Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Metoda ta demonstruje opartą na elektroporacji transfekcję pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty, co jest dowodem na ekspresję transgenu i wydzielanie białek. Połączenie Sleeping Beauty Transposon System i elektroporacji umożliwia efektywną transfekcję pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego, a także stabilną i trwałą ekspresję transgenu i wydzielanie białek. Ogólnym celem jest opracowanie komórkowej terapii addycji genów do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki, która wymaga stabilnego i trwałego wydzielania terapeutycznie aktywnego białka.

Procedurę zademonstrują Anne Freialdenhoven i Antje Schiefer, medyczne asystentki techniczne z laboratorium. Aby przygotować plazmidowe DNA do pierwotnej elektroporacji ludzkich komórek RPE, użyj spektrofotometru mikroobjętościowego do ilościowego określenia zawartości plazmidowego DNA i dostosuj stężenie do 250 nanogramów na mikrolitr w 10-milimolowym Tris-HCL. Wymieszaj jedną objętość 250 nanogramów na mikrolitr plazmidowego DNA transpozazy SB100X z 16 objętościami 250 nanogramów na mikrolitr transpozonu plazmidowego DNA pochodzącego z nabłonka barwnikowego.

Dodaj dwa mikrolitry powstałej mieszaniny osocza do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej z bezpiecznym zamkiem na lodzie i napełnij probówkę buforową trzema mililitrami buforu E. Następnie włóż probówkę do stacji pipetowej, aż usłyszysz kliknięcie i ustaw urządzenie do transfekcji na 1,100 woltów, szerokość impulsu 20 milisekund i dwa impulsy. Przygotowanie ogniw do elektroporacji. Najpierw sprawdź morfologię pierwotnych kultur komórek RPE za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby ocenić ich wzrost i konfluencję.

Potraktuj komórki 500 mikrolitrami 0,05% trypsyny EDTA na studzienkę przez siedem do 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki się odłączą, zbierz komórki przez odwirowanie, ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS i odwiruj od 1 do 10 razy 10 do czterech porcji komórek na reakcję transfekcji. Zawiesić osady w 11 mikrolitrach buforu R na probówkę i dodać dwa mikrolitry przygotowanej mieszaniny plazmidów do każdej probówki.

Włóż głowicę pipety do transfekcji do końcówki transfekcyjnej o pojemności 10 mikrolitrów, aż zacisk całkowicie podniesie trzpień mocujący tłoka i załaduj roztwór komórek i plazmidu do końcówki transfekcyjnej. Włóż pipetę do transfekcji do rurki buforowej umieszczonej w stacji pipetowej, aż usłyszysz kliknięcie, a następnie naciśnij przycisk start, aby rozpocząć proces elektroporacji. Po transfekcji ostrożnie wyjmij pipetę do transfekcji ze stacji pipetowania i natychmiast odpipetuj roztwór komórki i plazmidu do przygotowanych dołków płytki do hodowli komórkowej.

Aby oczyścić znakowany przez niego nabłonek barwnikowy, białka fuzyjne pochodzące z supernatantów z hodowli komórek RPE. Najpierw użyj końcówki do cięcia ukośnego, aby zebrać jedną 30-mikrolitrową podwielokrotność zawiesiny niklu NTA na próbkę i osadzać żywicę niklową NTA przez odwirowanie. Ostrożnie ponownie zawiesić żywicę niklowo-NTA z 200 mikrolitrami buforu inkubacyjnego One X i dwukrotnie zagnieździć roztwór z dodatkowym odwirowaniem.

Po drugim odwirowaniu ostrożnie ponownie zawiesić granulki żywicy niklowej NTA z 40 mikrolitrami buforu inkubacyjnego Four X na próbkę. Następnie zmieszać 55 mikrolitrów jednej podwielokrotności wstępnie przetworzonej zawiesiny niklowej NTA z 260 mikrolitrami buforu inkubacyjnego Four X i 900 mikrolitrami każdego transfekowanego supernatantu do hodowli komórek RPE. Inkubować mieszaninę na wytrząsarce na kołyszącym się wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 60 minut i ponownie zagnieździć mieszaniny żywicy niklowo-NTA.

Ostrożnie ponownie zawiesić granulki w 175 mikrolitrach buforu inkubacyjnego One X i odwirować mieszaniny jeszcze dwa razy. Po drugim odwirowaniu ostrożnie ponownie zawiesić granulki żywicy niklowo-resztkowej NTA w 30 mikrolitrach buforu elucyjnego na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem i ponownie odwirować próbki. Następnie ostrożnie zebrać supernatanty i wymieszać je z buforem do próbek Two X SDS w celu analizy oczyszczonych białek we krwi zachodniej.

Hodowane pierwotne komórki RPE wyizolowane z ludzkich oczu dawcy wykazują typową morfologię brukową niezależnie od wieku dawcy, czasu pośmiertnego izolacji czy czasu hodowli. Zastosowanie krótkotrwałych impulsów elektrycznych do pierwotnych ludzkich komórek RPE. Stosowanie systemu transfekcji kapilarnej nie wpływa negatywnie na morfologię nabłonka.

Zachodnia analiza krwi transfekowanych pierwotnych supernatantów z ludzkich komórek RPE wykazuje wydzielanie czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego na stałym poziomie bez wyciszania transgenu przez ponad 500 dni. Jak zaobserwowano w tej reprezentatywnej analizie krwi zachodniej pożywki do hodowli komórkowych z seryjnie wykonywanych transfekcji, po 21 dniach od transfekcji obserwuje się ogólnie wyższą szybkość wydzielania czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego. W badanej hodowli długotrwałe podwyższone wydzielanie PEDF utrzymuje się przez co najmniej 165 dni.

Ponadto kwantyfikacja oparta na teście ELISA ujawnia 20-krotny wzrost całkowitego wydzielania czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego w transfekowanych pierwotnych ludzkich komórkach RPE w porównaniu z odpowiednimi nietransfekowanymi komórkami kontrolnymi. Przyrost ten został również potwierdzony na poziomie ekspresji genów, przy którym całkowita ekspresja PEDF została zwiększona ponad 30-krotnie. Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby użyć komórek nabłonka barwnikowego, których morfologia odpowiada statusowi In Vivo.

Należy również pamiętać o tym, aby pobrać roztwór komórkowy do końcówki transfekcyjnej bez pęcherzyków powietrza. Stabilnie transfekowane komórki mogą być wykorzystywane w różnych modelach Ex Vivo lub In vivo w celu sprawdzenia funkcjonalności tej komórkowej terapii dodawania genów.