Name: Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę przygotowania ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa dorosłych myszy do zapisów elektrofizjologicznych i rekonstrukcji neuronów. Protokół zapewnia lepszą żywotność komórek w porównaniu do wycinków czołowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Kerstin Kronenbitter i Didierowi Gremelle'owi za pomoc techniczną. Dziękujemy Umberto Morelliemu za pomoc w tworzeniu oprogramowania graficznego oraz Mathiasowi Hoppe za filmowanie i montaż wideo. Prace w naszym laboratorium były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Project-ID 434434223) i GRK2154, grant Rady ds. Badań Medycznych G1100546/2 oraz Uniwersytet w Kilonii.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt doświadczalnych były zgodne z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt i zatwierdzone przez komisję etyki uniwersytetu w Kilonii. Myszy Parvalbumin-Cre (Pvalb-IRES-Cre) 23 (Jackson laboratories, numer repozytorium 008069) utrzymywano jako heterozygotyczne kolonie lub krzyżowano z myszami reporterowymi Ai9 Cre24 (Jackson laboratories, numer repozytorium 007909). Użyto samic i samców myszy między P40-P90. Myszy utrzymywano w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w standardowych warunkach grupowych i dostarczano im jedzenie i wodę ad libitum.
1. Przygotowanie roztworów
UWAGA: Przygotuj świeże roztwory na każdy dzień eksperymentalny używając wody ultraczystej (UPW) (rezystywność w temperaturze 25 °C 18,2 MΩcm). Roztwory mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C maksymalnie przez jeden dzień. Roztwory magnezu i wapnia mogą być przechowywane oddzielnie jako 1 M roztwory podstawowe. Wszystkie roztwory robocze muszą być nasycone karbogenem (95% O2:5% CO2 ) w celu optymalnego natlenienia i utrzymania pH przed i w trakcie użytkowania.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór tnący (500 ml na mysz) (w mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 5 Na-askorbinian, 4 Na-pirogronian, 0,5 CaCl2·2H2O i 10 MgSO4·7H2O. Miareczkować do pH 7,4 pod kapturem chemicznym za pomocą 4-5 ml 16% kwasu solnego przed dodaniem kationów dwuwartościowych. Pozwoli to uniknąć wytrącania się MgSO4, 
	UWAGA: KCl i NaH2PO4 mogą być przechowywane jako 10x roztwory w temperaturze 4°C. Wykonujemy dwie indywidualne partie roztworu do cięcia. Jeden dzień przed nagraniem (przechowywany w zamrażarce przez noc w celu wytworzenia kruszonego lodu) i jeden w dniu nagrania.</li>
	<li>Przygotować roztwór do przechowywania (250 ml na mysz) (w mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 5 Na-askorbinian, 4 Na-pirogronian, 2 CaCl2·2H2O i 2 MgSO4·7H2O. Miareczkować do pH 7,3-7,4 za pomocą 1 N NaOH. 
	UWAGA: NaCl, KCl i NaH2PO4 mogą być przechowywane w postaci 10x roztworu w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować ACSF do zapisu (w mM): 122 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukozy, 2 CaCl2·2H2O i 2 MgSO4·7H2O, 2 Na-askorbinian, 4 Na-pirogronian. Miareczkować pH do 7,3-7,4 za pomocą 1 N NaOH. 
	UWAGA: NaCl, KCl i NaH2PO4 można łączyć w 10-krotnym roztworze podstawowym w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ławki do krojenia
<ol>
	<li>Przygotować na lodzie zlewkę (150 ml) i dwie szklane szalki Petriego (o średnicy 10 cm) i napełnić je świeżym roztworem do krojenia. Utrzymuj roztwór natleniony za pomocą urządzenia do bulgotania karbogenu (perforowana rurka lub kamień napowietrzający podłączony do systemu karbogenicznego). 
	UWAGA: Roztwór w zlewce zostanie użyty do perfuzji, podczas gdy szalki Petriego zostaną użyte podczas procedury cięcia.</li>
	<li>Wyposaż stół operacyjny w ostrze ze stali nierdzewnej, pęsetę z zaokrągloną końcówką, pęsetę z cienką końcówką, duże nożyczki, małe nożyczki, dużą metalową szpatułkę, cienką metalową szpatułkę, pędzel, płytkę wibratomu i klej cyjanoakrylowy lub mniej toksyczny klej cyjanoakrylowy n-butyloestrowy. Zanurz ostrze ze stali nierdzewnej i kawałek bibuły filtracyjnej w jednej ze szklanych szalek Petriego na lodzie. Ten Petri zostanie użyty do przecięcia mózgu. Narysuj trzy równoległe linie na spodzie plastikowej szalki Petriego i umieść tę szalkę blisko narzędzi chirurgicznych.</li>
	<li>Przygotuj zestaw do perfuzji przezsercowej zgodnie z opublikowanymi protokołami25.</li>
	<li>Przygotuj wibratom, montując nowe ostrze na uchwycie ostrza i ustaw parametry cięcia (kąt ostrza od płaszczyzny poziomej 17°, amplituda oscylacji ostrza 1,5 mm, prędkość ruchu ostrza do przodu około 2 mm min-1, częstotliwość oscylacji 90 Hz, grubość przekroju 350 μm). Napełnij tackę wibratomu lodowatym roztworem do cięcia i utrzymuj ją pod stałym natlenieniem. 
	UWAGA: Dodajemy kruszony lód wykonany z pierwszej partii roztworu do cięcia do schłodzonego świeżego roztworu do cięcia, aby utrzymać niską temperaturę. Zwróć uwagę, aby podczas krojenia nie dopuścić do lodu z ostrza.</li>
	<li>Przygotować komorę inkubacyjną wypełnioną roztworem tnącym pod stałym natlenieniem. Umieścić komorę w podgrzanej łaźni wodnej (35 °C). 
	UWAGA: Przykład komory inkubacyjnej można znaleźć w Edwards and Konnerth (1992)26.</li>
	<li>Przygotuj komorę do przechowywania plastrów wypełnioną roztworem do przechowywania i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej i pod stałym natlenieniem. W przypadku, gdy w tkance występuje ekspresja białka fluorescencyjnego lub aktywowanej światłem opsyny, zaleca się trzymanie komory w ciemności, na przykład w pudełku. 
	UWAGA: komora magazynowa z wieloma niezależnymi studzienkami jest przydatna do rozróżnienia poziomu plastrów wzdłuż grzbietowo-brzusznej osi hipokampa. Można zbudować komorę na zamówienie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Weź kawałek siatki dystansowej fiolki z pudełka do przechowywania fiolek kriogenicznych 81x i przyklej spód do nylonowej siatki. Włóż górną jedną trzecią plastikowej końcówki pipety o pojemności 5 ml do środka tej siatki, tak aby wystawała na około 3 cm u dołu. Ta plastikowa końcówka służy jako podstawka siatki, a później utrzymuje rurę przewodzącą powietrze w celu natlenienia. Włóż siatkę wraz ze stojakiem do cylindrycznego plastikowego pudełka (np. opakowania filtrów strzykawkowych), aby nie mogła się przechylać ani chwiać. Zbiornik ten pomieści 250 ml roztworu do przechowywania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie plastrów hipokampa
<ol>
	<li>Znieczulij mysz w komorze pudełkowej za pomocą izofluranu (około 0,5 ml) pod maską. Pozostaw mysz w odpoczynku, aż oddech będzie powolny i regularny (około 2-3 minut). Przetestuj brak reakcji bólowych przy szczypnięciu palca u nogi.</li>
	<li>Przeprowadź perfuzję przezsercową przy użyciu 25 ml gazowanego roztworu tnącego ze zlewki na lodzie zgodnie z opublikowanymi protokołami25,27. Ten krok jest zalecany, aby szybko schłodzić mózg i szybko spowolnić metabolizm neuronów.</li>
	<li>Odetnij głowę zwierzęcia za pomocą dużych nożyczek i umieść głowę na schłodzonej szalce Petriego na lodzie zawierającym roztwór do cięcia.</li>
	<li>Otwórz skórę cienkimi nożyczkami, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj małe boczne nacięcia u podstawy czaszki po obu stronach otworu wielkiego. Następnie przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od otworu wielkiego, aż do szwu nosowo-czołowego nad opuszką węchową. Podciągnij nożyczki podczas cięcia strzałkowego, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki mózgowej. 
	UWAGA: Trzymanie głowicy zanurzonej w roztworze tnącym pomaga oczyścić ją z krwi i utrzymuje niską temperaturę.</li>
	<li>Użyj pęsety z zaokrągloną końcówką, aby podciągnąć kości ciemieniowe, aby odsłonić mózg. Zwróć uwagę, aby złapać i usunąć opony mózgowe. Pozostawione mogą uszkodzić mózg podczas ekstrakcji.</li>
	<li>Użyj małej szpatułki, aby delikatnie zgarnąć mózg na drugą szalkę Petriego.</li>
	<li>Przetnij mózg na pół wzdłuż podłużnej szczeliny za pomocą wstępnie schłodzonego ostrza.</li>
	<li>Użyj dużej szpatułki, aby podnieść jedną półkulę z roztworu tnącego na plastikową szalkę Petriego. Gdy półkula leży na jej przyśrodkowej powierzchni, wyrównaj korę ciemieniową z jedną z równoległych linii, aby mieć odniesienie do drugiego cięcia, jak pokazano na Rysunek 1B.</li>
	<li>Wykonaj drugie cięcie w brzusznej części półkuli, ustawiając ostrze równolegle do linii, aby uzyskać powierzchnię, która jest później używana do przyklejenia mózgu do uchwytu próbki (patrz następny krok), jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. Włóż półkulę z powrotem do natlenionego roztworu tnącego szklanej szalki Petriego i wykonaj tę samą procedurę na drugiej półkuli.</li>
	<li>Przyklej półkule świeżo przyciętą stroną brzuszną do uchwytu na wibratom-próbkę za pomocą kleju. Nałóż kilka kropel roztworu tnącego na półkule, aby zestalić klej i przenieś uchwyt próbki do tacki z wibratomem. W ten sposób krojenie będzie przebiegać od grzbietu do brzusznego hipokampa.</li>
	<li>Usuń początkowy jeden lub dwa niepoprzeczne plasterki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C,ii-iii), aż obszar zainteresowania stanie się widoczny, a następnie zacznij zbierać plasterki. 
	UWAGA: Niepoprzeczne, ale użyteczne, zdrowe plastry można uzyskać z grzbietowego hipokampa na początku procedury krojenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C,ii-iii). Zebranie każdej kromki zajmuje około 3-4 minut. Rozpoczynając cięcie od grzbietu, a nie brzusznego hipokampa, oszczędzamy około 10 minut, co poprawia żywotność plastrów grzbietowych.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety (odciąć wąski koniec końcówki) przenieść każdą kromkę do komory inkubacyjnej (zawierającej roztwór tnący o temperaturze 35 °C) i odstawić na 12 minut. Krótki okres rekonwalescencji w ciepłym roztworze do cięcia znacznie zmniejsza początkowy obrzęk neuronów, jak opisano w Ting et al. (2014)28. Następnie za pomocą pędzla przenieś plasterek do komory magazynowej (zawierającej roztwór do przechowywania w temperaturze pokojowej) i pozwól mu odpocząć do rozpoczęcia eksperymentu.</li>
</ol>
4. Zapis całych komórek i wypełnienie biocytyną
UWAGA: Opis zapisu krosówki na całej komórce jest tutaj zredukowany tylko do kluczowych kroków, które pomagają uzyskać dobre wypełnienie biocytyną i mają ogólne zastosowanie do neuronów w ACSF. Szczegółowe informacje na temat procedur zapisów elektrofizjologicznych można znaleźć w kilku innych protokołach29,30.
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni roztwór wewnątrzkomórkowy zgodnie z parametrami, które mają być rejestrowane. Na przykład do pomiarów cęgowych prądu można użyć roztworu na bazie glukonianu potasu (w mM): 135 K-glukonian, 3 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 10 fosfokreatyno-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na2-GTP. Doprowadzić pH do 7,3 za pomocą 1 M KOH. Osmolalność powinna wynosić około 285-290 mOsmol/kg po dodaniu 3-5 mg/ml biocytyny. 
	UWAGA: Aby monitorować kształt neuronu podczas zapisu, do roztworu wewnątrzkomórkowego można dodać 0,3-0,5 μL/ml 1 mM Alexa Fluor Hydrazide. W tym przypadku należy pamiętać o objawieniu biocytyny, aby dopasować kolor barwnika Alexa do sondy fluorescencyjnej sprzężonej ze streptawidyną.</li>
	<li>Przygotować elektrody krosowe o średnicy końcówki ≤1 μm i rezystancji 3-5 MΩ z grubościennych kapilar borokrzemianowych.</li>
	<li>Uruchom system perfuzyjny zestawu patch-clamp z prędkością 2,5-3 ml/min w temperaturze pokojowej lub 35-37 °C i zabezpiecz plaster w komorze za pomocą kotwy w kształcie litery U.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania i wybierz zdrowy neuron z somą co najmniej 30-50 μm poniżej powierzchni wycinka. 
	UWAGA: Soma zdrowego neuronu ma gładką powierzchnię, a granice błony są lekko skontrastowane. Soma niezdrowego neuronu wydaje się skurczona i silnie skontrastowana lub spuchnięta i półprzezroczysta.</li>
	<li>Załadować szklaną pipetę roztworem wewnątrzkomórkowym, aż końcówka elektrody AgCl zostanie zakryta. Przenieś pipetę do roztworu komory rejestrującej, wywierając lekkie nadciśnienie, aby końcówka szklanej elektrody była wolna. 
	UWAGA: Jeśli roztwór zawiera barwnik Alexa, ciśnienie można kontrolować, wizualnie dostosowując ilość roztworu fluorescencyjnego uwalnianego z końcówki. Minimalne ciśnienie pozwoliłoby uniknąć zabarwienia tkanki wokół komórki.</li>
	<li>Podejdź do komórki pod kątem ukośnym i nawiąż kontakt w pierwszej jednej trzeciej powierzchni somy podczas formowania giga-seal. Zwolnij ciśnienie, powoli przesuń potencjał utrzymywania do -65 mV i zastosuj delikatne ssanie ustami, aby ułatwić tworzenie giga-uszczelnienia.</li>
	<li>Aby ustalić konfigurację całej komórki, zastosuj silne i krótkie ssanie, aby przerwać membranę. Odrzuć zapis, jeśli neuron ma potencjał błonowy bardziej zdepolaryzowany niż -50 mV, jeśli prąd podtrzymujący wzrasta powyżej 100 pA lub jeśli rezystancja dostępu wzrasta powyżej 30 MΩ.</li>
	<li>Po nagraniu (dla wystarczającego napełnienia somatów i dendrytów zaleca się co najmniej 15 minut; w przypadku wypełnienia złożonych aksonów może być wymagane do jednej godziny31) ostrożnie wyjmij elektrodę. W tym celu należy ustawić potencjał utrzymywania na 0 mV i spróbować ponownie utworzyć giga-uszczelnienie, powoli cofając pipetę w kierunku przeciwnym do podejścia, na przykład w celu uzyskania konfiguracji łaty na zewnątrz. 
	UWAGA: Obecność barwnika Alexa w roztworach wewnątrzkomórkowych pomaga w wizualnie sterowanym usuwaniu pipety z powierzchni neuronu. Jeśli jądro komórki nie styka się z końcówką pipety, szybką metodą naprawy uszczelnienia jest wyciągnięcie pipety z tkanki po przekątnej i w górę z dużą prędkością. Jeśli jądro lub część błony znajduje się w końcówce, istnieje niebezpieczeństwo pęknięcia błony plazmatycznej. W takim przypadku pomocne może być lekkie zastosowanie nadciśnienia i ruch boczny.</li>
	<li>Zwróć uwagę na położenie komórki i orientację wycinka. Po utrwaleniu dokładną orientację plastra i integralność wypełnionej komórki można sprawdzić pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne, akwizycja obrazu i rekonstrukcja morfologiczna
<ol>
	<li>Po zarejestrowaniu przenieś plastry na 24-dołkową płytkę, aby utrwalić ją w paraformaldehydzie (PFA) 4% w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, w zależności od czułości zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych. Plastry można przechowywać w 0,1 mln PBS i 0,02% NaN3, 
	UWAGA: PFA jest toksyczny. Stosować pod maską.</li>
	<li>Wykonaj barwienie immunologiczne i ujawnienie biocytyny w ciągu jednego tygodnia od nagrania zgodnie z ustalonymi protokołami32,33. 
	UWAGA: Stosujemy procedurę, która pozwala uniknąć ponownego cięcia wycinka, aby zachować integralność procesów dendrytycznych i aksonalnych. Jednak ta procedura wymaga dłuższego czasu inkubacji, ponieważ przeciwciała muszą wniknąć do tkanki. Sugerujemy zbadanie czasu optymalnego przenikania przeciwciał do tkanki przed wykonaniem eksperymentu.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego z funkcją Z-stack i skanowania płytek.</li>
	<li>Wykonaj rekonstrukcję morfologiczną za pomocą Fiji imageJ34. 
	UWAGA: Do programu można zaimportować kilka formatów plików graficznych za pomocą wtyczki Bio-format. Zalecamy użycie wtyczki Simple Neurite Tracer (STN)35 do rekonstrukcji dendrytów i aksonu. Prosty i przejrzysty samouczek jest dostępny na https://imagej.net/SNT i http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/. Plik zawierający dane śledzące (.traces), jeśli zostanie zapisany w postaci nieskompresowanej, może zostać przekształcony w plik tekstowy i otwarty za pomocą Matlaba lub innego oprogramowania do przetwarzania danych tekstowych.</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, D. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+the+hippocampal+formation%3A+a+review+of+anatomical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data.</a> Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).</li>
<li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures.</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li>
<li>David, A., Pierre, L. Hippocampal Neuroanatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavid%2C+A+%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. , 37-114 (2006).</li>
<li>Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic-anatomic+evidence+for+distinct+functional+domains+in+hippocampal+field+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).</li>
<li>Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+representations+and+theta+dynamics+in+dorsal+and+ventral+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).</li>
<li>Lisman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewpoints%3A+how+the+hippocampus+contributes+to+memory%2C+navigation+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition.</a> Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).</li>
<li>Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiny+and+Non-spiny+Parvalbumin-Positive+Hippocampal+Interneurons+Show+Different+Plastic+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties.</a> Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).</li>
<li>Cembrowski, M. S., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+within+classical+cell+types+is+the+rule%3A+lessons+from+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).</li>
<li>Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+learning+with+a+minislab+in+the+dorsal+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).</li>
<li>Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+function+between+the+dorsal+and+the+ventral+hippocampus+in+spatial+learning+abilities+of+the+rat%3A+a+within-subject%2C+within-task+comparison+of+reference+and+working+spatial+memory%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory.</a> European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).</li>
<li>Fredes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventro-dorsal+Hippocampal+Pathway+Gates+Novelty-Induced+Contextual+Memory+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation.</a> Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).</li>
<li>Schwartzkroin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+CA1+neurons+recorded+intracellularly+in+the+hippocampal+in+vitro+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation.</a> Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).</li>
<li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+facilitation+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">Long-lasting facilitation of synaptic transmission.</a> Ciba Foundation Symposium. (58), 87-108 (1977).</li>
<li>Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+dentate+gyrus+granule+cells%3A+comparison+of+sharp+microelectrode+and+whole-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings.</a> Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).</li>
<li>Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+in+combined+slices+of+the+hippocampus%2C+subiculum+and+entorhinal+cortex+during+perfusion+with+low+magnesium+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium.</a> Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).</li>
<li>Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+propagation+of+epileptiform+discharges+in+a+combined+entorhinal+cortex%2Fhippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).</li>
<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).</li>
<li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+Synaptic+Plasticity+in+Acute+Hippocampal+Slices+Maintained+in+a+Small-volume+Recycling-%2C+Perfusion-%2C+and+Submersion-type+Chamber+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e55936(2018).</li>
<li>Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+excitability+of+CA1+pyramidal+neurones+from+the+rat+dorsal+and+ventral+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus.</a> Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).</li>
<li>Tidball, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ability+of+the+dorsal+and+ventral+rat+hippocampus+to+exhibit+group+I+metabotropic+glutamate+receptor-dependent+synaptic+and+intrinsic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Neuroscience+Advances%22%5BJournal%5D)">Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity.</a> Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Djurisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+Hypoxia+in+Hippocampal+Slices+from+Adult+and+Aging+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61377(2020).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals%3A+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Patch-Clamp+Methods+and+Protocols%2C+2nd+Edition%22%5BJournal%5D)">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).</li>
<li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51706(2014).</li>
<li>Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+nonuniform+cable+properties+optimize+rapid+and+efficient+activation+of+fast-spiking+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).</li>
<li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Biocytin-filled+and+Processed+Sections+for+Neurochemical+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54880(2016).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Neurite+Tracer%3A+open+source+software+for+reconstruction%2C+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li>
<li>Murray, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).</li>
<li>Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perpetual+inhibitory+activity+in+mammalian+brain+slices+generated+by+spontaneous+GABA+release%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release.</a> Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).</li>
<li>Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+in+vitro+slice+approaches+for+the+study+of+neuronal+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromethods%22%5BJournal%5D)">An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry.</a> Neuromethods. 67, 103-125 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hipokamp grzbietowy był szeroko badany pod kątem jego roli w uczeniu się przestrzennym i nawigacji, głównie poprzez eksperymenty behawioralne, śledzenie anatomiczne i manipulacje specyficzne dla regionu. Aby połączyć badania elektrofizjologiczne z tymi technikami, opracowaliśmy protokół, który wykorzystuje podobny kąt przekroju, jak zmodyfikowane cięcie poziome dla pośrednio-brzusznego obszaru hipokampa, ale wykorzystuje odwróconą kolejność krojenia, aby uzyskać wczesne plasterki z obszaru grzbietowo-pośredniego. Takie podejście skraca czas potrzebny do pokrojenia i zebrania grzbietowego obszaru hipokampa, zwiększając w ten sposób żywotność plastrów.
Korzystając z tej metody, jesteśmy w stanie rutynowo pobrać około trzech wycinków na półkulę grzbietowego obszaru hipokampa między 1,4 mm a 2,4 mm od powierzchni pial, jak pokazano na rysunku 1C. Chociaż w tej procedurze nie jest możliwe uzyskanie przekrojów poprzecznych z samego bieguna przegrody hipokampa, możliwe jest zebranie około dwóch dodatkowych żywotnych niepoprzecznych plasterków na półkulę z bieguna przegrody (ryc. 1C ii, iii). Jeśli biegun przegrody hipokampa jest głównym przedmiotem badań, inne protokoły, które pozwalają na pobieranie przekrojów poprzecznych, zwłaszcza z samego bieguna przegrody hipokampa, mogą być lepiej dopasowane21,32. Eksperymenty behawioralne dotyczące nawigacji przestrzennej i uczenia się są korzystnie przeprowadzane na dojrzałych myszach z w pełni rozwiniętą łącznością neuronalną. W związku z tym zoptymalizowaliśmy naszą procedurę krojenia pod kątem aplikacji do mózgów dorosłych zwierząt (pokazanych tutaj dla trzymiesięcznych myszy), które są bardziej wrażliwe na stres niż odporny preparat młodociany. W tym celu połączyliśmy kilka strategii, które zmniejszają stres hipoksyjny, na który narażony jest mózg w czasie między ekstrakcją a umieszczeniem plastrów w natlenionym ACSF. Ochronnym roztworem tnącym jest ACSF 25,27,28 na bazie NMDG o niskiej zawartości Na+ i Ca2+, ale wysokiej Mg2 + w celu zmniejszenia uszkodzeń ekscytotoksycznych i obrzęku komórek w wyniku aktywacji receptorów NMDA. Ponadto HEPES zapewnia stabilne buforowanie, a związki takie jak askorbinian i pirogronian zmniejszają stres oksydacyjny. Perfuzja przezsercowa ze schłodzonym i natlenionym ochronnym roztworem tnącym wykorzystuje niezwykle gęstą sieć naczyń włosowatych zaopatrującą mózg w celu szybkiego i jednorodnego zmniejszenia zapotrzebowania metabolicznego i ekscytotoksyczności indukowanej glutaminianem w tkance mózgowej. Następnie prawie wszystkie etapy po dekapitacji są wykonywane w schłodzonych i natlenionych roztworach, aby ograniczyć metabolizm i deprywację tlenu do minimum podczas całej procedury. Istnieją inne strategie zmniejszania uszkodzeń mózgu podczas krojenia, które mogą być równie ważne38. Aby zademonstrować jakość naszego preparatu, porównujemy go z preparatem z plastrem koronalnym, który jest powszechnie stosowany do nagrywania z grzbietowego hipokampa. Mimo że wycinki koronalne mogą być używane do uzyskania dobrego zapisu patch-clamp w zakręcie zębatym, liczba niezdrowych i rozłączonych neuronów jest wyższa niż w przekroju poprzecznym. Ponadto integralność arboryzacji aksonalnej i dendrytycznej jest lepiej zachowana w przekroju poprzecznym. W rzeczywistości integralność aksonów komórek ziarnistych (ryc. 3A), które biegną prostopadle do osi podłużnej hipokampa, służy jako wskaźnik poprzecznej płaszczyzny krojenia1.
Do wypełnienia załatanych neuronów sugerujemy rezystancję elektrody od 3 do 5 MΩ. Średnica końcówki wynosząca około 1 μm pozwala na uzyskanie dobrej odporności na zgrzewanie podczas nagrywania i dobre ponowne uszczelnienie po wycofaniu elektrody. Najważniejszym szczegółem jest uniknięcie zasysania części somy lub jądra do pipety. Z tego powodu sugerujemy dodanie barwnika Alexa do roztworu wewnątrzkomórkowego, jeśli to możliwe. Barwnik umożliwia monitorowanie kształtu komórki podczas nagrywania i ponownego uszczelniania. Co więcej, pozwala ocenić integralność załatanej komórki po utrwaleniu, co może zaoszczędzić czas immunohistochemii w przypadku nieudanych wypełnień. Ze względu na to, że barwniki Alexa są hartowane z długim czasem utrwalania, sugerujemy krótkie utrwalanie, jeśli to możliwe.
Do późniejszego barwienia immunologicznego stosujemy protokół, który nie wymaga ponownego cięcia plastra. Sugerujemy wykonanie barwienia w ciągu tygodnia po utrwaleniu. Im dłużej plastry pozostają w lodówce, tym większa szansa na degradację tkanek. Jeśli nie można uniknąć długiego przechowywania, sugerujemy zwiększenie stężenia NaN3 w PBS do 0,05% i odświeżanie go co tydzień. Barwienie immunologiczne całego wycinka oznacza, że wydłuża się czas inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Zwykle, aby ujawnić biocytynę, wystarczy jedna nocna inkubacja w temperaturze 4 °C, ale w połączeniu z barwieniem innych białek cała procedura barwienia może trwać znacznie dłużej. Blokowanie przenikania i inkubacja przeciwciał muszą być optymalizowane indywidualnie. Zwykle w przypadku przeciwciała pierwszorzędowego wystarczą dwa dni, podczas gdy jeden dzień może wystarczyć w przypadku przeciwciała wtórnego. Zalecamy wydłużenie czasu trwania etapów mycia wraz z dłuższymi inkubacjami przeciwciał, aby uniknąć wzrostu tła.
W tym protokole przedstawiliśmy metodę krojenia w celu uzyskania poprzecznych lub prawie poprzecznych wycinków hipokampa, zachowując żywotność neuronów dorosłej tkanki oraz praktyczne podejście do odzyskania morfologii i tożsamości neurochemicznej załatanych neuronów. Metodę tę można łatwo wykonać, aby dopasować wyniki elektrofizjologiczne do badań anatomicznych i behawioralnych koncentrujących się na pośredniej grzbietowej części hipokampa.

Hipokamp był intensywnie badany pod kątem jego kluczowej roli w różnych aspektach uczenia się i pamięci, nawigacji przestrzennej oraz emocji. Podstawowy obwód hipokampa, powszechnie nazywany "obwodem trisynaptycznym", to sieć blaszkowata w osi poprzecznej, która jest w dużej mierze zachowana wzdłuż osi podłużnej1. Wkład hipokampa w różne zachowania poznawcze i emocjonalne prawdopodobnie wynika z różnorodnych połączeń, które ten podstawowy obwód tworzy wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej z kilkoma innymi obszarami mózgu2,3. Jednak poza łącznością aferentną i odprowadzającą, coraz więcej badań wskazuje na dalsze różnice wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej hipokampa. Różnice te dotyczą wewnętrznej architektury i łączności, a także różnic we wzorcach ekspresji genów i morfologii neuronów4,5,6,7,8.
Biorąc pod uwagę istnienie takich różnic w podstawowych obwodach, rozsądne jest wybranie konkretnego podobwodu hipokampa do zbadania zgodnie z pytaniami, które są poruszane. Jeśli na przykład pytanie dotyczy mechanizmów neuronalnych zaangażowanych w przetwarzanie przestrzenne, interesujący jest hipokamp grzbietowy, a nie brzuszny, chociaż oba nie działają niezależnie in vivo ze względu na podłużną łączność wewnątrz hipokampa9,10,11. W związku z tym należy wziąć pod uwagę nie tylko różnice wzdłuż osi podłużnej, ale także należy zachować ostrożność, aby jak najlepiej zachować obwody lokalne i dalekiego zasięgu. Dla zachowania ścieżek włókien i łączności niezbędny jest kąt, pod którym mózg zostanie przecięty.
Pierwsza metoda opisana w literaturze, która obejmowała obwód tryzynaptyczny, najpierw odizolowała hipokamp od mózgu, a następnie wykonała poprzeczne przekroje (prostopadłe do osi podłużnych) za pomocą rozdrabniacza tkanek12 i vibratome13. Późniejsi fizjolodzy woleli uzyskiwać wycinki z całego bloku mózgu, aby zachować również sąsiednie struktury mózgowe połączone z hipokampem. Dla tych preparatów blokowych opracowano różne kąty przekroju w odniesieniu do hipokampa, takie jak przygotowanie warstwy koronalnej14 lub poziome przygotowanie warstwy o nazwie HEC slice w celu zachowania połączeń kory hipokampowo-śródwęchowej15,16,17.
W ostatnim przygotowaniu płat ciemieniowy jest cięty pod kątem 0° lub 12° w stosunku do płaszczyzny poziomej wzdłuż osi rostro-ogonowej, tworząc podstawę bloku. Plastry są następnie zbierane, zaczynając od brzusznej powierzchni mózgu, co pozwala głównie na zbieranie pośrednich brzusznych obszarów hipokampa. Metoda ta stała się najpopularniejszym wyborem do badań fizjologicznych i może być niezawodnie wykonywana zgodnie z kilkoma opublikowanymi protokołami18,19,20.
Jednakże, jeśli zainteresowanie badawcze dotyczy konkretnych aspektów uczenia się przestrzennego, grzbietowy hipokamp może być bardziej odpowiednim regionem badań i przydatne byłoby znalezienie procedury krojenia o podobnej jakości dla tego obszaru hipokampa. Opracowano kilka protokołów, które koncentrują się na samym biegunie rostralnym, które mogą zaspokoić to zapotrzebowanie 21,22.
W tym protokole, zamiast tego, opisujemy podejście do uzyskania żywotnych przekrojów poprzecznych z grzbietowo-pośredniego hipokampa, które wykorzystuje kąt przekroju opisany wcześniej dla przygotowań poziomych18,19 (Rysunek 1A&B). Jakość tego protokołu pokazujemy porównując zapisy elektrofizjologiczne i rekonstrukcje morfologiczne w tym preparacie z tymi uzyskanymi w plastrach koronalnych. Protokół ten jest szczególnie odpowiedni do łączenia z eksperymentami anatomicznymi i behawioralnymi na dorosłych myszach (w naszym przypadku w wieku trzech miesięcy).

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 1 ml Omnifix-F</td><td>Braun melsungen AG</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>24 dołki</td><td>SARSTEDT</td><td>8,33,922</td><td></td></tr><tr><td>81x pudełko do przechowywania fiolek kriogennych</td><td>Komora magazynowa</td><td>Fisherscientific</td><td>15-350-107B</td></tr><tr><td>Alexa Barwnik hydrazydowy</td><td>Invitrogen</td><td>A10436</td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki</td><td>Narzędzie do nauki</td><td>precyzyjnej 14010-15</td><td>kleszczyki Graefe</td></tr><tr><td>Biocytyna</td><td>IRIS biotechnologia.</td><td>LS3510.0250</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td> Produkty <td>naukowe</td><td>GB150TF-10</td><td>komora magazynowa</td></tr><tr><td>Szczotka 5</td><td>Leonhardy</td><td>241</td><td>Mikro podwójna szpatułka, L 150 mm, szerokość ostrza 4 mm</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Pióro do mikrotomu ze stali węglowej</td><td></td><td>C35</td><td></td></tr><tr><td>Chloridric kwas</td><td>Roth</td><td>K025.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td>z Airyscan</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>UHU</td><td>509141</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy, ester n-butylowy VetBond</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi ImageJ</td><td>fiji.sc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna 113A</td><td>ROTILABO Roth</td><td>AP180.1</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta z cienką końcówką</td><td>Dumont</td><td>0245fo</td><td></td></tr><tr><td>Szklany becker (150 ml)</td><td>ROTILABO Roth</td><td>X690.1</td><td>komora inkubacyjna i preparacja</td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego (średnica 10 cm)</td><td>ROTILABO Roth</td><td>0690.1</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Roth</td><td>X997.2</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Podgrzewana kąpiel wodna</td><td>Grant Instruments Ltd</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td>baxter</td><td>5239.2</td> Duża szpatułka <td>anestezjologiczna</td></tr><tr><td></td><td>Roth</td><td>E286.1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Roth</td><td>8793.2</td><td>roztwór CSF&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>World instrumenty precyzyjne</td><td>MF34G</td><td></td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>566380</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw siatek nylonowych</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>komora inkubacyjna i komora magazynowa</td></tr><tr><td>Paraformaldeyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10X</td><td>Panbiotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatyna disodowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Komora</td><td>inkubacyjna</td><td>SARSTEDT</td><td>7,07,62,211</td></tr><tr><td>Plastikowe pudełko na filtry strzykawkowe</td><td>Komora magazynowa</td><td>SUPELCO</td><td>54135-U</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Roth</td><td>6781.3</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Glukonian potasu</td><td>Roth</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Probenbecker becker (100 ml)</td><td>Komora inkubacyjna</td> <td>ROTILABO</td><td>Roth HT85.1</td></tr><tr><td>Pęseta z zaokrągloną końcówką</td><td>Narzędzie do nauki precyzyjnej</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze ze stali nierdzewnej</td><td>Gillette</td><td>Vibratome</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Narzędzie do majonezu</td><td>14010-10</td><td>nożyczki majonezowe proste</td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Roth</td><td>3149.2</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Roth</td><td>6885.1</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Roth</td><td>K021.1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu monozasaddihydrat</td><td>Roth</td><td>K300.1</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Roth</td><td>8793.2</td><td>aCSF&nbsp; roztwór</td></tr><tr><td>Streptawidyna połączona Alexa 488</td><td>Invitogen</td><td>s11223</td><td></td></tr><tr><td>Cienka szpatułka</td><td>Roth</td><td>E286.1</td><td>Podwójna szpatułka, L 150 mm, szerokość ostrza 9 mm</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Sarstedt</td><td>861171</td><td></td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Roth</td><td>3051.1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Thermoscientific</td><td>Microm HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie filtrujące do wody ultraczystej</td><td>Merck-Millipore</td><td>Milli-Q IQ 7000</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Chociaż ogólna architektura hipokampa jest podobna wzdłuż jego osi podłużnej, ostatnie badania wykazały wyraźne różnice w kryteriach molekularnych, anatomicznych i funkcjonalnych, sugerując podział na różne podobwody wzdłuż jego rozciągłości rostro-ogonowej. Ze względu na zróżnicowaną łączność i funkcję najbardziej fundamentalne rozróżnienie występuje między hipokampem grzbietowym i brzusznym, które są preferencyjnie zaangażowane odpowiednio w przetwarzanie przestrzenne i emocjonalne. W związku z tym prace in vivo dotyczące tworzenia pamięci przestrzennej skupiły się na grzbietowym hipokampie.
Dla kontrastu, elektrofizjologiczne zapisy in vitro były preferencyjnie wykonywane na pośrednio-brzusznym hipokampie, głównie motywowane takimi czynnikami jak żywotność plasterków i integralność obwodu. Aby umożliwić bezpośrednią korelację danych in vivo dotyczących przetwarzania przestrzennego z danymi in vitro, dostosowaliśmy poprzednie metody sekcji, aby uzyskać wysoce żywotne poprzeczne wycinki mózgu z grzbietowo-pośredniego hipokampa do długoterminowych zapisów głównych komórek i interneuronów w zakręcie zębatym. Ponieważ zachowania przestrzenne są rutynowo analizowane u dorosłych myszy, połączyliśmy tę procedurę przekrojowego krojenia z zastosowaniem roztworów ochronnych w celu zwiększenia żywotności tkanki mózgowej dojrzałych zwierząt. Stosujemy to podejście dla myszy w wieku około 3 miesięcy. Metoda ta stanowi dobrą alternatywę dla preparatu koronalnego, który jest często stosowany w badaniach in vitro na grzbietowym hipokampie. Porównujemy te dwa preparaty pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

W niniejszym protokole opisujemy sposób przygotowania ostrych skrawków hipokampa z jego części grzbietowo-pośredniej (Rysunek 1A). Protokół ten jest szczególnie odpowiedni do eksperymentów badających mechanizmy zaangażowane w uczenie się przestrzenne i może być łączony z badaniami behawioralnymi, znakowaniem wirusowym lub strategiami manipulacji w grzbietowej części hipokampa35. Stosując opisaną tutaj procedurę sekcjonowania u zwierząt, którym do grzbietowego hipokampa myszy Pvalb-IRES-Cre wstrzyknięto zależny od Cre wirus adeno-stowarzyszony wykazujący ekspresję GFP (AAV-FLEX-GFP) w różnych współrzędnych Bregma AP-1.94 mm, ML ± 0.5-2 mm, głębokość-1.25-2.25 mm w celu ukierunkowania na różne obszary formacji hipokampa36, byliśmy w stanie uzyskać co najmniej trzy skrawki poprzeczne zawierające zainfekowane obszary (Rysunek 1A jasnozielone zabarwienie na modelu 3D hipokampa). Ponadto z bardziej rostralnych części grzbietowego hipokampa można uzyskać kilka skrawków niepoprzecznych, lecz zdrowych (Rysunek 1C).
Aby zademonstrować jakość i żywotność naszych skrawków, zarejestrowaliśmy podstawowe parametry elektrofizjologiczne i morfologiczne komórek ziarnistych oraz oznakowanych tdTomato interneuronów wykazujących ekspresję parwalbuminy (PV+) w zakręcie zębatym transgenicznych myszy Pvalb-IRES-Cre;Ai9 (w wieku od 7 do 12 tygodni), a następnie porównaliśmy je z pomiarami wykonanymi na skrawkach czołowych tego samego obszaru uzyskanych przy użyciu standardowego protokołu.
Podczas inspekcji wizualnej pod mikroskopem z podczerwienią i kontrastem różnicowym (IR-DIC) zauważyliśmy wyraźne różnice między przekrojem poprzecznym a czołowym. Podczas gdy neurony warstwy komórek głównych w przekrojach czołowych często wydawały się chropowate i wykazywały silnie kontrastujące obrysy, neurony w przekroju poprzecznym wykazywały głównie gładkie powierzchnie i tylko lekko kontrastujące brzegi, co świadczy o lepszej żywotności komórkowej (Rysunek 2A). Przyczyną tych różnic w żywotności komórek między przekrojami czołowymi a poprzecznymi może być orientacja płaszczyzny cięcia względem pęczków włókien. Ponieważ w przekrojach czołowych nie przebiegają one równolegle, aksony i dendryty zostają przecięte. Zgodnie z tym założeniem stwierdziliśmy, że w obrębie skrawków płaszczyzny powierzchniowe warstwy komórek ziarnistych i hilusa wykazywały większą nieciągłość w przekroju czołowym niż w poprzecznym (wielkość kroku w płaszczyznach powierzchniowych: 41,40 ± 3,28 µm vs 25,60 ± 2,94 µm, średnia ± SEM, nieparzysty test t P = 0,023), co sugeruje większy stopień rozłączenia tkanki w przekroju czołowym (Rysunek 2B). Oznacza to, że odpowiednie komórki do rejestracji metodą patch-clamp zostaną znalezione jedynie w głębszych płaszczyznach warstwy komórek ziarnistych w przypadku przekrojów czołowych, co z kolei może zmniejszyć wydajność rejestracji patch-clamp. Rzeczywiście, średni czas do utworzenia uszczelnienia (seal) w naszym przekroju poprzecznym był krótszy niż w przypadku przekrojów czołowych (komórki ziarniste: 12,64 ± 1,50 s, n=11 w przekroju czołowym vs. 8,40 ± 0,75 s, n=14 w przekrojach poprzecznych, średnia ± SEM, P = 0,0335 test Mann-Whitneya; interneurony PV+: 31,11 ± 2,60 s, n=9 w przekroju czołowym vs. 22,00 ± 2,18, n=7 w przekrojach poprzecznych, średnia ± SEM, P = 0,0283 test Mann-Whitneya) (Rysunek 2C). Jako wskaźnik integralności i stanu zdrowia komórek zarejestrowaliśmy następnie spoczynkowe potencjały błonowe (RMP) komórek ziarnistych i interneuronów PV+, które były znacznie bardziej zdepolaryzowane zarówno w komórkach ziarnistych, jak i interneuronach PV+ w przekrojach czołowych w porównaniu z poprzecznymi (komórki ziarniste: -62,55 ± 3,54 mV, n=11 w przekroju czołowym vs. -71,06 ± 2,31 mV, n=14 w przekrojach poprzecznych, średnia ± SEM, P = 0,0455 test Mann-Whitneya; interneurony PV+: -52,75 ± 1,66 mV, n=7 w przekroju czołowym vs. -59,36 ± 2,25 mV, n=6 w przekrojach poprzecznych, średnia ± SEM, P = 0,0271 test Mann-Whitneya) (Rysunek 2D). Dane te sugerują większą liczbę zdrowych neuronów w preparacie przekroju poprzecznego w porównaniu z czołowym. Rzeczywiście, wprowadzenie wartości odcięcia dla akceptowalnego RMP (-55 mV dla komórek ziarnistych; -45 mV dla interneuronów PV+) skutkowało wyższym odsetkiem wykluczonych komórek w przekrojach czołowych niż w poprzecznych (39,67 ± 8,37 %, n=3 sesji eksperymentalnych vs. 23,00 ± 3,85 %, n=4 sesji eksperymentalnych) (Rysunek 2E). Co więcej, rekonstrukcja morfologii neuronalnej zarejestrowanych komórek ziarnistych wykazała, że zgodnie z oczekiwaniami szanse na uzyskanie kompletnego rozgałęzienia aksonalnego komórek ziarnistych były znacznie większe w przekroju poprzecznym (Rysunek 3A,B). Dodatkowo, rekonstrukcja morfologiczna interneuronów PV+ w przekrojach poprzecznych pozwoliła na przedstawienie rozległych rozgałęzień aksonalnych i dendrytycznych, w tym wizualizację drobnych szczegółów, takich jak kolce dendrytyczne35(Rysunek 3C).
<img alt="Metoda wycinania hipokampa: schematy, przygotowanie skrawków mózgu, proces przycinania, narzędzia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja procedury cięcia w celu uzyskania skrawków z grzbietowo-pośredniej części hipokampa. (A) Trójwymiarowa reprezentacja formacji hipokampa pokazująca jej orientację przestrzenną w mózgu (zmodyfikowano na podstawie Brain Explorer, Allen Institute)37. Wskazano podziały grzbietowy, pośredni i brzuszny hipokampa (dHPC, iHPC, vHPC) zgodnie z Dong et al. (2009)7. Część grzbietowo-pośrednia hipokampa, która zostanie pocięta, jest zaznaczona na jasny zielony kolor. Wstawka po prawej stronie pokazuje orientację osi odniesienia. (B) Schemat półkuli mózgu przedstawiający wyrównanie kory ciemieniowej z liniami równoległymi na szalce Petriego. Czerwona przerywana linia wskazuje miejsce wykonania cięcia przycinającego (punkt 3.9 w protokole) w celu utworzenia powierzchni do przyklejenia półkuli do uchwytu na preparat. Czarne przerywane linie wskazują miejsca zbierania skrawków. (C) Seria obrazów w polu jasnym przedstawiająca skrawki hipokampa uzyskane zgodnie z tą procedurą. Od powierzchni opon miękkich, od grzbietowej do brzusznej: (i) 0.70 mm, (ii) 1.05 mm, (iii) 1.40 mm, (iv) 1.75 mm, (v) 2.10 mm, (vi) 2.45 mm (vii) 2.80 mm, (viii) 3.15 mm. Pasek skali = 1 mm. (D) Zdjęcie komory do przechowywania i materiałów potrzebnych do jej montażu. 1. Kratka dystansowa do probówek z pudełka do przechowywania probówek kriogenicznych 81x, 2. Cylindryczne plastikowe pudełko, 3. Nylonowa siatka, 4. Końcówka do pipety. Wstawka. Widok boczny kratki i uchwytu do probówek do włożenia do cylindrycznego pudełka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia skrawków mózgu; wykres porównawczy wielkości stopnia; analiza czasu uszczelnienia, RMP i odrzuconych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przekrój poprzeczny wykazuje zwiększoną żywotność skrawka w porównaniu do przekroju czołowego. (A) Mikrografie DIC-IR pokazujące zdrowe (czarne strzałki) i niezdrowe (białe strzałki) przykłady somat neuronów w przekrojach poprzecznych i czołowych. Hil=hilus, gcl=warstwa komórek ziarnistych, ml= warstwa molekularna. Pasek skali = 50 µm. (B) Obie procedury sekcjonowania powodują powstanie stopnia między powierzchnią warstwy komórek ziarnistych a hilusem (wskazane grotami strzałek). Wysokość stopnia wskazuje na zakres rozłączenia tkanki i jest znacznie niższa w przekrojach poprzecznych niż w czołowych (n=5 skrawków poprzecznych i n=5 skrawków czołowych, Mean±SEM, P=0.0238 test Mann-Whitneya). (C) Czas formowania się uszczelnienia gigaohmowego w komórkach ziarnistych (n=14 komórek w przekroju poprzecznym, n=11 komórek w przekroju czołowym; Mean±SEM, P= 0.0355, test Mann-Whitneya) oraz w PV+ INs (n=7 komórek w przekroju poprzecznym, n=9 komórek w skrawkach czołowych, Mean±SEM, P= 0.0283 test Mann-Whitneya). (D) Spoczynkowy potencjał błonowy (RMP) komórek poddanych patch-clampowi (odpowiednio, n= 14 i n=11 komórek ziarnistych, Mean±SEM, P=0.0455 test Mann-Whitneya; n=7 PV+ INs i n=10 PV+ INs, P= 0.0271 test Mann-Whitneya). (E) Procent odrzuconych komórek w ramach sesji eksperymentalnej (n=3 sesje ze skrawkiem czołowym, n=4 ze skrawkiem poprzecznym, Mean±SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie neuronalne z użyciem biocytyny i tdTomato, wyniki mikroskopowe pokazujące strukturę komórek hipokampa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zachowanie morfologiczne komórek ziarnistych i interneuronów w przekroju poprzecznym. Obrazy konfokalne przedstawiające wypełnione biocytyną komórki ziarniste w przekroju poprzecznym (A) oraz w przekrojach czołowych (B) u myszy transgenicznych Pvalb-IRES-Cre;Ai9. Odpowiednie aksony zrekonstruowano w kolorze szarym i jasnoszarym. Zwróć uwagę na różnicę w długości i złożoności aksonów pomiędzy preparatami. Pasek skali=100 µm. (C1) Obraz konfokalny przedstawiający wypełniony biocytyną, tdTomato-dodatni interneuron. Hil=hilus, gcl=warstwy komórek ziarnistych, ml=warstwa molekularna. Pasek skali=50 µm. (C2) Powiększenie obszaru zaznaczonego ramką w C1, pokazujące kolce dendrytyczne. Pasek skali=2 µm (D) Rekonstrukcja morfologiczna aksonów i dendrytów wypełnionego biocytyną interneuronu z obrazu C1 (akson w kolorze szarym, soma i dendryty w kolorze czarnym). (E) Zbliżenie na somata komórek przedstawionych w C1, pokazujące kolokalizację biocytyny i immunoreaktywności parwalbuminy (PVir). Pasek skali=20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie zdrowych ostrych wycinków z grzbietowego pośredniego obszaru hipokampa do długotrwałych zapisów i rekonstrukcji neuronów u dorosłych myszy. Wiele laboratoriów, takich jak nasze, bada hipokamp grzbietowy pod kątem jego roli w specjalnym uczeniu się i nawigacji. Typowymi technikami stosowanymi w tym celu są eksperymenty behawioralne, śledzenie anatomiczne i manipulacje specyficzne dla regionu.Opracowaliśmy metodę wycinania mózgu, aby połączyć elektrofizjologię z tymi technikami, aby umożliwić bezpośrednią korelację danych invivodata w nagraniach wideo. Zaletą tego protokołu jest to, że łączy w sobie prostą procedurę uzyskiwania przekrojów poprzecznych z użyciem roztworu ochronnego w celu zwiększenia żywotności tkanki mózgowej. Takie podejście jest szczególnie przydatne, gdy wykorzystuje się dojrzałe zwierzęta, jak w eksperymentach behawioralnych.Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj obok zlewu niezbędny sprzęt do tej sekcji. Przygotuj na lodzie 150-mililitrową zlewkę i dwie szklane szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów każda. Narysuj trzy części linii aż do dna plastikowej szalki Petriego i umieść to naczynie blisko tacki na lód.Będziesz także potrzebował kleju i uchwytu na próbkę do wibratomu. Następnie wyposaż stół operacyjny w duże nożyczki, małe nożyczki, pęsetę z zaokrągloną końcówką, pęsetę z cienką końcówką, cienką metalową szpatułkę, dużą metalową szpatułkę i pipety transferowe. Obierz szalki Petriego roztworem do krojenia.Jedna miska do wykonania sekcji głowy, a druga do sekcji mózgu. W tym ostatnim umieść również kawałek bibuły filtracyjnej. Napełnij również zlewkę 30 mililitrowym roztworem tnącym.Będzie to potrzebne do perfuzji przezsercowej. Napełnij tackę wibratomu lodowatym roztworem do cięcia na zimno i utrzymuj cały roztwór natleniony za pomocą urządzenia do bulgotania karbogenu. Dodaj kruszony lód wykonany z zamrożonej partii roztworu do krojenia do zimnego, świeżego roztworu do krojenia, aby utrzymać niską temperaturę.Zwróć uwagę, aby lód nie dostał się do ostrza podczas krojenia. Prawie wszystkie kroki po kapitacji są wykonywane w obrębie rozwiązań. Pomaga to ograniczyć metabolizm do niedoboru tlenu do minimum.Przygotować komorę inkubacyjną wypełnioną roztworem tnącym pod stałym natlenieniem. Umieść komorę w podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 35 stopni Celsjusza. Przygotuj komorę do przechowywania plastrów z kilkoma niezależnymi dołkami i napełnij ją roztworem do przechowywania.Utrzymuj go pod stałym natlenieniem w temperaturze pokojowej. W przypadku, gdy w tkance występuje ekspresja białka fluorescencyjnego lub aktywowanej światłem opsoniny. Zaleca się trzymanie komory w ciemności.Na przykład wewnątrz pudełka. Po wykonaniu perfuzji przezsercowej umieść głowę myszy na szalce Petriego z roztworem do cięcia na zimno. Otwórz skórę cienkimi nożyczkami, aby odsłonić czaszkę.Zaczynając od otworu wielkiego, przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego, aż do szwu nosowo-czołowego. Uważaj, aby lekko podciągnąć nożyczki, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Wykonaj dwa boczne nacięcia w podstawie czaszki.Użyj pęsety z zaokrągloną końcówką, aby podciągnąć kości ciemieniowe. Uważaj, aby usunąć również opony mózgowe. Pozostawione mogą uszkodzić mózg podczas ekstrakcji.Użyj małej szpatułki, aby delikatnie poluzować mózg od podstawy czaszki. Za pomocą małej szpatułki odłącz mózg od nerwów czaszkowych i przenieś mózg na mały kawałek bibuły filtracyjnej na drugiej szalce Petriego. Przetnij mózg na pół wzdłuż podłużnej szczeliny za pomocą wstępnie schłodzonego ostrza.Oddziel dwie półkule za pomocą najmniejszej szpatułki. Użyj największej szpatułki, aby przenieść jedną półkulę na plastikową szalkę Petriego jej środkową powierzchnią skierowaną w dół. Wyrównaj korę ciemieniową z jedną z równoległych linii, aby uzyskać odniesienie do drugiego cięcia.Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby wysuszyć nadmiar roztworu. Ustaw ostrze równolegle do linii i przetnij brzuszną część półkuli. Ta płaska powierzchnia zostanie później przyklejona do uchwytu na próbki.Umieść półkulę z powrotem w natlenionym roztworze bawełny szklanej szalki Petriego i wykonaj tę samą procedurę na drugiej półkuli. Umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na uchwycie próbki wibratomu i rozprowadź ją szpatułką, aby utworzyć cienką warstwę. Przenieś półkulę na uchwyt wibratomu brzuszną stroną do dołu za pomocą zaokrąglonej strony szpatułki.Rozpoczęcie tego krojenia od kory ciemieniowej skróciłoby czas potrzebny na zebranie grzbietowego obszaru hipokampa. Dodaj kilka kropli roztworu do cięcia na zimno, aby zestalić klej. Przenieś uchwyt na próbkę do tacki z wibratomem i przy odpowiednich ustawieniach pokrój mózg, aż obszar grzbietowego hipokampa będzie widoczny.Następnie należy zebrać plastry za pomocą plastikowej pipety transferowej. Przenieś każdy plasterek do komory inkubacyjnej i odstaw na 12 minut. W międzyczasie przystąp do krojenia kolejnych plastrów.Po 12 minutach inkubacji przenieś plastry do komory do przechowywania. I pozwól mu odpocząć do rozpoczęcia eksperymentu. Aby zademonstrować czystość naszego preparatu, porównujemy go z preparatem koronalnym, który jest powszechnie stosowany do nagrywania z grzbietowego hipokampa.Pokazano tutaj mikrografię kontrastu interferencyjnego uzyskaną z górnej blaszki zakrętu zębatego w ostrych plastrach od dwumiesięcznych myszy. W przekroju poprzecznym neurony w większości wykazywały gładkie powierzchnie i prawdopodobnie tylko kontrastowe granice, oznaczone czarnymi strzałkami. Neurony w wycinkach koronalnych często jednak pojawiały się w ruchu i wykazywały silnie skontrastowane kontury, oznaczone białymi strzałkami.Sugeruje to lepszą żywotność neuronów w przekroju poprzecznym. Zgodnie z tym wrażeniem, średni czas tworzenia się uszczelnienia podczas łatania w naszych warstwach poprzecznych był znacznie szybszy niż w warstwach koronalnych. Jako ogólny wskaźnik integralności komórki rejestrujemy, że spoczynkowe potencjały błonowe komórek ziarnistych i neuronów inter neuronowych dodatnich parwalbuminą, które są znacznie bardziej depolaryzowane w obu typach komórek w warstwach koronalnych i poprzecznych.Co w efekcie ostatecznie doprowadziło do powstania znacznie większej liczby komórek, które musiały zostać wykluczone z preparacji koronalnej. Ponieważ aksony komórek ziarnistych przebiegają w płaszczyźnie poprzecznej, rekonstrukcja zarejestrowanych komórek doprowadziła do odzyskania pełnej arboryzacji aksonów w naszym preparatzie. Nie miało to miejsca w warstwach koronalnych, w których aksony mogły zostać łatwo odcięte.Ponadto rekonstrukcja morfologiczna parwalbuminowo-dodatnich neuronów inter neuronów w przekrojach poprzecznych pozwoliła na zobrazowanie rozległej arboryzacji aksonalnej i dendrytycznej, w tym wizualizację drobnych szczegółów, takich jak kolce dendrytyczne. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiliśmy metody krojenia w celu uzyskania poprzecznych wycinków hipokampa o wysokiej żywotności neuronalnej dla dorosłych myszy. Metoda ta może być stosowana do pomiaru elektrofizjologicznego badania in vitro z badaniami anatomicznymi i behawioralnymi koncentrującymi się na pośredniej grzbietowej części hipokampa.

preparation-acute-slices-from-dorsal-hippocampus-for-whole-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten artykuł przedstawia kompletną metodologię przygotowania i konserwacji in vitro ostrych wycinków hipokampa od dorosłych myszy. Protokół ten pozwala na rejestrowanie bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia (LTP) przez ponad 8 godzin ze wskaźnikiem sukcesu 95%.

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Prezentowany protokół opisuje transport i przygotowanie wyciętej ludzkiej tkanki hipokampa, której ostatecznym celem jest wykorzystanie ważnych wycinków mózgu jako narzędzia do oceny przedklinicznej potencjalnych substancji przeciwpadaczkowych.

Przygotowanie ostrych wycinków ludzkiego hipokampa do zapisów elektrofizjologicznych

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Poznaj metodę przygotowania ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa dorosłych myszy do zapisów elektrofizjologicznych i rekonstrukcji neuronów. Protokół zapewnia lepszą żywotność komórek w porównaniu do wycinków czołowych.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów