Zabiegi gonadektomii i pobierania krwi w małym modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące fizjologicznej funkcji gonad, w tym roli steroidów płciowych w plastyczności i regulacji układu neuroendokrynnego u teleostów i w większym stopniu u kręgowców. Protokół ten umożliwia wykonanie gonadektomii z dużym powodzeniem w małym modelu teleostu medeka, który jest szeroko stosowany w środowisku naukowym. Aby odnieść sukces i osiągnąć wysoki wskaźnik przeżywalności, technika ta wymaga odpowiedniego treningu, szczególnie w zakresie oceny gonad i zszywania ryb.

Zacznij od wyjęcia ryby z roztworu znieczulającego i umieszczenia jej poziomo na boku pod mikroskopem preparacyjnym. Aby wykonać jajnikomię u kobiet, zeskrob łuski w miejscu nacięcia. Delikatnie wykonaj od dwóch do 2,5 milimetra nacięcia między żebrami a płetwami brzusznymi i odbytowymi za pomocą żyletki.

Delikatnie uszczypnij brzuch ryby, jednocześnie wyjmując jajniki, za pomocą cienkich kleszczy z szeroką końcówką. Ważne jest, aby unikać złamania żeber, które może spowodować śmierć. Odetnij koniec jajników cienkimi kleszkami i odłóż je na bok.

Aby wykonać orchidedektomię u mężczyzn, wykonaj nacięcie między żebrami nad odbytem i powoli otwieraj nacięcie za pomocą cienkich kleszczy. Delikatnie chwyć jądra kleszczami i powoli je wyjmij. Następnie odetnij koniec jąder, aby całkowicie je usunąć.

Po wykonaniu zabiegu należy zszyć nacięcie podobnie dla mężczyzn i kobiet. Umieść nylonową nić obok obszaru nacięcia i dźgnij skórę od prawej strony nacięcia przez wewnętrzną jamę ciała, używając ultracienkich kleszczyków, aby wprowadzić nić. Następnie nakłuj skórę od lewej strony nacięcia przez zewnętrzną jamę ciała, aby wyjąć nić.

Zamknij otwór nacięcia, wykonaj dwa węzły i odetnij nadmiar nici. Umieść ryby w izotonicznej wodzie regeneracyjnej i pozostaw je tam na co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem do systemu akwariowego. Zamontuj szufladę na krew, przymocowując szklaną igłę do silikonowej kapilary.

Odłamać końcówkę igły kleszkami z szeroką końcówką i pokryć wnętrze igły roztworem przeciwzakrzepowym przez odsysanie i. Skieruj igłę w stronę szypułki ryby, celując w żyłę szypułki ogonowej i pobieraj krew ustami, aż co najmniej 1/4 całkowitej objętości igły zostanie wypełniona. Zwolnij igłę i umieść kawałek taśmy w pobliżu ostrej strony.

Umieść pokrywkę z otworem na probówce zbiorczej i włóż igłę do wnętrza probówki przez otwór z końcówką igły na zewnątrz. Umieść ryby w wodzie regeneracyjnej i pozostaw je tam na co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem do systemu akwariowego. Wiruj krew przez jedną do dwóch sekund z prędkością 1,000 razy G, aby zebrać krew w probówce.

Wskaźnik przeżycia po wycięciu jajników (OVX) u kobiet wynosił 100% i 94% u mężczyzn po orchidektomii. Wszystkie ryby przeżyły procedurę pobierania krwi. Samice operowane pozorami pokazywały pozycję OV.

Wszystkie jaja zostały zapłodnione i przeszły do rozwoju embrionalnego. Gdy zabieg gonadektomii został wykonany prawidłowo, kształt ciała ryby nieznacznie się zmienił i nie pozostały żadne kawałki gonady. Nacięcie i szew całkowicie zniknęły cztery tygodnie po gonadektomii.

Po czterech miesiącach wszystkie ryby nadal wykazywały zdrowy fenotyp i nie znaleziono żadnej tkanki gonadalnej. Analiza krwi u samic wykazała, że poziom E2 u ryb OVX był znacznie niższy niż u ryb operowanych pozorowo 24 godziny po operacji. Po czterech miesiącach poziom E2 u ryb OVX był nadal znacznie niższy niż u ryb pozorowanych.

Częściowo ryby OVX, z których usunięto tylko 1/3 do 1/2 gonady, wykazywały znacznie niższe poziomy E2 niż ryby pozorowane i znacznie wyższe poziomy E2 niż ryby w pełni OVX. Stężenie 11-KT u samców poddanych orchidektomii było znacznie niższe niż u ryb operowanych pozorowo 24 godziny po operacji. Po czterech miesiącach poziom 11-KT był nadal niższy niż u ryb pozorowanych.

Ryby częściowo poddane storchidektomii wykazywały niższy poziom 11-KT niż ryby operowane pozorami i wyższe poziomy niż ryby w pełni storczydektomizowane. Aby upewnić się, że procedura zakończy się sukcesem, konieczne jest usunięcie gonady tak ostrożnie i całkowicie, jak to możliwe, bez uszkadzania innych narządów wewnątrz ryby. Ponieważ wiadomo, że sterydy płciowe odgrywają ważną rolę w plastyczności komórek mózgu i przysadki mózgowej, technika ta stanowi potężne narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw w małych modelach teleost.