerwuarów i późniejszego klirensu. Wizualizacja in situ tkanki stałego pęcherza moczowego za pomocą SEM ujawnia duże, powierzchowne parasolowe komórki urotelialne wyściełające powierzchnię pęcherza moczowego u myszy kontrolnych narażonych tylko na PBS. Złuszczanie urotelialne objawia się utratą powierzchownych komórek parasolowych, odsłaniając mniejszy nabłonek przejściowy u myszy narażonych na G. vaginalis.Wcześnie po inokulacji UPEC, podczas tworzenia rezerwuarów wewnątrzkomórkowych, komórki bakteryjne są widoczne na nabłonku dróg moczowych i wydzielają się z komórek złuszczających. Opisane tutaj metody torują drogę do przyszłych badań mających na celu zbadanie wpływu dodatkowych szczepów Gardnerella lub innych gatunków układu moczowo-płciowego na rUTI E. coli.

recurrent-escherichia-coli-urinary-tract-infection-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie zostaną zaprezentowane metody transuretralnego indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy oraz sposoby ilościowego określania zakresu powstałych infekcji.

Transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy

Źródło: O'Brien, V. P., i in., Nawracająca infekcja dróg moczowych Escherichia coli wywołana ekspozycją pęcherza pochwowego Gardnerella u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje wykorzystanie skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji kolonizacji bakterii oraz interakcji gospodarz–patogen w nabłonku pęcherza moczowego modelu myszy przed zakażeniem.

Przygotowanie tkanek pęcherza myszy do wizualizacji infekcji bakteryjnej

Źródło: O'Brien, wiceprezes i inni. Nawracająca infekcja dróg moczowych Escherichia coli wywołana przez narażenie pęcherza pochwy Gardnerella u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film prezentuje przygotowanie szczepionki Gardnerella wagalis w celu ustanowienia mysiego modelu nawracającej infekcji dróg moczowych.

Przygotowanie Gardnerella wagalis inoculum do modelowania nawracających infekcji dróg moczowych u myszy

Źródło: Conover, M. S. i in., J. Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszym. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę montażu i wszczepienia cewnika transurethralnego u samicy myszy, po czym następuje szczepienie bakteryjne w celu wywołania zakażenia dróg moczowych związanych z cewnikami oraz badania interakcji gospodarza z patogenem wygenerowanym przez biofilm.

Zakażenie dróg moczowych związane z cewnikami w modelu mysim

Źródło: Conover, M. S. i in., Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje wykrywanie wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBC) w tkance pęcherza myszy zakażonej Escherichia coli ekspresującą β-galaktozydazę. Po utrwaleniu tkanek, permeabilizacji i barwieniu X-gal, IBC pojawiają się jako niebieskie punkty pod mikroskopem rozcinającym, co potwierdza inwazję bakterii podczas infekcji dróg moczowych.

Wizualizacja społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych w zakażonym pęcherzu myszy

W tym filmie opisujemy technikę dopęcherzowego podawania bakterii uropatogennych w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u myszy. Model ten może być wykorzystany do zrozumienia rozprzestrzeniania się uropatogennej infekcji bakteryjnej w obrębie układu moczowego oraz mechanizmów określających podatność na ZUM.

Generowanie modelu infekcji dróg moczowych: technika podawania bakterii uropatogennych u myszy w celu opracowania modelu infekcji dróg moczowych

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Cewnikowanie przezcewkowe i inokulacja bakteryjna w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u samców myszy

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Poznaj model myszy do badania nawracających zakażeń dróg moczowych wywołanych przez Escherichia coli i Gardnerella vaginalis. Metoda pozwala analizować mechanizmy reaktywacji bakterii z rezerwuarów w pęcherzu.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Przeglądaj więcej filmów