Name: Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj elektroporację pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego z wykorzystaniem systemu transpozonów Sleeping Beauty. Ta metoda umożliwia stabilną ekspresję transgenu i sekrecję białek terapeutycznych w leczeniu chorób zwyrodnieniowych siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Siódmy Program Ramowy Unii Europejskiej w zakresie badań, rozwoju technologicznego i demonstracji, umowa o grant nr 305134. Zsuzsanna Izsvák została sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Autorzy pragną podziękować Annie Dobias i Antje Schiefer (Oddział Okulistyki, Szpital Uniwersytecki RWTH Aachen) za doskonałe wsparcie techniczne, a także Bankowi Rogówki w Akwizgranie (Oddział Okulistyki, Szpital Uniwersytecki RWTH Aachen) za udostępnienie ludzkich oczu dawcy.

Ludzkie oczy dawcy zostały pobrane z Banku Rogówki w Akwizgranie Oddziału Okulistyki (Szpital Uniwersytecki RWTH Aachen) po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z Deklaracją Protokołów Helsińskich. Procedury pobierania i wykorzystywania próbek pochodzących od ludzi zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną.
1. Izolacja pierwotnych ludzkich komórek RPE
<ol>
	<li>Rozłóż sterylną odzież ochronną i rękawice. Umieść sterylną serwetkę pod przepływem laminarnym.</li>
	<li>Umieść sterylne narzędzia do przygotowywania i inny niezbędny sterylny sprzęt pod przepływem laminarnym.</li>
	<li>Zapisz odbiór kul ocznych, początek przygotowania, a także ewentualne nieprawidłowości. Zarejestruj wiek dawcy, płeć, przyczynę zgonu oraz okres między śmiercią a usunięciem oka.</li>
	<li>Umieść gałkę oczną w sterylnym kompresie z gazy i trzymaj ją w jednej ręce.</li>
	<li>Oddziel odcinek przedni od tylnego za pomocą cięcia obwodowego około 3,5 mm za rąbkiem za pomocą skalpela i bardzo cienkich, spiczastych nożyczek do oczu.</li>
	<li>Po odchyleniu tylnego odcinka w dół ostrożnie usuń ciało szkliste i siatkówkę za pomocą kleszczyków colibri.</li>
	<li>Dyskretnie przestaw zapadnięty kompleks RPE/choroidea za pomocą prostych kleszczyków do tęczówki, a następnie przytrzymaj go w odpowiedniej pozycji za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki.</li>
	<li>Napełnij tylną muszlę oczną 1 ml zmodyfikowanej mieszanki składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's (DMEM/F12) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 80 U/ml penicyliny i 80 μg/ml streptomycyny (Pen/Strep) oraz 2,5 μg/ml amfoterycyny B (AmphoB). 
	UWAGA: W przeciwieństwie do izolacji pierwotnych komórek RPE z oczu świni lub bydła36,37, tylna muszla oczna nie musi być wypełniona i inkubowana trypsyną.</li>
	<li>Zbierz komórki RPE, delikatnie muskając nabłonek barwnikowy siatkówki od nerwu wzrokowego w kierunku rąbka za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z zakrzywionego szkła, jednocześnie mocując kompleks RPE/choroidea na rąbku za pomocą kleszczy colibri. Przenieść zawiesinę komórkową na szalkę Petriego.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.8 i 1.9 i zbierz wszystkie komórki na szalce Petriego. Zawiesinę komórek należy ostrożnie zawiesić, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety jednokanałowej (100-1 000 μl).</li>
	<li>Zawiesinę komórek RPE z każdej gałki ocznej należy umieścić w trzech dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i wypełnić je do 1 ml DMEM / F12 uzupełnionym FBS, Pen / Strep i AmphoB.</li>
	<li>Utrzymuj hodowle komórek RPE w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze składającej się w 95% z powietrza i 5% z CO2 aż do osiągnięcia konfluencji. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
2. Elektroporacja pierwotnych ludzkich komórek RPE
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny plazmidu transpozy SB100X/transpozonu PEDF
	<ol>
		<li>Oczyść DNA transpozazy transpozazy SB100X i transpozonu plazmidu PEDF za pomocą zwykłych zestawów do oczyszczania plazmidu, które zostały zidentyfikowane jako odpowiednie do stosowania w zastosowaniach takich jak transfekcja, zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Określić ilościowo zawartość plazmidowego DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i dostosować je do stężenia 250 ng/μL za pomocą 10 mM Tris-HCl (pH 8,5).</li>
		<li>Wymieszaj jedną porcję 250 ng/μL plazmidowego DNA transpozazy SB100X (np. 2,5 μL) z 16 porcjami 250 ng/μL transpozonu plazmidowego DNA transpozonu PEDF (np. 40 μL). Resztkowa mieszanina plazmidów może być przechowywana w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania mieszaniny plazmidów.</li>
		<li>Umieścić 2 μl mieszaniny plazmidu transpozy SB100X i transpozonu transpozonu PEDF, zawierającej 29,4 ng plazmidu transpozy SB100X i 470,6 ng plazmidu transpozonu PEDF, w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z bezpiecznym zamknięciem. Trzymaj na lodzie, aż wymieszają się z komórkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja systemu transfekcji kapilarnej 
	UWAGA: Elektroporacja pierwotnych ludzkich komórek RPE została przeprowadzona za pomocą systemu transfekcji kapilarnej przy użyciu zestawu 10 μL zgodnie z protokołem producenta. System składa się z urządzenia do transfekcji, pipety do transfekcji i stacji pipetowej. Zestaw zawiera końcówki do transfekcji o pojemności 10 μl, probówki buforowe, bufor elektrolityczny E (bufor E) i bufor do resuspensji R (bufor R).
	<ol>
		<li>Podłącz stację pipetową do urządzenia do transfekcji.</li>
		<li>Napełnij probówkę buforową 3 ml buforu E i włóż ją do stacji pipetowej, aż usłyszysz kliknięcie. 
		UWAGA: Upewnij się, że elektroda boczna rurki buforowej jest podłączona do bocznego tłoka kulkowego stacji pipetowania.</li>
		<li>W celu elektroporacji pierwotnych ludzkich komórek RPE należy ustawić następujące warunki impulsu w urządzeniu transfekcyjnym: 1 100 V (napięcie impulsu), 20 ms (szerokość impulsu), dwa impulsy (liczba impulsu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hodowanych pierwotnych ludzkich komórek RPE
	<ol>
		<li>Udokumentuj kształt i morfologię pierwotnych kultur komórek RPE za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Weź mikrofotografie o małym powiększeniu, aby zademonstrować wzrost komórek RPE do zlewającej się i zintegrowanej monowarstwy, a także mikrofotografie o większym powiększeniu, aby wskazać typową morfologię komórek RPE na bruku.</li>
		<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć komórki dwukrotnie 1 ml buforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Trypsynizować pierwotne ludzkie komórki RPE za pomocą 0,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 przez 7-15 minut (maksymalnie). Sprawdź odwarstwienie komórki pod mikroskopem.</li>
		<li>Zatrzymaj trypsynizację za pomocą 1 ml DMEM/F12 uzupełnionego FBS. Pobrać podwielokrotność 20 μl do zliczania komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować zawiesinę komórek RPE o sile 106 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Zmieszać podwielokrotność 20 μl z 20 μl roztworu błękitu trypanowego. Pobrać pipetę po 10 μl do każdej połówki hemocytometru i policzyć komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym.</li>
		<li>Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórek RPE w 1 ml PBS.</li>
		<li>Pobrać 10 000-100 000 komórek RPE na reakcję transfekcji i odwirować je przy 106 x g przez 10 min. 
		UWAGA: Oprócz reakcji transfekcji z zastosowaniem pola elektrycznego i dodaniem plazmidowego DNA, każde podejście obejmuje również dwie różne kultury kontrolne: (1) bez zastosowania pola elektrycznego i bez plazmidowego DNA; (2) z zastosowaniem pola elektrycznego, ale bez plazmidowego DNA.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 11 μl buforu R i połączyć go z 2 μl mieszaniny plazmidu transpozy/transpozonu SB100X (patrz krok 2.1.4). 
		UWAGA: Po ponownym zawieszeniu w buforze R, komórki muszą zostać przetworzone w ciągu 15 minut, aby uniknąć zmniejszenia żywotności komórek i wydajności transfekcji.</li>
		<li>Włóż głowicę pipety do transfekcji do końcówki transfekcyjnej o pojemności 10 μl, aż zacisk całkowicie podniesie trzpień mocujący tłoka. Pobrać roztwór komórki/plazmidu do końcówki transfekcyjnej. 
		UWAGA: Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza i ich zasysania do końcówki transfekcyjnej.</li>
		<li>Dostarczyć 1 ml DMEM/F12 uzupełnionego FBS, ale bez Pen/Strep i bez AmphoB, do wymaganej liczby dołków 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces elektroporacji
	<ol>
		<li>Włóż pipetę do transfekcji do rurki buforowej umieszczonej w stacji pipetowej (patrz krok 2.2.2), aż usłyszysz kliknięcie. 
		UWAGA: Upewnij się, że metalowa głowica pipety do transfekcji jest podłączona do tłoka kulowego wewnątrz stacji pipetowania i do rurki buforowej.</li>
		<li>Naciśnij Start na ekranie dotykowym urządzenia transfekcyjnego. Przed zastosowaniem impulsu elektrycznego urządzenie automatycznie sprawdza, czy rurka buforowa i pipeta transfekcyjna są prawidłowo włożone. Po dostarczeniu impulsów elektrycznych, na ekranie dotykowym wyświetlany jest komunikat Complete.</li>
		<li>Ostrożnie wyjąć pipetę do transfekcji ze stacji pipetowania i natychmiast uwolnić elektroporowane komórki z końcówki do transfekcji o pojemności 10 μl, pipetując roztwór komórki/plazmidu do przygotowanych dołków płytki do hodowli komórkowej (patrz krok 2.3.10).</li>
		<li>Utrzymuj transfekowane hodowle komórek RPE w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze składającej się w 95% z powietrza i 5%CO2. Dodać Pen/Strep i AmphoB z pierwszą wymianą pożywki 3 dni po elektroporacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analizy transfekowanych pierwotnych ludzkich komórek RPE
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Po czasie hodowli wynoszącym 3 tygodnie, ostatecznie inkubować kultury komórkowe RPE w określonej objętości 1,0 ml DMEM/F12 uzupełnionej FBS, Pen/Strep i AmphoB przez określony czas 24 godzin.</li>
		<li>Pobrać supernatanty z kultur komórkowych i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania w czasie zbliżonym do czasu lub w temperaturze -80 °C w przypadku próbek niestabilnych termicznie i długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Trypsynizować transfekowane hodowle komórek RPE za pomocą 0,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5%CO2 przez 10 minut.</li>
		<li>Zatrzymaj trypsynizację za pomocą 1 ml DMEM/F12 uzupełnionego FBS. Weź małe podwielokrotności do zliczania komórek za pomocą hemocytometru (patrz krok 2.3.5). Odwirować zawiesiny komórek RPE w stężeniu 106 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Przechowuj granulki komórek RPE w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena wydzielania PEDF przez western blotting 
	UWAGA: W celu oceny jakościowej supernatanty z hodowli komórkowych (patrz krok 3.1.2) analizuje się za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie western blot. W zależności od zastosowanego plazmidu transpozonu PEDF, supernatanty muszą być przetwarzane w różny sposób.
	<ol>
		<li>Oczyszczanie białek fuzyjnych PEDF znakowanych przez Hisa z supernatantów do hodowli komórkowych
		<ol>
			<li>Pobrać 30 μl zawiesiny kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA) na próbkę za pomocą końcówki ze skosem i granulować żywicę Ni-NTA przez odwirowanie (2,660 x g przez 30 s).</li>
			<li>Ostrożnie ponownie zawiesić żywicę Ni-NTA z 200 μl 1x buforu inkubacyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu, pH 8,0) i zagnieździć przez odwirowanie (2,660 x g przez 30 s).</li>
			<li>Powtórz poprzedni krok.</li>
			<li>Ostrożnie zawiesić żywicę Ni-NTA z 40 μl 4x buforem inkubacyjnym (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazolu, pH 8,0) na próbkę.</li>
			<li>Zmieszać 900 μl supernatantu do hodowli komórkowych z 260 μl 4-krotnego buforu do inkubacji i 55 μl wstępnie przetworzonej gnojowicy Ni-NTA (patrz krok 3.2.1.4).</li>
			<li>Inkubować mieszaninę na kołyszącym się shakerze w temperaturze pokojowej przez 60 minut.</li>
			<li>Żywicę Ni-NTA osadzać przez odwirowanie (2660 x g przez 60 s).</li>
			<li>Ostrożnie ponownie zawiesić żywicę Ni-NTA ze 175 μl 1x buforu inkubacyjnego i żywicy w postaci granulek przez odwirowanie (2,660 x g przez 60 s).</li>
			<li>Powtórz poprzedni krok.</li>
			<li>Ostrożnie zawiesić żywicę Ni-NTA z 30 μl buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu, pH 8,0) i inkubować mieszaninę na wytrząsarce kołyszącej w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
			<li>Żywicę Ni-NTA osadzać przez odwirowanie (2,660 x g przez 30 s).</li>
			<li>Ostrożnie pobrać supernatant i wymieszać go z 2x buforem próbki SDS47.</li>
			<li>Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut i oddzielić oczyszczone białka Ni-NTA od 10% żelu poliakryloamidowego SDS.</li>
			<li>Wykonaj western blot przy użyciu przeciwciał anty-Penta-His (monoklonalne myszy, 1:500) i przeciwciał anty-mysich sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP) (poliklonalny królik, 1:1,000), jak opisano wcześniej36,37.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bezpośrednia analiza nieznakowanych białek PEDF
		<ol>
			<li>Weź 15 μl supernatantu do hodowli komórkowych i wymieszaj go z 2x buforem próbki SDS47.</li>
			<li>Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut i oddzielić białka od 10% żelu poliakryloamidowego SDS.</li>
			<li>Wykonaj western blot przy użyciu przeciwciał anty-ludzkich PEDF (poliklonalne króliki, 1:4,000) i sprzężonych z HRP przeciwciał anty-króliczych (kozie poliklonalne, 1:2,000), jak opisano wcześniej38.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kwantyfikacja wydzielania PEDF za pomocą testu ELISA
		<ol>
			<li>Analizować supernatanty do hodowli komórkowych (patrz krok 3.1.2) przy użyciu ludzkiego zestawu PEDF ELISA zgodnie z protokołem producenta.</li>
			<li>Odnieś ilość wydzielanego PEDF do czasu i liczby komórek oznaczonych dla każdej reakcji transfekcji (patrz krok 3.1.4).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza ekspresji genu PEDF w transfekowanych komórkach RPE
		<ol>
			<li>Wyizolować całkowite RNA z osadów komórek RPE (patrz krok 3.1.5) za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z protokołem producenta.</li>
			<li>Określ ilościowo zawartość RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
			<li>Przeprowadzić odwrotną transkrypcję na 0,1 μg RNA przy użyciu systemu odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta.</li>
			<li>Wykonaj qPCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej38.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza miejsc insercji transgenu w transfekowanych komórkach RPE
		<ol>
			<li>Wyizolować genomowe DNA z granulek komórek RPE (patrz krok 3.1.5) za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z protokołem producenta.</li>
			<li>Określić ilościowo zawartość DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
			<li>Generuj biblioteki miejsc wstawiania przy użyciu wspomaganego obliczeniowo schematu PCR specyficznego dla hemi, jak opisano wcześniej38.</li>
			<li>Wykonaj analizę obliczeniową zgodnie z wcześniejszym opisem38.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Zoltán Ivics i Zsuzsanna Izsvák są wynalazcami kilku patentów na technologię transpozonów SB

W naszym projekcie dążymy do niewirusowej produkcji genetycznie zmodyfikowanych pierwotnych ludzkich komórek RPE, które w sposób ciągły wykazują nadekspresję i wydzielają skuteczny czynnik, aby wykorzystać transfekowane komórki jako długoterminową terapię w celu ustanowienia i utrzymania środowiska ochronnego. Udało nam się wprowadzić gen kodujący PEDF, wszechobecne w ekspresji wielofunkcyjne białko o funkcjach antyangiogennych i neuroprotekcyjnych. Opisany tutaj protokół może być używany do stabilnego i powtarzalnego tr...

Zaawansowany wiek jest opisany jako główne ryzyko chorób neurodegeneracyjnych. Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), choroba wielogenowa prowadząca do poważnej utraty wzroku u pacjentów w wieku powyżej 60 lat, należy do czterech najczęstszych przyczyn ślepoty i upośledzenia wzroku1 i oczekuje się, że wzrośnie do 288 milionów osób w 2040 roku2. Dysfunkcje nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), pojedynczej warstwy ciasno upakowanych komórek znajdujących się między naczyniówką włosowatą a fotoreceptorami siatkówki, przyczyniają się do patogenezy AMD. RPE spełnia wiele zadań, które są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania siatkówki3 i wydziela różnorodne czynniki wzrostu i czynniki niezbędne do utrzymania integralności strukturalnej siatkówki i naczyniówki, wspierając w ten sposób przeżycie fotoreceptorów i stanowiąc podstawę dla krążenia i dostarczania składników odżywczych.
W zdrowych oczach, czynnik pochodzenia nabłonka barwnikowego (PEDF) jest odpowiedzialny za równoważenie działania czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i chroni neurony przed apoptozą, zapobiega proliferacji komórek śródbłonka i stabilizuje śródbłonek naczyń włosowatych. Przesunięty stosunek VEGF do PEDF jest związany z neowaskularyzacją oka, którą zaobserwowano w modelach zwierzęcych4,5, a także w próbkach pacjentów z neowaskularyzacją naczyniówkową (CNV) spowodowaną AMD i proliferacyjną retinopatią cukrzycową6,7,8,9,10. Zwiększone stężenie VEGF jest celem dla obecnego standardowego leczenia. Leki anty-VEGF bewacyzumab, ranibizumab, aflibercept i ostatnio brolucizumab poprawiają ostrość widzenia u około jednej trzeciej pacjentów z CNV, a raczej stabilizują widzenie w 90% przypadków11,12,13. Jednak częste, często comiesięczne wstrzyknięcia do ciała szklistego niosą ze sobą ryzyko wystąpienia zdarzeń niepożądanych14, utrudniają przestrzeganie zaleceń przez pacjenta i stanowią znaczne obciążenie ekonomiczne dla systemów opieki zdrowotnej15. Co więcej, pewien odsetek pacjentów (2%-20%) nie reaguje lub reaguje słabo na terapię anty-VEGF16,17,18,19. Te negatywne współczynniki wymagają opracowania alternatywnych metod leczenia, np. implantów wewnątrzgałkowych, metod terapii komórkowej i/lub genowej.
Terapia genowa ewoluowała jako obiecująca metoda leczenia chorób dziedzicznych i niedziedzicznych i ma na celu przywrócenie niefunkcjonalnych sekwencji genów lub stłumienie nieprawidłowo funkcjonujących. W przypadku chorób wielogenowych, w przypadku których identyfikacja i zastąpienie czynników wywołujących jest prawie niemożliwe, strategie mają na celu ciągłe dostarczanie czynnika ochronnego. W przypadku AMD opracowano różne terapie addytywne, takie jak stabilna ekspresja endostatyny i angiostatyny20, antagonista VEGF rozpuszczalna w fms kinaza tyrozynowa-1 (sFLT-1)21,22, klaster białka regulatorowego dopełniacza o różnicowaniu 59 (CD59)23 lub PEDF24,25. Oko, a zwłaszcza siatkówka, jest doskonałym celem dla leków opartych na genach ze względu na zamkniętą strukturę, dobrą dostępność, niewielkie rozmiary i przywilej immunologiczny, co pozwala na miejscowe dostarczanie niskich dawek terapeutycznych i sprawia, że przeszczepy są mniej podatne na odrzucenie. Co więcej, oko umożliwia nieinwazyjne monitorowanie, a siatkówka może być badana za pomocą różnych technik obrazowania.
Wektory wirusowe są, ze względu na ich wysoką skuteczność transdukcji, głównym narzędziem dostarczania genów terapeutycznych do komórek docelowych. Jednak w zależności od użytego wektora wirusowego opisano różne działania niepożądane, takie jak reakcje immunologiczne i zapalne26, efekty mutagenne i onkogenne27,28, lub rozsiewanie w innych tkankach29. Do praktycznych ograniczeń należy ograniczony rozmiar opakowania30, a także trudności i koszty związane z produkcją partii klasy klinicznej31,32. Te wady sprzyjały dalszemu rozwojowi niewirusowych wektorów opartych na plazmidach, które są przenoszone za pomocą lipo-/polipleksów, ultradźwięków lub elektroporacji. Jednak genomowa integracja transgenu z genomem gospodarza zwykle nie jest promowana przez wektory plazmidowe, co prowadzi do przejściowej ekspresji.
Transpozony to naturalnie występujące fragmenty DNA, które zmieniają swoje położenie w genomie, cecha, która została zaadoptowana do terapii genowej. Ze względu na aktywny mechanizm integracji, systemy wektorowe oparte na transpozonach pozwalają na ciągłą i stałą ekspresję wprowadzonego transgenu. Transpozon Śpiącej Królewny (SB), odtworzony ze starożytnego transpozonu typu Tc1/marynarskiego znalezionego w fish33 i dalej ulepszony przez ewolucję molekularną, w wyniku której powstał hiperaktywny wariant SB100X34, umożliwił efektywną transpozycję w różnych komórkach pierwotnych i był używany do korekcji fenotypowej w różnych modelach chorób35. Obecnie rozpoczęto 13 badań klinicznych z wykorzystaniem systemu transpozonów SB. System transpozonów SB100X składa się z dwóch elementów: transpozonu, który składa się z genu zainteresowania otoczonego końcowymi odwróconymi powtórzeniami (TIR), oraz transpozy, która mobilizuje transpozon. Po dostarczeniu plazmidowego DNA do komórek, transpozaza wiąże TIR i katalizuje wycięcie i integrację transpozonu z genomem komórki.
Opracowaliśmy niewirusową terapię addytywną opartą na komórkach do leczenia neowaskularnego AMD. Podejście to polega na opartej na elektroporacji insercji genu PEDF do komórek pierwotnego nabłonka barwnikowego (PE) za pomocą systemu transpozonów SB100X36,37,38. Informacja genetyczna transpozazy i PEDF jest dostarczana na oddzielnych plazmidach, co umożliwia dostosowanie idealnego stosunku transpozonów SB100X do PEDF. Elektroporacja jest wykonywana za pomocą systemu transfekcji kapilarnej opartego na pipetach, który charakteryzuje się maksymalizacją wielkości szczeliny między elektrodami przy jednoczesnej minimalizacji ich powierzchni. Wykazano, że urządzenie osiąga doskonałe wskaźniki transfekcji w szerokim zakresie komórek ssaków39,40,41. Mała powierzchnia elektrody zapewnia jednolite pole elektryczne i redukuje różne skutki uboczne elektrolizy42.
Antyangiogenna funkcjonalność PEDF wydzielanego przez transfekowane komórki nabłonka pigmentowego została pokazana w różnych eksperymentach in vitro analizujących kiełkowanie, migrację i apoptozę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej43. Ponadto, przeszczepienie komórek transfekowanych PEDF w króliczym modelu neowaskularyzacji rogówki44, a także na szczurzym modelu CNV43,45,46 wykazało spadek neowaskularyzacji.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół stabilnej insercji genu PEDF do pierwotnych ludzkich komórek RPE za pomocą systemu transpozonów SB100X przy użyciu systemu transfekcji kapilarnej. Transfekowane komórki utrzymywano w hodowli przez 21 dni, a następnie analizowano pod kątem ekspresji genu PEDF za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) oraz pod względem wydzielania białka PEDF za pomocą immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA, <silna klasa = "xfig">Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Izolacja pierwotnych ludzkich komórek RPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>0030722019</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B [250 &mikro; g/mL] (AmphoB)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Colibri Kleszcze</td><td>Geuder, Heidelberg, Niemcy</td><td>G-18950</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze do tęczówki&nbsp;</td><td>Geuder, Heidelberg, Niemcy</td><td>G-18856</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel (nr 11)</td><td>Feather, Osaka, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni/Szynka" s F-12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Niemcy</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo cienkie szpiczaste nożyczki do oczu&nbsp;</td><td>Geuder, Heidelberg, Niemcy</td><td>G-19405</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca [0,2 i mikro; m Sterylne filtrowane] (FBS)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Niemcy</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Marka szklanych pipet Pasteura</td><td>, Wertheim, Niemcy</td><td>747715</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina [10 000 jednostek/ml] i streptomycyna [10 mg/mL] (długopis/paciorkowiec)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1000 &mikro; L)</td> <td>Starlab, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa (100-1000 i mikro; L)</td> <td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna serweta</td><td>Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny kompres z gazy&nbsp;</td><td>Fink-Walter, Merchweiler, Niemcy</td><td>321063</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawiczki</td><td>Sempermed, Wiedeń, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petriego (Falcon 60 mm x 15 mm)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny fartuch chirurgiczny</td><td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do prostych tęczówek&nbsp;</td><td>Geuder, Heidelberg, Niemcy</td><td>G-18855</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporacja pierwotnych ludzkich komórek RPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td>0030722019</tr><tr><td>Amfoterycyna B [250 &mikro; g/mL] (AmphoB)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni/Szynka" s F-12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Niemcy</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safe-Lock (1,5 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu [0,2 i mikro; m Sterylny filtrowany] (FBS)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Niemcy</td> Mikroskop odwrócony <td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Niemcy</td> Spektrofotometr <td>mikroobjętościowy Leica DMi8</td><td></td></tr><tr><td>(spektrofotometr NanoDrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji kapilarnej (system transfekcji neonu)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td>MPK5000</tr><tr><td>System transfekcji neonowej 10 i mikro; L Zestaw</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr (komora Neubauera)</td><td>Paul Marienfeld, Lauda-K&ouml; nigshofen, Niemcy</td><td>0640110</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td><td>Biochrom, Berlin, Niemcy</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina [10 000 jednostek/ml] i streptomycyna [10 mg/ml] (długopis/paciorkowiec)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (10 &mikro; L)</td> <td>Starlab, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1000 &micro; L)</td> <td>Starlab, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (200 i mikro; L)</td> <td>Starlab, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa (0,1-10 i mikro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa (100-1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa (10-200 &mikro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05&nbsp;%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Analizy transfekowanych pierwotnych ludzkich komórek RPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% SDS-Poliakryloamid Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor do inkubacji (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Bufor</td><td></td><td></td><td></td>do próbek SDS</tr><tr><td>4x Bufor do inkubacji (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran Obsługiwany 0,2 i mikro; m&nbsp; Nitceluloza Blotting Membrane</td><td>Cytiva, Marlborough, MA</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B [250 &mikro; g / mL] (AmphoB)</td> <td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-PEDF (poliklonalne króliki)</td><td>BioProducts, Middletown, MD</td><td>AB-PEDF1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-penta-his (monoklonalne myszy)</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni/Szynka" s F-12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Niemcy</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu [0,2 i mikro; m Sterylny filtrowany] (FBS)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Niemcy</td> Hechocytometr <td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>(komora Neubauera)</td><td>Paul Marienfeld, Lauda-K&ouml; nigshofen, Niemcy</td><td>0640110</td><td></td></tr><tr><td>Chrzanowe przeciwciała anty-mysie sprzężone z peroksydazą chrzanową (poliklonalne królika)</td><td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową (koza poliklonalna)</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki zestaw PEDF ELISA&nbsp;</td><td>BioProducts, Middletown, MD</td><td>PED613</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 System obrazowania</td><td>Fujifilm, Minato, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 1.2 Instrument</td><td>Roche Life Science, Penzberg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td><td>Roche Life Science, Penzberg, Niemcy</td><td>12239264001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&nbsp; Naczynia włosowate (20 &mu; l)</td> <td>Roche Life Science, Penzberg, Niemcy</td><td>4929292001</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy (spektrofotometr NanoDrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Moduł odlewania komórek Tetra</td><td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Niemcy</td><td>1658015</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Pionowa komórka do elektroforezy Tetra do mini żeli prefabrykowanych, 4-żelowe</td><td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Niemcy</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>Prestained Protein Ladder PageRuler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina [10 000 jednostek/ml] i streptomycyna [10 mg/ml] (pióro/paciorkowiec)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (10 &mikro; L)</td> <td>Starlab, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1000 &micro; L)</td> <td>Starlab, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (200 i mikro; L)</td> <td>Starlab, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Niemcy</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>System odwrotnej transkrypcji&nbsp;</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNaz bez RNaz</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka kołysząca</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, Wielka Brytania</td><td>Probówki do mikrowirówek SSM3</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock (1,5 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safe-Lock (2,0 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa (0,1-10 &mikro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa (100-1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa (10-200 &mikro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Turbotransferu Trans-Blot</td><td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Niemcy</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05&nbsp;%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów sleeping beauty

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Nasze coraz bardziej starzejące się społeczeństwo prowadzi do coraz częstszego występowania chorób neurodegeneracyjnych. Do tej pory mechanizmy patologiczne nie są wystarczająco poznane, co utrudnia ustalenie zdefiniowanych metod leczenia. Oparte na komórkach addytywne terapie genowe mające na celu zwiększenie ekspresji czynnika ochronnego są uważane za obiecującą opcję leczenia chorób neurodegeneracyjnych, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Opracowaliśmy metodę stabilnej ekspresji genu kodującego czynnik pochodzenia nabłonka barwnikowego (PEDF), który charakteryzuje się jako białko neuroprotekcyjne i antyangiogenne w układzie nerwowym, do genomu pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego (PE) za pomocą układu transpozonów Sleeping Beauty (SB). Pierwotne komórki PE wyizolowano z ludzkich oczu dawcy i utrzymywano w hodowli. Po osiągnięciu konfluencji, 1 x 104 komórki zawieszono w 11 μl buforu do resuspensji i połączono z 2 μl oczyszczonego roztworu zawierającego 30 ng nadpoaktywnego plazmidu transpozazy SB (SB100X) i 470 ng plazmidu transpozonu PEDF. Modyfikacja genetyczna została przeprowadzona za pomocą systemu elektroporacji kapilarnej z wykorzystaniem następujących parametrów: dwa impulsy o napięciu 1 100 V i szerokości 20 ms. Transfekowane komórki przeniesiono na płytki hodowlane zawierające pożywkę uzupełnioną płodową surowicą bydlęcą; Antybiotyki i leki przeciwgrzybicze zostały dodane przy pierwszej wymianie pożywki. Skuteczna transfekcja została wykazana w niezależnie przeprowadzonych eksperymentach. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) wykazała zwiększoną ekspresję transgenu PEDF. Wydzielanie PEDF było znacznie zwiększone i pozostawało stabilne, co oceniano za pomocą immunoblottingu i oznaczano ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Transfer, w którym pośredniczy SB100X, pozwolił na stabilną integrację genu PEDF z genomem komórek PE i zapewnił ciągłe wydzielanie PEDF, co ma kluczowe znaczenie dla opracowania terapii dodawania genów opartej na komórkach w leczeniu AMD lub innych chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Co więcej, analiza profilu integracji transpozonu PEDF z ludzkimi komórkami PE wykazała niemal losowy rozkład genomu.

Hodowla i elektroporacja pierwotnych ludzkich komórek RPE 
Wykazaliśmy, że wysianie odpowiedniej liczby pierwotnych komórek RPE pochodzenia zwierzęcego pozwala na ich hodowlę i wzrost do postaci zintegrowanej monowarstwy pigmentowanych komórek o sześciokątnym kształcie36,37,48Ich zdolność do tworzenia złączy ścisłych, wykazania aktywności fagocytycznej oraz ekspresji specyficz...

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Metoda ta demonstruje opartą na elektroporacji transfekcję pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty, co jest dowodem na ekspresję transgenu i wydzielanie białek. Połączenie Sleeping Beauty Transposon System i elektroporacji umożliwia efektywną transfekcję pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego, a także stabilną i trwałą ekspresję transgenu i wydzielanie białek. Ogólnym celem jest opracowanie komórkowej terapii addycji genów do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki, która wymaga stabilnego i trwałego wydzielania terapeutycznie aktywnego białka.Procedurę zademonstrują Anne Freialdenhoven i Antje Schiefer, medyczne asystentki techniczne z laboratorium. Aby przygotować plazmidowe DNA do pierwotnej elektroporacji ludzkich komórek RPE, użyj spektrofotometru mikroobjętościowego do ilościowego określenia zawartości plazmidowego DNA i dostosuj stężenie do 250 nanogramów na mikrolitr w 10-milimolowym Tris-HCL. Wymieszaj jedną objętość 250 nanogramów na mikrolitr plazmidowego DNA transpozazy SB100X z 16 objętościami 250 nanogramów na mikrolitr transpozonu plazmidowego DNA pochodzącego z nabłonka barwnikowego.Dodaj dwa mikrolitry powstałej mieszaniny osocza do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej z bezpiecznym zamkiem na lodzie i napełnij probówkę buforową trzema mililitrami buforu E. Następnie włóż probówkę do stacji pipetowej, aż usłyszysz kliknięcie i ustaw urządzenie do transfekcji na 1,100 woltów, szerokość impulsu 20 milisekund i dwa impulsy. Przygotowanie ogniw do elektroporacji. Najpierw sprawdź morfologię pierwotnych kultur komórek RPE za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby ocenić ich wzrost i konfluencję.Potraktuj komórki 500 mikrolitrami 0,05% trypsyny EDTA na studzienkę przez siedem do 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki się odłączą, zbierz komórki przez odwirowanie, ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS i odwiruj od 1 do 10 razy 10 do czterech porcji komórek na reakcję transfekcji. Zawiesić osady w 11 mikrolitrach buforu R na probówkę i dodać dwa mikrolitry przygotowanej mieszaniny plazmidów do każdej probówki.Włóż głowicę pipety do transfekcji do końcówki transfekcyjnej o pojemności 10 mikrolitrów, aż zacisk całkowicie podniesie trzpień mocujący tłoka i załaduj roztwór komórek i plazmidu do końcówki transfekcyjnej. Włóż pipetę do transfekcji do rurki buforowej umieszczonej w stacji pipetowej, aż usłyszysz kliknięcie, a następnie naciśnij przycisk start, aby rozpocząć proces elektroporacji. Po transfekcji ostrożnie wyjmij pipetę do transfekcji ze stacji pipetowania i natychmiast odpipetuj roztwór komórki i plazmidu do przygotowanych dołków płytki do hodowli komórkowej.Aby oczyścić znakowany przez niego nabłonek barwnikowy, białka fuzyjne pochodzące z supernatantów z hodowli komórek RPE. Najpierw użyj końcówki do cięcia ukośnego, aby zebrać jedną 30-mikrolitrową podwielokrotność zawiesiny niklu NTA na próbkę i osadzać żywicę niklową NTA przez odwirowanie. Ostrożnie ponownie zawiesić żywicę niklowo-NTA z 200 mikrolitrami buforu inkubacyjnego One X i dwukrotnie zagnieździć roztwór z dodatkowym odwirowaniem.Po drugim odwirowaniu ostrożnie ponownie zawiesić granulki żywicy niklowej NTA z 40 mikrolitrami buforu inkubacyjnego Four X na próbkę. Następnie zmieszać 55 mikrolitrów jednej podwielokrotności wstępnie przetworzonej zawiesiny niklowej NTA z 260 mikrolitrami buforu inkubacyjnego Four X i 900 mikrolitrami każdego transfekowanego supernatantu do hodowli komórek RPE. Inkubować mieszaninę na wytrząsarce na kołyszącym się wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 60 minut i ponownie zagnieździć mieszaniny żywicy niklowo-NTA.Ostrożnie ponownie zawiesić granulki w 175 mikrolitrach buforu inkubacyjnego One X i odwirować mieszaniny jeszcze dwa razy. Po drugim odwirowaniu ostrożnie ponownie zawiesić granulki żywicy niklowo-resztkowej NTA w 30 mikrolitrach buforu elucyjnego na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem i ponownie odwirować próbki. Następnie ostrożnie zebrać supernatanty i wymieszać je z buforem do próbek Two X SDS w celu analizy oczyszczonych białek we krwi zachodniej.Hodowane pierwotne komórki RPE wyizolowane z ludzkich oczu dawcy wykazują typową morfologię brukową niezależnie od wieku dawcy, czasu pośmiertnego izolacji czy czasu hodowli. Zastosowanie krótkotrwałych impulsów elektrycznych do pierwotnych ludzkich komórek RPE. Stosowanie systemu transfekcji kapilarnej nie wpływa negatywnie na morfologię nabłonka.Zachodnia analiza krwi transfekowanych pierwotnych supernatantów z ludzkich komórek RPE wykazuje wydzielanie czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego na stałym poziomie bez wyciszania transgenu przez ponad 500 dni. Jak zaobserwowano w tej reprezentatywnej analizie krwi zachodniej pożywki do hodowli komórkowych z seryjnie wykonywanych transfekcji, po 21 dniach od transfekcji obserwuje się ogólnie wyższą szybkość wydzielania czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego. W badanej hodowli długotrwałe podwyższone wydzielanie PEDF utrzymuje się przez co najmniej 165 dni.Ponadto kwantyfikacja oparta na teście ELISA ujawnia 20-krotny wzrost całkowitego wydzielania czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego w transfekowanych pierwotnych ludzkich komórkach RPE w porównaniu z odpowiednimi nietransfekowanymi komórkami kontrolnymi. Przyrost ten został również potwierdzony na poziomie ekspresji genów, przy którym całkowita ekspresja PEDF została zwiększona ponad 30-krotnie. Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby użyć komórek nabłonka barwnikowego, których morfologia odpowiada statusowi In Vivo.Należy również pamiętać o tym, aby pobrać roztwór komórkowy do końcówki transfekcyjnej bez pęcherzyków powietrza. Stabilnie transfekowane komórki mogą być wykorzystywane w różnych modelach Ex Vivo lub In vivo w celu sprawdzenia funkcjonalności tej komórkowej terapii dodawania genów.

electroporation-based-genetic-modification-primary-human-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Opisujemy metodę modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą transgenu przy użyciu niewirusowego systemu transpozonu piggyBac. Limfocyty T zmodyfikowane z wykorzystaniem systemu transpozonu piggyBac wykazują stabilną ekspresję transgenu.

Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

Ten film demonstruje procedurę generowania neuronów ruchowych poprzez transfekcję ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii.

Edycja genów za pośrednictwem transpozonów PiggyBac w ludzkich iPSC: procedura integracji genu zainteresowania w ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi.  W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji.  Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Przedstawiamy protokół rozwoju i wykorzystania modelu stresu oksydacyjnego poprzez traktowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocąH2O2, analizując morfologię komórek, żywotność, gęstość, glutation i poziom UCP-2. Jest to użyteczny model do badania działania przeciwutleniającego białek wydzielanych przez komórki transpozonowe w celu leczenia zwyrodnienia neuroretinalnego.

Indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Poznaj elektroporację pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego z wykorzystaniem systemu transpozonów Sleeping Beauty. Ta metoda umożliwia stabilną ekspresję transgenu i sekrecję białek terapeutycznych w leczeniu chorób zwyrodnieniowych siatkówki.

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty (Wideo) | JoVE Journal

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Przeglądaj więcej filmów