Name: Zabiegi gonadektomii i pobierania krwi w małym modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Naucz się technik gonadektomii i pobierania krwi u japońskiej medaki Oryzias latipes. Protokół umożliwia badanie roli steroidów płciowych w fizjologii ryb i plastyczności neuroendokrynnej z wysoką przeżywalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Pani Lourdes Carreon G Tan za pomoc w hodowli ryb. Praca ta została sfinansowana przez NMBU, Grants-in-Aid od Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numer grantu 18H04881 i 18K19323) oraz grant na projekty badawcze w zakresie nauk podstawowych od Fundacji Sumitomo dla S.K.

Wszystkie eksperymenty i obchodzenie się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami dotyczącymi dobrostanu zwierząt doświadczalnych na Norweskim Uniwersytecie Nauk Przyrodniczych. Eksperymenty z użyciem gonadektomii zostały zatwierdzone przez Norweski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (FOTS ID 24305).
UWAGA: Eksperymenty zostały przeprowadzone na dorosłych mężczyznach i samicach (6-7 miesięcy, waga ok. 0,35 g, długość ok. 2,7 cm) japońskiej medaki. Płeć została określona poprzez rozróżnienie drugorzędowych cech płciowych, takich jak rozmiar i kształt płetwy grzbietowej i odbytowej, zgodnie z opisem w42,47.
1. Przygotowanie instrumentów i roztworów
<ol>
	<li>Przygotować znieczulający roztwór podstawowy (0,6% trikainy).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 0,6 g trikainy (MS-222) w 100 ml 10x soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS).</li>
		<li>Rozprowadzić 1 ml roztworu podstawowego Tricaine do kilku plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wodę do odzysku (0,9% roztwór NaCl), dodając 18 g NaCl do 2 l wody akwariowej. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj narzędzia do nacinania, łamiąc brzytwę po przekątnej, aby uzyskać ostry punkt (Rysunek 1A).</li>
	<li>Przygotować roztwór antykoagulacyjny krwi (0,05 j./μl heparyny sodu), rozcieńczając 25 μl heparyny sodowej w 500 μl 1x PBS. Roztwór antykoagulantu należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj dwie szklane igły ze szklanej kapilary o długości 90 mm, pociągając szklaną kapilarnę za pomocą ściągacza do igieł (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Średnica zewnętrzna szklanej igły wynosi 1 mm, natomiast średnica wewnętrzna 0,6 mm.</li>
	<li>Przygotuj plastikową pokrywkę w tubie o pojemności 1,5 ml, przecinając pokrywkę i wykonaj otwór, który pasuje do zewnętrznej średnicy igły (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Aby wykonać otwór, podgrzej jeden koniec szklanej kapilary o średnicy 9 mm i wbij podgrzaną szklaną kapilarnę przez pokrywkę. Alternatywnie użyj igły, aby przebić pokrywkę, aż średnica otworu będzie pasować do szklanej kapilary o średnicy 9 mm.</li>
</ol>
2. Procedura gonadektomii
<ol>
	<li>Przygotuj 0,02% roztworu znieczulającego, rozcieńczając jedną probówkę wywaru Trikainy (0,6%) w 30 ml wody akwariowej.</li>
	<li>Przygotuj narzędzia do preparowania, w tym jeden bardzo cienki i dwa cienkie kleszcze (jeden ze stosunkowo szeroką końcówką), małe nożyczki, nylonową nić i maszynkę do golenia, jak opisano w kroku 1.3.</li>
	<li>Znieczulij rybę, umieszczając ją w 0,02% roztworze znieczulającym na 30-60 sekund. 
	UWAGA: Czas trwania znieczulenia zależy od wielkości i wagi ryby i musi być dostosowany. Aby upewnić się, że ryba jest w pełni znieczulona, ciało ryby można delikatnie uszczypnąć za pomocą kleszczy. Jeśli ryba nie zareaguje, można rozpocząć gonadektomię.</li>
	<li>Wyjmij rybę z roztworu znieczulającego i umieść rybę poziomo na boku, poza wodą pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Owariektomia (OVX) u kobiet
	<ol>
		<li>Usuń jaja jajowe (jaja zwisające poza ciałem samicy), jeśli takie występują, i zeskrob łuski w miejscu nacięcia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Delikatnie wykonaj nacięcie o długości około 2-2,5 mm między żebrami, między płetwami brzusznymi i odbytowymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), używając żyletki. Następnie delikatnie uszczypnij brzuch ryby, stopniowo usuwając jajniki za pomocą cienkich kleszczy z szeroką końcówką.</li>
		<li>Odetnij koniec jajników za pomocą cienkich kleszczyków i odłóż jajniki na bok (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
		UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić worka jajnikowego, jeśli to możliwe. Jeśli worek jajnikowy jest uszkodzony, usuń wszelkie ślady gonad tak całkowicie, jak to możliwe, nie pozostawiając nawet żadnych jaj nieowulacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Orchidektomia u mężczyzn
	<ol>
		<li>Delikatnie wykonaj nacięcie między żebrami nad odbytem (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A) i powoli otwórz nacięcie za pomocą cienkich kleszczy.</li>
		<li>Delikatnie chwyć jądra za pomocą cienkich kleszczy i powoli wyjmij jądra. Następnie odetnij koniec jąder, aby całkowicie je usunąć (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). W przypadku męskiej orchidektomii wszystkie preparaty są podobne jak u samic aż do części nacięcia. Podczas chwytania za jądra, czasami uzyskuje się tłuszcz przypominający jądra. Jednak po przywróceniu tłuszczu można spróbować ponownie znaleźć jądra (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
		UWAGA: Zarówno w przypadku samców, jak i samic ważne jest, aby zminimalizować rozmiar nacięcia w jamie brzusznej, aby zapobiec nadmiernym uszkodzeniom, które mogą prowadzić do śmiertelności. Czasami jelita mogą również pojawić się przez nacięcie wraz z gonadami, więc upewnij się, że są one prawidłowo zwrócone do nacięcia przed zamknięciem. Niezbędna jest wcześniejsza wiedza na temat lokalizacji jajników i jąder w jamie brzusznej medaka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zszyj nacięcie podobnie u mężczyzn i kobiet (<silna klasa="xfig">Ryc. 3).
	<ol>
		<li>Umieść nylonową nić obok obszaru nacięcia i przebij skórę od prawej strony nacięcia przez wewnętrzną jamę ciała za pomocą ultracienkich kleszczyków, aby wprowadzić nić cienkimi kleszczami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3; 1-2).</li>
		<li>Przebij skórę od lewej strony nacięcia przez zewnętrzną jamę ciała, aby wyjąć nić ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3; 3-4).</li>
		<li>Zamknij otwór w nacięciu i wykonaj dwa węzły i odetnij nadmiar nici (<silna klasa="xfig">Rysunek 3; 4-6). 
		UWAGA: Szew musi być odpowiednio napięty, a pozostała nić na rybie musi być wystarczająco długa, aby zapobiec poluzowaniu szwu. Cała procedura od znieczulenia do szycia trwa zwykle do 6 minut. Dłuższy czas może prowadzić do śmiertelności.</li>
		<li>Umieść ryby w wodzie regeneracyjnej i pozostaw je na co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem do systemu akwariowego. 
		UWAGA: Ryby poddane gonadektomii zwykle wykazują normalne zachowanie po 1-2 godzinach w wodzie regeneracyjnej. Dlatego, w zależności od celu eksperymentu, można pobrać próbki ryb po tym przedziale czasu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedura pobierania próbek krwi
<ol>
	<li>Przygotuj narzędzia: szklaną igłę, silikonową kapilarę, plastikową probówkę z otworem, pustą plastikową probówkę o pojemności 1,5 ml, miniwirówkę i taśmę.</li>
	<li>Znieczulij rybę za pomocą 0,02% roztworu znieczulającego, jak opisano w kroku 2.1 i umieść rybę pod mikroskopem preparacyjnym w pozycji pionowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A). Umieść rybę na jasnej powierzchni, aby ułatwić wizualizację żyły nakłucia ogonowego.</li>
	<li>Zamontuj szufladę na krew, przymocowując szklaną igłę do silikonowej kapilary (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). Złamać końcówkę igły kleszkami z szeroką końcówką i pokryć wnętrze igły roztworem przeciwzakrzepowym, odsysając i. 
	UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa zaleca się stosowanie przyssawki i silikonowej kapilary o długości co najmniej 50 cm, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu krwi podczas odsysania. Ponadto należy upewnić się, że otwór końcówki igły jest wystarczająco duży, aby umożliwić pobranie krwi.</li>
	<li>Skieruj igłę w stronę szypułki ryby, wyceluj w żyłę szypułki ogonowej (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 5A) i pobierz krew ustami, aż co najmniej jedna czwarta całkowitej objętości igły zostanie wypełniona (<silna klasa = "xfig" > Rycina 5B). 
	UWAGA: Ważne jest, aby przerwać ssanie przed wyjęciem igły z ciała ryby.</li>
	<li>Zwolnij igłę i umieść kawałek taśmy w pobliżu ostrej strony igły. Umieść pokrywkę z otworem na probówce zbiorczej i przełóż igłę do wnętrza rurki przez otwór z końcówką igły na zewnątrz (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5C).</li>
	<li>Umieść ryby w wodzie regeneracyjnej i pozostaw je na co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem do systemu akwariowego. 
	UWAGA: Aby pobrać drugą próbkę krwi od tej samej ryby, należy pobrać próbkę krwi tydzień po pierwszym pobraniu krwi.</li>
	<li>Błyskawicznie odwirowuj pobraną krew przez 1-2 sekundy za pomocą 1,000 x g w temperaturze pokojowej, aby zebrać krew w probówce.</li>
	<li>Przejść bezpośrednio do dalszych aplikacji lub przechowywać krew w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Zapoznaj się z poprzednim badaniem dotyczącym ekstrakcji steroidów płciowych z krwi pełnej48.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak donoszono w poprzedniej literaturze, gonadektomia i pobieranie próbek krwi są od dawna stosowane u innych gatunków modelowych w celu zbadania kwestii związanych z rolą steroidów płciowych w regulacji osi BPG. Jednak techniki te wydają się być możliwe tylko dla większych zwierząt. Biorąc pod uwagę niewielki rozmiar powszechnie używanego modelu teleostu, japońskiej medaki, zapewniamy szczegółowy protokół gonadektomii i pobierania krwi, który jest wykonalny dla tego gatunku.
Fakt, że wskaźnik...

U kręgowców steroidy płciowe, które są głównie wytwarzane przez gonady, odgrywają ważną rolę w regulacji osi mózg-przysadka-gonady (BPG) poprzez różne mechanizmy sprzężenia zwrotnego1,2,3,4,5. Ponadto steroidy płciowe wpływają na proliferację i aktywność neuronów w mózgu6,7,8 oraz komórki endokrynne, w tym gonadotropy, w przysadce mózgowej9,10, a tym samym pełnią kluczową rolę w plastyczności mózgu i przysadki. Pomimo stosunkowo dobrej wiedzy na temat ssaków, mechanizm regulacji osi BPG, w której pośredniczą steroidy płciowe, jest daleki od zrozumienia u gatunków innych niż ssaki, co prowadzi do słabego zrozumienia ewolucyjnie zachowanych zasad11. Nadal istnieje ograniczona liczba badań dokumentujących rolę steroidów płciowych na plastyczność mózgu i przysadki mózgowej, co rodzi potrzebę dalszych badań nad rolą i wpływem steroidów płciowych na różne gatunki kręgowców.
Wśród kręgowców teleosty stały się potężnymi zwierzętami modelowymi w rozwiązywaniu licznych problemów biologicznych i fizjologicznych, w tym reakcji na stres12,13, growth14,15, fizjologia żywieniowa16,17 i reprodukcja2. Teleosty, w których steroidy płciowe są głównie reprezentowane przez estradiol (E2) u samic i 11-ketotestosteron (11-KT) u samców18,19, od dawna są wiarygodnymi modelami eksperymentalnymi do badania ogólnej zasady rozmnażania między gatunkami. Teleosty wykazują wyjątkowość w swoim połączeniu podwzgórze-przysadka20,21 i odrębne komórki gonadotropowe22, które są czasami wygodne do wyjaśnienia mechanizmów regulacyjnych. Co więcej, ze względu na ich przydatność zarówno do eksperymentów laboratoryjnych, jak i terenowych, teleosty oferują wiele zalet w porównaniu z innymi organizmami. Są stosunkowo tanie w zakupie i utrzymaniu23,24. W szczególności małe modele teleostowe, takie jak danio pręgowany (Danio rerio) i medaka japońska (Oryzias latipes), są gatunkami o bardzo wysokiej płodności i stosunkowo krótkim cyklu życiowym umożliwiającym szybką analizę funkcji genów i mechanizmów chorobowych23, zapewniając w ten sposób jeszcze większe korzyści w rozwiązywaniu wielu problemów biologicznych i fizjologicznych, biorąc pod uwagę liczne dobrze opracowane protokoły i zestaw narzędzi genetycznych dostępnych dla tych gatunków25.
W licznych badaniach, usuwanie gonad (gonadektomia) wraz z technikami pobierania krwi było wykorzystywane jako metoda do badania wielu kwestii fizjologicznych, w tym jego wpływu na fizjologię rozrodu kręgowców u ssaków26,27,28, birds29 i30. Chociaż wpływ gonadektomii na fizjologię rozrodu może być alternatywnie naśladowany przez antagonistów steroidów płciowych, takich jak tamoksyfen i klomifen, działanie leków wydaje się być niespójne ze względu na efekty bimodalne31,32. Przewlekła ekspozycja na antagonistę steroidów płciowych może prowadzić do powiększenia jajników33,34, co może uniemożliwić obserwację jego działania w celach długoterminowych ze względu na niezdrowy fenotyp. Ponadto, niemożliwe jest przeprowadzenie eksperymentu regeneracyjnego po leczeniu antagonistami steroidów płciowych, aby zagwarantować specyficzny efekt niektórych steroidów płciowych. Wraz z tymi wyżej wymienionymi punktami, inne kompromisy stosowania antagonistów steroidów płciowych zostały szeroko przeanalizowane31,32. W związku z tym, gonadektomia nadal pojawia się dzisiaj jako potężna technika badania roli sterydów płciowych.
Podczas gdy techniki gonadektomii i pobierania krwi są stosunkowo łatwe do wykonania u większych gatunków, takich jak labraks (Dicentrarchus labrax)35, wargacz błękitnogłowy (Thalassoma bifasciatum)36, koleń (Scyliorhinus canicula)37 i sum (Heteropneustes fossilis i Clarias bathracus)38,39, stanowią wyzwanie, gdy są stosowane u małych ryb, takich jak medaka. Na przykład, użycie Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 jest mniej wykonalne i wydaje się być podatne na nadmierne uszkodzenia fizyczne u małych ryb. Ponadto procedura gonadektomii, która jest powszechnie stosowana u większych ryb40, nie jest odpowiednia dla małych ryb, które wymagają dużej precyzji, aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń. Wreszcie, pobieranie próbek krwi jest trudne ze względu na ograniczony dostęp do naczyń krwionośnych i niewielką ilość krwi u tych zwierząt. Dlatego ważny jest jasny protokół demonstrujący każdy etap gonadektomii i pobierania krwi w małym teleostu.
Ten protokół demonstruje krok po kroku procedury gonadektomii, po której następuje pobieranie krwi u japońskiej medaki, małej słodkowodnej ryby pochodzącej z Azji Wschodniej. Japońska medaka posiada zsekwencjonowany genom, kilka dostępnych narzędzi molekularnych i genetycznych25, oraz genetyczny system determinacji płci pozwalający na badanie różnic płciowych, zanim drugorzędowe cechy płciowe lub gonady zostaną dobrze rozwinięte41. Co ciekawe, japońska medaka posiada zrośnięte gonady w przeciwieństwie do wielu innych gatunków teleostów42. Te dwie techniki w połączeniu zajmują w sumie tylko 8 minut i uzupełnią listę już istniejących protokołów wideo dla tego gatunku, które obejmowały znakowanie naczyń krwionośnych43, patch-clamp na odcinkach przysadki mózgowej44 i brain neurons45, oraz primary cell culture46. Techniki te pozwolą społeczności badawczej na zbadanie i lepsze zrozumienie roli sterydów płciowych w mechanizmach sprzężenia zwrotnego, a także plastyczności mózgu i przysadki w przyszłości.

<table><tbody><tr><td>Kapilara szklana</td><td>GD1</td> Kapilara <td></td><td>szklana z żarnikiem GD-1; Sól</td></tr><tr><td></td><td>sodowa heparyny</td> narishige <td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Ściągacz</td><td></td> igieł <td>P97</td><td>Ściągacz do mikropipet płonący/brązowy Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nić</td><td></td> nylonowa <td>N45VL</td><td>Szew poliamidowy, 0,2 metryczny; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastikowa tubka</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Bezpieczna tubka mikrocentyfugowa 1,5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Żyletka-Astra</td><td></td><td></td> <td>Superior Platinum Double Edge Żyletka Zielona, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Kapilara silikonowa</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Rurka silikonowa Uxcell 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&nbsp;</td></tr><tr><td>Trikaina</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemia</td></tr></tbody></table>

zabiegi gonadektomii i pobierania krwi w małym modelu teleost japońskiej medaka (oryzias latipes)

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Steroidy płciowe, wytwarzane przez gonady, odgrywają istotną rolę w plastyczności tkanki mózgu i przysadki mózgowej oraz w neuroendokrynnej kontroli reprodukcji u wszystkich kręgowców, dostarczając informacji zwrotnych do mózgu i przysadki mózgowej. Ryby teleost mają wyższy stopień plastyczności tkanek i zmienności strategii reprodukcyjnych w porównaniu ze ssakami i wydają się być użytecznymi modelami do badania roli steroidów płciowych i mechanizmów, za pomocą których działają. Usunięcie głównego źródła produkcji sterydów płciowych za pomocą gonadektomii wraz z próbkowaniem krwi w celu pomiaru poziomu sterydów jest dobrze ugruntowane i dość wykonalne u większych ryb i jest potężną techniką do badania roli i skutków sterydów płciowych. Jednak te techniki stwarzają wyzwania w przypadku implementacji w modelach teleostów o małych rozmiarach. Tutaj opisujemy krok po kroku procedury gonadektomii zarówno u mężczyzn, jak i kobiet japońskiej medaki, po której następuje pobranie krwi. Wykazano, że protokoły te są wysoce wykonalne w medaka, co wskazuje na wysoki wskaźnik przeżycia, bezpieczeństwo dla długości życia i fenotypu ryb oraz odtwarzalność pod względem klirensu steroidów płciowych. Zastosowanie tych procedur w połączeniu z innymi zaletami korzystania z tego małego modelu teleostu znacznie poprawi zrozumienie mechanizmów sprzężenia zwrotnego w neuroendokrynnej kontroli rozrodczości i plastyczności tkanek zapewnianej przez steroidy płciowe u kręgowców.

Niniejszy protokół opisuje każdy krok przeprowadzania gonadektomii oraz pobierania krwi u małego modelu ryby kostnoszkieletowej, medaki japońskiej. Przeżywalność ryb po owariektomii (OVX) u samic wyniosła 100% (10 z 10 ryb), natomiast u samców przeżyło 94% (17 z 18 ryb) po orchidektomii. Z kolei po wykonaniu procedury pobrania krwi wszystkie ryby (38 osobników) przeżyły.
U samic z grupy kontrolnej (operacja pozorowana) zaobserwo...

Artykuł opisuje szybki protokół gonadektomii i pobierania próbek krwi od małych ryb teleost, używając japońskiej medaki (Oryzias latipes) jako modelu, w celu zbadania roli sterydów płciowych w fizjologii zwierząt.

Zabiegi gonadektomii i pobierania krwi w małym modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące fizjologicznej funkcji gonad, w tym roli steroidów płciowych w plastyczności i regulacji układu neuroendokrynnego u teleostów i w większym stopniu u kręgowców. Protokół ten umożliwia wykonanie gonadektomii z dużym powodzeniem w małym modelu teleostu medeka, który jest szeroko stosowany w środowisku naukowym. Aby odnieść sukces i osiągnąć wysoki wskaźnik przeżywalności, technika ta wymaga odpowiedniego treningu, szczególnie w zakresie oceny gonad i zszywania ryb.Zacznij od wyjęcia ryby z roztworu znieczulającego i umieszczenia jej poziomo na boku pod mikroskopem preparacyjnym. Aby wykonać jajnikomię u kobiet, zeskrob łuski w miejscu nacięcia. Delikatnie wykonaj od dwóch do 2,5 milimetra nacięcia między żebrami a płetwami brzusznymi i odbytowymi za pomocą żyletki.Delikatnie uszczypnij brzuch ryby, jednocześnie wyjmując jajniki, za pomocą cienkich kleszczy z szeroką końcówką. Ważne jest, aby unikać złamania żeber, które może spowodować śmierć. Odetnij koniec jajników cienkimi kleszkami i odłóż je na bok.Aby wykonać orchidedektomię u mężczyzn, wykonaj nacięcie między żebrami nad odbytem i powoli otwieraj nacięcie za pomocą cienkich kleszczy. Delikatnie chwyć jądra kleszczami i powoli je wyjmij. Następnie odetnij koniec jąder, aby całkowicie je usunąć.Po wykonaniu zabiegu należy zszyć nacięcie podobnie dla mężczyzn i kobiet. Umieść nylonową nić obok obszaru nacięcia i dźgnij skórę od prawej strony nacięcia przez wewnętrzną jamę ciała, używając ultracienkich kleszczyków, aby wprowadzić nić. Następnie nakłuj skórę od lewej strony nacięcia przez zewnętrzną jamę ciała, aby wyjąć nić.Zamknij otwór nacięcia, wykonaj dwa węzły i odetnij nadmiar nici. Umieść ryby w izotonicznej wodzie regeneracyjnej i pozostaw je tam na co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem do systemu akwariowego. Zamontuj szufladę na krew, przymocowując szklaną igłę do silikonowej kapilary.Odłamać końcówkę igły kleszkami z szeroką końcówką i pokryć wnętrze igły roztworem przeciwzakrzepowym przez odsysanie i. Skieruj igłę w stronę szypułki ryby, celując w żyłę szypułki ogonowej i pobieraj krew ustami, aż co najmniej 1/4 całkowitej objętości igły zostanie wypełniona. Zwolnij igłę i umieść kawałek taśmy w pobliżu ostrej strony.Umieść pokrywkę z otworem na probówce zbiorczej i włóż igłę do wnętrza probówki przez otwór z końcówką igły na zewnątrz. Umieść ryby w wodzie regeneracyjnej i pozostaw je tam na co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem do systemu akwariowego. Wiruj krew przez jedną do dwóch sekund z prędkością 1,000 razy G, aby zebrać krew w probówce.Wskaźnik przeżycia po wycięciu jajników (OVX) u kobiet wynosił 100% i 94% u mężczyzn po orchidektomii. Wszystkie ryby przeżyły procedurę pobierania krwi. Samice operowane pozorami pokazywały pozycję OV.Wszystkie jaja zostały zapłodnione i przeszły do rozwoju embrionalnego. Gdy zabieg gonadektomii został wykonany prawidłowo, kształt ciała ryby nieznacznie się zmienił i nie pozostały żadne kawałki gonady. Nacięcie i szew całkowicie zniknęły cztery tygodnie po gonadektomii.Po czterech miesiącach wszystkie ryby nadal wykazywały zdrowy fenotyp i nie znaleziono żadnej tkanki gonadalnej. Analiza krwi u samic wykazała, że poziom E2 u ryb OVX był znacznie niższy niż u ryb operowanych pozorowo 24 godziny po operacji. Po czterech miesiącach poziom E2 u ryb OVX był nadal znacznie niższy niż u ryb pozorowanych.Częściowo ryby OVX, z których usunięto tylko 1/3 do 1/2 gonady, wykazywały znacznie niższe poziomy E2 niż ryby pozorowane i znacznie wyższe poziomy E2 niż ryby w pełni OVX. Stężenie 11-KT u samców poddanych orchidektomii było znacznie niższe niż u ryb operowanych pozorowo 24 godziny po operacji. Po czterech miesiącach poziom 11-KT był nadal niższy niż u ryb pozorowanych.Ryby częściowo poddane storchidektomii wykazywały niższy poziom 11-KT niż ryby operowane pozorami i wyższe poziomy niż ryby w pełni storczydektomizowane. Aby upewnić się, że procedura zakończy się sukcesem, konieczne jest usunięcie gonady tak ostrożnie i całkowicie, jak to możliwe, bez uszkadzania innych narządów wewnątrz ryby. Ponieważ wiadomo, że sterydy płciowe odgrywają ważną rolę w plastyczności komórek mózgu i przysadki mózgowej, technika ta stanowi potężne narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw w małych modelach teleost.

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Medaka i zebrafish są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Niniejszy protokół podkreśla kluczowe punkty niezbędne do skutecznego mikroiniekcji do embrionów medaka, co stanowi istotną technikę w analizach embriologicznych i genetycznych z wykorzystaniem medaka i zebrafish w warunkach laboratoryjnych.

Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

Ze względu na twardy chorion i delikatne embriony, manipulacja zarodkami medaki jest bardziej skomplikowana niż w przypadku danio prążkowanego. W tym filmie zaprezentowano krok po kroku procedury manipulacji embrionami medaki, w tym usuwanie chorionu (dechorionację), unieruchamianie w agarozie do obrazowania oraz transplantację komórek w celu wytworzenia chimer. Procedury te są niezbędne do wykorzystania medaki i danio prążkowanego w laboratorium, aby w pełni skorzystać z ich komplementarnych...

Dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Stadia embrionalne są najbardziej podatne na ksenobiotyki. Chociaż toksyczność chemiczna zależy od zasolenia, nie istnieje żadna metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. W tym miejscu opisujemy nową i wysokoprzepustową metodę określania zależności toksyczności zasolenia dla zarodków wodnych.

Test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj Medaka

Małe ryby laboratoryjne stały się popularnymi modelami do badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw zaburzeń kości u ludzi oraz do badań przesiewowych leków modulujących kości. W niniejszym raporcie opisano protokół oceny wpływu alendronianu na komórki kostne larw medaka ze zmianami osteoporotycznymi.

Leczenie farmakologiczne i obrazowanie in vivo interakcji osteoblast-osteoklast w modelu osteoporozy ryb Medaka

Tutaj prezentujemy protokół izolacji tkanki gonad larw danio pręgowanego, który ułatwi badania różnicowania i utrzymania płci danio pręgowanego.

Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

Badania biologii dostarczają cennych informacji na temat procesów reprodukcyjnych, fizjologicznych, embriologicznych i rozwojowych, które napędzają organizmy wielu grup taksonomicznych. W tym miejscu przedstawiamy obszerny przewodnik po różnych metodologiach, które można wykorzystać do badania kontroli i monitorowania jajników u.

Techniki rozrodu do monitorowania i kontroli jajników u

Zapłodnienie in vitro jest powszechnie stosowaną techniką z różnymi organizmami modelowymi do utrzymania populacji laboratoryjnych i produkcji zsynchronizowanych zarodków do dalszych zastosowań. Tutaj przedstawiamy protokół, który implementuje tę technikę dla różnych populacji meksykańskiej ryby tetra, Astyanax mexicanus.

Pobieranie gamet i zapłodnienie in vitro Astyanax mexicanus

Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.

Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

Ten artykuł opisuje dwie szybkie i skuteczne metody pobierania nasienia od małego modelu rybnego medaka (Oryzias latipes), a także protokół wiarygodnej oceny jakości nasienia za pomocą wspomaganej komputerowo analizy nasienia (CASA).

Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną procedurę szybkiego izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych, zapewniając tym samym wygodną metodę do badań specyficznych dla oocytów.

Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych

Prezentujemy protokół chirurgicznego usunięcia jednego jądra u dorosłego samca X. laevis, co pozwala na wykorzystanie drugiego jądra w późniejszym czasie. Protokół ten ma na celu zmniejszenie liczby samców żab potrzebnych do in vitro zapłodnienia.

Jednostronna Gonadektomia u Dorosłych Samiec Xenopus laevis

Naucz się technik gonadektomii i pobierania krwi u japońskiej medaki Oryzias latipes. Protokół umożliwia badanie roli steroidów płciowych w fizjologii ryb i plastyczności neuroendokrynnej z wysoką przeżywalnością.

Zabiegi gonadektomii i pobierania krwi w małym modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Przeglądaj więcej filmów