Name: Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj mikrofizjologiczny system do modelowania raka piersi w tkance piersi u ludzi. Ta metoda umożliwia utrzymanie tkanki żywej ex vivo i badanie interakcji z nowotworem, co ma znaczenie dla medycyny spersonalizowanej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core, a także Tulane Histology Core za ich wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant oraz National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Wszystkie ludzkie tkanki zostały pobrane zgodnie z protokołem #9189, zatwierdzonym przez Biuro Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej LSUHSC.
1. Wysiewanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) do arkuszy komórkowych
<ol>
	<li>Kupuj ASC ze źródeł komercyjnych lub izoluj od pierwotnej tkanki piersi ludzkiej, postępując zgodnie z ustalonymi protokołami8,9. Wysiewaj ASC ludzkiej piersi o gęstości 70% (~ 80 000 komórek/cm 2 powierzchni) na 6-dołkowych standardowych płytkach do hodowli tkankowych w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną (BC-MPS Media). Upewnij się, że ASC, które mają być użyte do formowania arkuszy komórek, powinny być mniejsze niż przejście 10.
	<ol>
		<li>Dla każdego dołka systemu mikrofizjologicznego raka piersi (BC-MPS), który zostanie wygenerowany, komórki nasienne w 1 standardowym dołku do hodowli tkankowej i 1 dołku o podobnej wielkości na plastikowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej poli(N-izopropyloakrylamidem) (pNIPAAm). Jedna 6-dołkowa płytka BC-MPS będzie wymagała jednej standardowej płytki 6-dołkowej do hodowli tkankowej (na dole) i jednej płytki pokrytej pNIPAAm (na górze). Płyty pNIPAAm można kupić ze źródeł komercyjnych lub można je pokryć w laboratorium10,11,12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla ASC w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 ° C i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Hoduj ASC, aż staną się w 100% zlewające się i utworzą prążkowany wzór. W zależności od zbiegu, w którym zostały wysiane, zajmie to 7-10 dni. Zlewające się arkusze komórek są wymagane do zakotwiczenia wypornej tkanki tłuszczowej piersi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiałów potrzebnych do BC-MPS
<ol>
	<li>Aby przygotować żelatynę na płytki 6-dołkowe, należy przygotować 12% roztwór żelatyny w destylowanymH2O. Wymieszać 19 g żelatyny typu B (moc żelu ~225 Bloom) i 125 mlH2Ow szklanej butelce o pojemności 250 ml. Dodać 1,6 ml 1 M NaOH do roztworu, aby zneutralizować pH.</li>
	<li>Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu ciekłym przez 25 minut w celu wysterylizowania roztworu.</li>
	<li>Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 37 °C. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 16 ml sterylnego 10x zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) do roztworu, aby uzyskać końcową objętość 160 ml. 
	UWAGA: Roztwór żelatyny można zużyć od razu lub przechowywać w temperaturze pokojowej do późniejszego wykorzystania. Przygotowana żelatyna jest stabilna w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc. Jeśli potrzebnych będzie tylko kilka tłoków, można przygotować 10 ml roztworu i sterylnie przefiltrować go tego samego dnia, co przygotowanie BC-MPS, jak opisano wcześniej7.
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór żelatyny przez sterylizację filtra, rozcieńczyć 1 ml 10x HBSS 9 mlH2O, aby uzyskać 1x roztwór HBSS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 100 μl 1 M NaOH do każdej probówki o pojemności 10 ml, a następnie dodać 0,7 g żelatyny do roztworu. Energicznie wymieszaj roztwór, aby rozpuścić żelatynę.</li>
		<li>Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 75 °C przez 20 minut, wstrząsając co 5 minut. Użyć strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego 0,22 μm, aby przefiltrować roztwór żelatyny. Przefiltrować roztwór żelatyny bezpośrednio na tłoki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drukuj 3D lub użyj prostego akrylu do wykonania tłoków używanych do przenoszenia arkuszy komórek. Upewnij się, że tłoki są luźno dopasowane do pożądanego rozmiaru. Standardowy tłok wydrukowany w 3D jest pokazany na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Tłoki można zaprojektować przy użyciu standardowego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo, takiego jak TinkerCad, i wydrukować za pomocą drukarek 3D z filamentem, które są kompatybilne z kwasem polimlekowym (PLA)13,14.</li>
	<li>Aby przygotować stojak do trzymania tłoków, umieść stojak na probówki o pojemności 15 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść tłoki do góry nogami w stojaku, tak aby spód tłoków był skierowany do góry. Umieść plastikowe pudełko z pokrywką do transportu BC-MPS w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zaleca się, aby pudełko miało co najmniej 35,5 cm długości x 28 cm szerokości x 8,25 cm wysokości, aby zmieściły się 4 tabliczki BC-MPS. Zdejmij pokrywkę z pudełka i spryskaj stojak, tłoki i pudełko 70% EtOH.</li>
	<li>Przygotuj sterylne żyletki i kleszcze przez autoklawowanie lub umieszczając je w komorze bezpieczeństwa biologicznego i myjąc 70% EtOH.</li>
	<li>Spryskaj tłoki i pudełko 70% EtOH i włącz światło UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 30 minut, aby wysterylizować materiały.</li>
</ol>
3. Przygotuj tłoki żelatyny i nałóż na górne arkusze komórek
<ol>
	<li>Jeśli roztwór żelatyny został wcześniej przygotowany, podgrzej go w łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C, aby się rozpuścił.</li>
	<li>Odpipetować roztwór żelatyny na tłoki w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 lub 10 ml. Tłok na 1 dołek z płytki 6-dołkowej będzie wymagał ~2,5 ml żelatyny.</li>
	<li>Gdy żelatyna zastygnie na tłokach (~30-45 min), przenieś płytki ASC pokryte pNIPAAm do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie umieścić tłoki w dołkach płytek ASC pokrytych pNIPAAm, tak aby żelatyna zetknęła się z ASC. Umieść metalową podkładkę (~7.5 g) na tłoku, aby obciążyć tłok tak, aby żelatyna miała bezpośredni kontakt z arkuszem komórek ASC. Pozostawić tłoki na arkuszach komórek ASC w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie przenieś płytkę z tłokami do sterylnego pudełka w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść na niej pokrywkę. Umieść pudełko w lodówce o temperaturze 4 °C na 30 minut. Jeśli lodówka o temperaturze 4 °C nie jest dostępna, umieść talerz na lodzie w wiaderku na lód w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut.</li>
</ol>
4. Przygotowanie linii komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Wysiej linie komórek rakowych w standardowym naczyniu do hodowli tkankowej T75 i trzymaj je w kulturze, aby były ~ 80% zlewające się w dniu, w którym BC-MPS zostanie przetworzony. (~ 200 000 komórek rakowych będzie potrzebnych na BC-MPS). Hoduj komórki rakowe w normalnym podłożu. 
	UWAGA: Aby zidentyfikować i wyizolować komórki rakowe, zaleca się, aby komórki były transfekowane białkiem fluorescencyjnym w celu odróżnienia ich od ASC i tkanki piersi. Liczba komórek rakowych potrzebnych na BC-MPS została zoptymalizowana dla komórek MCF7 i MDA-MB-231. Inne linie komórkowe mogą wymagać dalszej optymalizacji.</li>
	<li>W dniu, w którym przygotowywany jest BC-MPS, należy przenieść kolbę zawierającą komórki rakowe do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Odessać pożywkę z kolby. Umyć kolbę 5 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu do odłączania komórek do kolby zawierającej komórki rakowe, a następnie inkubować kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aż komórki się odłączą (~2-5 min).</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 9 ml PBS do kolby, przenieść komórki z PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować komórki rakowe w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce BC-MPS tak, aby były 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Umieść komórki rakowe w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do dodania do tkanki ludzkiej.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie ludzkiej tkanki piersi
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego umyj ludzką tkankę piersi (HBT) 3x 10 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Użyj sterylnych kleszczyków i żyletki, aby grubo zmielić BC-MPS i spróbuj usunąć jak najwięcej powięzi i tkanki łącznej. Nieusunięcie tkanki łącznej może spowodować, że górna warstwa ASC nie zakotwiczy prawidłowo HBT. 
	UWAGA: Powięź i tkankę łączną można rozpoznać po białym lub przezroczystym wyglądzie w porównaniu z żółtym kolorem tkanki tłuszczowej.</li>
	<li>Po usunięciu tkanki łącznej użyj sterylnej żyletki, aby drobno zmielić tkankę, aż uzyska jednorodną płynną konsystencję. Tkanka jest drobno mielona, gdy można ją łatwo pipetować za pomocą końcówki serologicznej o pojemności 25 ml.</li>
	<li>Użyj sterylnej żyletki, aby odciąć końcówkę końcówki pipety p1000, aby pomóc w pipetowaniu mielonego HBT.</li>
	<li>W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj mielony HBT, linie komórek rakowych i pożywkę BC-MPS (dla 1 dołka z płytki 6-dołkowej wymaga to 200 μl mielonego HBT, 100 μl pożywki BC-MPS i 100 μl komórek rakowych).</li>
	<li>Przenieś płytkę ASC, która będzie używana do dolnego arkusza komórek, z inkubatora do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Zassać pożywkę z dolnej płytki ASC. Odpipetować mieszaninę na środek dołka dolnej płytki ASC za pomocą końcówki pipety p1000, która miała odcięty dystalny koniec od kroku 5.4</li>
	<li>Przenieść pudełko zawierające górną płytkę ASC z umieszczonymi na niej tłokami do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie wyjąć tłoki żelatyny z płytki pokrytej pNIPAAm i umieścić na wierzchu mieszaniny HBT. Dodaj pożywkę BC-MPS do dołka (na 1 dołek z płytki 6-dołkowej dodaj 2 ml pożywki). Ostrożnie przenieś dolne płytki ASC z mieszaniną BC-MPS i tłokami do sterylnego plastikowego pudełka i załóż pokrywę pudełka na czas transportu. 
	UWAGA: Pokrywka płytki 6-dołkowej nie będzie pasować z powrotem do płytki ASC, gdy tłoki są założone. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia kultury.</li>
	<li>Inkubować dolną płytkę w pudełku w inkubatorze w temperaturze 37 ° C, aż żelatyna się rozpuści, a górna warstwa ASC zacznie przylegać do dolnej warstwy (~30 min).</li>
	<li>Przenieś pudełko z płytkami do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie wyjąć tłoki z dolnych płytek. Tkanka z komórkami rakowymi zostanie zakotwiczona na dnie studni.</li>
	<li>Umieścić pokrywkę płytki 6-dołkowej z powrotem na dolnej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C, aby całkowicie stopić żelatynę i pozwolić, aby górna warstwa całkowicie zakotwiczyła się w dolnej warstwie (~30–60 min).</li>
	<li>Delikatnie przenieś płytki do komory bezpieczeństwa biologicznego i odessaj pożywkę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Dodaj 2 ml świeżej pożywki do każdej studzienki. Zassać od krawędzi studzienki i pipetować do krawędzi studzienki, aby uniknąć przemieszczenia tkanki.</li>
	<li>Utrzymuj BC-MPS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez żądany czas i zmieniaj media co 2-3 dni.</li>
</ol>
6. Trawienie BC-MPS do analizy
<ol>
	<li>Gdy BC-MPS jest gotowy do analizy, przenieś płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Usunąć pożywkę za pomocą pipety serologicznej, aby uniknąć przypadkowego przemieszczenia się jakiejkolwiek tkanki.</li>
	<li>Dodaj 1 objętość PBS do każdego dołka.</li>
	<li>Usunąć PBS za pomocą pipety serologicznej.</li>
	<li>Dodaj 1 ml roztworu dysocjacyjnego komórek do każdej studzienki. Przenieść płytkę z powrotem do inkubatora i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby umożliwić odłączenie komórek. W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj skrobaka do komórek, aby całkowicie odłączyć komórki i tkankę od płytki hodowlanej.</li>
	<li>Przenieść roztwór wraz z tkanką do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej. Dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, aby zebrać pozostałe komórki i przenieś ten roztwór do stożkowej probówki. Jeśli ogniwa są fluorescencyjne, owiń rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu w wytrząsarce orbitalnej o stężeniu 1 x g przez 10-20 minut, aby całkowicie oddzielić komórki od tkanki.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj pipety serologicznej, aby rozbić wszelkie pozostałe grudki komórek w probówce i przefiltruj próbkę przez sitko tkankowe o wielkości 250 μm do nowej probówki o pojemności 15 ml. Powoli przetrzeć pipetą roztwór przez sitko, aby się nie przelał.</li>
	<li>Przepłucz sitko 1 ml PBS, aby zebrać wszelkie komórki znajdujące się jeszcze w sitku.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Po odwirowaniu adipocyty będą unosić się na górnej warstwie roztworu, podczas gdy komórki rakowe i ASC zostaną zmieszane ze sobą w granulce na dnie probówki.</li>
	<li>Aby wyizolować adipocyty, delikatnie wlej górną warstwę do nowej probówki lub alternatywnie odetnij końcówkę z końcówki pipety p1000 i przenieś górną warstwę do nowej probówki. Ponownie odwirować próbkę o masie 500 x g przez 5 minut i za pomocą strzykawki i igły usunąć roztwór spod adipocytów, tak aby pozostały tylko adipocyty. Adipocyty są teraz gotowe do analizy</li>
	<li>Po usunięciu adipocytów z roztworu należy oddzielić ASC i komórki rakowe od siebie w celu analizy, jeśli komórki rakowe były wcześniej transfekowane białkiem fluorescencyjnym. Odessać pozostały roztwór z probówki zawierającej ASC i komórki rakowe, nie przerywając pracy osadu komórkowego. Zawiesić osad w pożywce PBS lub BC-MPS i użyć cytometrii przepływowej do posortowania komórek na podstawie fluorescencji.</li>
</ol>

<ol><li>DeSantis, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Breast cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).</li>
<li>NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx">https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx</a> (2020).</li>
<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatistics%22%5BJournal%5D)">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1(2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+tumors+educate+the+proteome+of+stromal+tissue+in+an+individualized+but+coordinated+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner.</a> Science Signaling. 10 (491), (2017).</li>
<li>Lau, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+white+adipose+tissue%3A+A+microphysiological+system+of+primary+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).</li>
<li>Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiologic+platform+for+human+fat%3A+sandwiched+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909(2018).</li>
<li>Yu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adipose-Derived+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells.</a> Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+%27smart%27+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Physics+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Construction+of+a+multicellular+3D+scaffold+for+the+delivery+of+layered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tinkercad%22">Tinkercad</a>. , (2020).</li>
<li>Halfter, K., Mayer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+3D+tumor+models+to+the+clinic+-+predictive+value+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine.</a> Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+staining+of+neutral+lipid+droplets+for+microscopy+and+quantification+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry.</a> Bio-Protocols. 6 (17), 1912(2016).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy%2C+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration.</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Belgodere, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+breast+cancer+microenvironments+and+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+and+lipid+metabolism+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Druso, J. E., Fischbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+of+extracellular+matrix%3A+Linking+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).</li>
<li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts%3A+A+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li>
<li>Chandler, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+adipose+progenitor+cells+as+physicochemical+regulators+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).</li>
<li>Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+breast+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis.</a> The Breast. 22, 66-72 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+1A1+%28COL1A1%29+promotes+metastasis+of+breast+cancer+and+is+a+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target.</a> Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).</li>
<li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li>
<li>Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+use+of+differentiated+adipose-derived+stem+cells+and+mature+adipocytes+to+model+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).</li>
<li>Zimta, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+links+between+central+obesity+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular links between central obesity and breast cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364(2019).</li>
<li>Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+promotes+the+expansion+of+metastasis-initiating+cells+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 104(2018).</li>
<li>Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-adipose+tissue+crosstalk%3A+fuelling+tumour+metastasis+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485(2018).</li>
<li>Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).</li>
<li>Sabol, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+produced+by+obesity-altered+adipose+stem+cells+promotes+metastasis+but+not+tumorigenesis+of+triple-negative+breast+cancer+in+orthotopic+xenograft+and+patient-derived+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models.</a> Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67(2019).</li>
<li>Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human adipose tissues.</a> Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).</li>
<li>Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-on-a-chip+and+body-on-a-chip+systems+for+drug+screening+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling.</a> Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).</li>
<li>Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+microphysiological+tissue+systems+of+cancer+metastasis+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Potrzebne są nowe systemy do modelowania raka piersi u ludzi, aby lepiej zrozumieć tę chorobę. Rozwój ludzkich systemów mikrofizjologicznych do modelowania ustawień chorobowych, które obejmują natywne komórki ECM i zrębu, zwiększy moc predykcyjną badań przedklinicznych. Prezentowany tutaj model BC-MPS jest nowo opracowanym systemem, który pokonuje ograniczenia poprzednich modeli, pozwalając na ocenę BC w jego natywnym środowisku HBT. System ten może być stosowany z liniami komórek rakowych lub z eksplantatami guza i jest...

Każdego roku ponad 40 000 kobiet w USA umiera na raka piersi (BC)1. Pomimo ponad 700 milionów dolarów inwestowanych rocznie w badania nad BC, 97% potencjalnych leków BC nie przechodzi badań klinicznych2,3. Potrzebne są nowe modele, aby poprawić proces opracowywania leków i nasze zrozumienie BC. Program mikrofizjologiczny NIH (MPS) określił cechy wymagane dla przełomowych modeli w celu poprawy przełożenia nauk podstawowych na sukces kliniczny4. Obejmowały one wykorzystanie pierwotnych komórek lub tkanek ludzkich, stabilnych w hodowli przez 4 tygodnie, oraz włączenie natywnej architektury tkankowej i odpowiedzi fizjologicznej.
Obecne modele BC in vitro, takie jak dwuwymiarowa hodowla linii komórkowych BC, kokultura przez infuzję błonową oraz trójwymiarowe sferoidy i organoidy, nie spełniają kryteriów MPS NIH, ponieważ żaden z nich nie podsumowuje natywnej architektury tkanki piersi. Gdy do tych systemów dodaje się macierz zewnątrzkomórkową (ECM), ECM piersi nie jest używany; Zamiast tego stosuje się żele kolagenowe i matryce błony podstawnej.
Obecne systemy in vivo, takie jak ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX), podobnie nie spełniają kryteriów MPS NIH, ponieważ mysie tkanki sutka znacznie różnią się od ludzkich piersi. Co więcej, interakcje układu odpornościowego z BC są coraz częściej uznawane za kluczowe w rozwoju nowotworu, ale mysie modele z obniżoną odpornością używane do generowania guzów PDX nie mają dojrzałych limfocytów T, limfocytów B i komórek NK . Ponadto, podczas gdy PDX pozwala na utrzymanie i rozszerzanie pierwotnych guzów piersi, powstałe guzy PDX są infiltrowane przez pierwotne mysie komórki zrębu i ECM5.
Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy nowatorski, ex vivo, trójwymiarowy MPS ludzkiej piersi, który spełnia kryteria MPS NIH. Podstawa naszego MPS piersi jest tworzona przez umieszczenie pierwotnej ludzkiej tkanki piersi (HBT) między dwoma arkuszami komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC), również wyizolowanych z HBT (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Tłoki do przenoszenia arkuszy komórek do warstwy HBT mogą być drukowane w 3D lub wykonane z prostych tworzyw akrylowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1H, I). Technika ta adaptuje nasze wcześniej opisane podejście do hodowli pierwotnej ludzkiej tkanki białych adipocytów6,7. MPS piersi można następnie zasiać za pomocą wybranego modelu BC, od standardowych linii komórkowych BC po pierwotne ludzkie guzy piersi. Tutaj pokazujemy, że te BC-MPS są stabilne w kulturze przez wiele tygodni (<silna klasa="xfig">Rysunek 2); obejmują natywne elementy HBT, takie jak adipocyty sutka, ECM, śródbłonek, komórki odpornościowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 3); i podsumować fizjologiczne interakcje między BC i HBT, takie jak przesłuchy metaboliczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Na koniec pokazujemy, że BC-MPS pozwala na badanie ruchu ameboidalnego komórek BC w całym HBT (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5).

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>Roztwór do deasfuzji komórek do separacji BC-MPS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>Roztwór do oddzielania komórek do pasażowania komórek</td></tr><tr><td>Pojemnik BioStor 16 uncji</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>do transportu sterylnych tkanek</td></tr><tr><td>Kultura komórkowa Kolby 75 cm</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Do hodowli ASC</td></tr><tr><td>Rurki stożkowe 15mL&nbsp;</td><td>Kleszcze zakrzywione ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>Do manewrowania tkanką podczas mielenia&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM o niskiej zawartości glukozy, z Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>Do hodowli ASC i BC-MPS</td></tr><tr><td>FBS Kwalifikowany</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell 6-dołkowe płytki</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>Top Arkusz komórek ASC</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Długopis/Paciorkowiec 5,000U</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 150 cm</td><td>FisherBrand</td><td>FB0875714</td><td>Do trzymania tkanki podczas mielenia&nbsp;</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>Pojedyncza krawędź do mielenia tkanek</td></tr><tr><td>Sitko 250um&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td><td>Do separacji</td></tr><tr><td>płytek 6-dołkowych</td> BC-MPS Culture <td>Corning</td><td>3506</td><td>Dolna komórka ASC Ciężarki arkuszy</td></tr><tr><td>/podkładki</td><td>BCP Łączniki</td><td>BCP672</td><td>Do ważenia tłoków o średnicy wewnętrznej 1/2"</td></tr></tbody></table>

modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Rak piersi (BC) pozostaje główną przyczyną zgonów kobiet. Pomimo ponad 700 milionów dolarów inwestowanych rocznie w badania nad BC, 97% potencjalnych leków BC nie przechodzi badań klinicznych. W związku z tym potrzebne są nowe modele, które pozwolą nam lepiej zrozumieć tę chorobę. Program NIH Microphysiological Systems (MPS) został opracowany w celu poprawy klinicznego przekładu odkryć z zakresu nauk podstawowych i obiecujących nowych strategii terapeutycznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę generowania MPS dla raka piersi (BC-MPS). Model ten adaptuje wcześniej opisane podejście do hodowli pierwotnej ludzkiej białej tkanki tłuszczowej (WAT) poprzez umieszczanie WAT między arkuszami komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC). Nowatorskie aspekty naszego BC-MPS obejmują wysiewanie komórek BC do zdrowej ludzkiej tkanki piersi (HBT) zawierającej natywną macierz zewnątrzkomórkową, dojrzałe adipocyty, rezydujące fibroblasty i komórki odpornościowe; oraz umieszczanie domieszki BC-HBT między arkuszami ASC pochodzącymi z HBT. Otrzymany BC-MPS jest stabilny w hodowli ex vivo przez co najmniej 14 dni. Ten system modelowy zawiera wiele elementów mikrośrodowiska, które wpływają na BC, w tym adipocyty, komórki zrębu, komórki odpornościowe i macierz zewnątrzkomórkową. W ten sposób BC-MPS może być używany do badania interakcji między BC a jego mikrośrodowiskiem. 
Pokazujemy zalety naszego BC-MPS, badając dwa zachowania BC, o których wiadomo, że wpływają na progresję raka i przerzuty: 1) ruchliwość BC i 2) przesłuch metaboliczny BC-HBT. Podczas gdy ruchliwość BC została wcześniej zademonstrowana za pomocą obrazowania przyżyciowego, BC-MPS pozwala na obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez kilka dni. Ponadto, podczas gdy przesłuch metaboliczny został wcześniej zademonstrowany przy użyciu komórek BC i mysich preadipocytów różnicowanych w niedojrzałe adipocyty, nasz model BC-MPS jest pierwszym systemem, który demonstruje ten przesłuch między pierwotnymi ludzkimi adipocytami sutka a komórkami BC in vitro.

Stabilność w hodowli 
BC-MPS jest stabilnym mikrofizjologicznym systemem, który może być hodowany in vitro przez co najmniej 14 dni. Wykonano obraz w jasnym polu arkuszy komórek ASC przy powiększeniu 100x, aby ukazać prążkowany wzór konfluentnego arkusza (Rysunek 2A). Arkusze komórek ASC są stabilne w hodowli przez co najmniej 4 tygodnie. Obraz BC-MPS po 14 dniach hodowli w jednej studzience płytki 6-dołkowej wykonany kolorową kamerą wykaz...

Ten protokół opisuje budowę mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi in vitro przy użyciu pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z gotowych materiałów.

Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Jest to pierwszy protokół, który pozwala na utrzymanie ludzkiej tkanki piersi przy życiu ex vivo przez dłuższy czas, bezpośrednio umożliwiając badanie interakcji między ludzką tkanką piersi a ludzkim rakiem piersi. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na utrzymanie przy życiu makroskopowych fragmentów ludzkiej tkanki piersi, w tym adipocytów piersi, komórek odpornościowych, struktur naczyniowych, struktur przewodowych i macierzy zewnątrzkomórkowej. Technika ta ma poważne implikacje dla kilku obszarów badań nad rakiem piersi, w tym medycyny spersonalizowanej, rozwoju farmaceutycznego oraz patofizjologii inicjacji nowotworu i wolniejszych procesów raka piersi, takich jak zwłóknienie i przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej.Demonstrują tę procedurę Katherine Hebert, absolwentka Tulane i Rakesh Gurrala, student medycyny z Tulane z mojego laboratorium. Na początek rozpuść przygotowany roztwór żelatyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj pięcio- lub dziesięciomililitrowej pipety serologicznej, aby dozować 2,5 mililitra tego roztworu na każdy tłok do dołków z sześciodołkową płytką.Gdy żelatyna zastygnie, przenieś płytki ASC z kodem pNIPAAm do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie umieścić tłoki w dołkach tych płytek tak, aby żelatyna zetknęła się z ASC. Umieść metalową podkładkę na tłoku, aby go obciążyć, tak aby żelatyna pozostawała w bezpośrednim kontakcie z arkuszem ASC przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Delikatnie przenieś płytkę z tłokami do sterylnego pudełka w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść na niej pokrywkę. Przenieś pudełko do lodówki o czterech stopniach lub umieść talerz na lodzie i wiaderku na lód w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umyj ludzką tkankę piersi trzykrotnie 10 mililitrami sterylnego PBS.Użyj sterylnych kleszczyków i żyletki, aby grubo zmielić BC-MPS i spróbuj usunąć jak najwięcej powięzi i tkanki łącznej. Po usunięciu tkanki łącznej użyj sterylnej żyletki, aby na koniec zmielić tkankę, aż uzyska jednorodną płynną konsystencję. Odetnij końcówkę końcówki pipety P1000, aby ułatwić pipetowanie zmielonej tkanki.W probówce o pojemności 1,5 mililitra połącz tkankę mieloną, linie komórek rakowych i pożywkę BC-MPS, jak opisano w rękopisie tekstowym. Przenieś płytkę ACS, która będzie używana do dolnego arkusza komórek, z inkubatora do szafy bezpieczeństwa biologicznego i odessaj pożywkę z płytki. Za pomocą naciętej końcówki pipety odpipetować przygotowaną mieszaninę tkanek piersi na środek dołka dolnej płytki ACS, a następnie przesunąć pudełko zawierające górną płytkę ACS z tłokami do szafki bezpieczeństwa biologicznego.Delikatnie wyjąć tłoki żelatyny z płytki pokrytej pNIPAAm i umieścić je na wierzchu mieszaniny tkankowej. Dodaj pożywkę BC-MPS do studzienki i ostrożnie przenieś dolne płytki ACS z mieszaniną BC-MPS i tłokami do sterylnego plastikowego pudełka. Umieść pokrywę pudełka na czas transportu, uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia kultury.Inkubować dolną płytkę w pudełku i inkubator o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż żelatyna się rozpuści, a górna warstwa ACS zacznie przylegać do dolnej warstwy. Następnie przenieś pudełko z płytkami do szafki bezpieczeństwa biologicznego, delikatnie wyjmij tłoki z dolnych płytek, aby obserwować tkankę z komórkami rakowymi zakotwiczonymi na dnie studni. Umieścić pokrywkę płytki sześciodołkowej z powrotem na dolnej płytce i inkubować w temperaturze 37 stopni, aby całkowicie stopić żelatynę i pozwolić górnej warstwie zakotwiczyć się w dolnej warstwie.Delikatnie przenieś płytki do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odessaj pożywkę od krawędzi studzienki za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej. Dodaj dwa mililitry świeżego podłoża na krawędź każdego dołka, aby uniknąć przemieszczenia tkanki. Utrzymuj BC-MPS w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez żądany czas.Wymiana nośnika co dwa do trzech dni. Przenieś płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego, gdy BC-MPS jest gotowy do analizy. Usunąć pożywkę za pomocą pipety serologicznej, aby uniknąć przypadkowego przemieszczenia się jakiejkolwiek tkanki.Dodaj jedną objętość PBS do każdej studzienki. Następnie usunąć PBS za pomocą pipety serologicznej. Dodaj jeden mililitr roztworu do dysocjacji komórek do każdej studzienki i przenieś płytkę z powrotem do inkubatora na pięć minut, aby umożliwić odłączenie komórek.Po inkubacji użyj skrobaka do komórek, aby całkowicie odłączyć komórki i tkankę od płytki hodowlanej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś roztwór z tkanką do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i zbierz pozostałe komórki, dodając dwa mililitry PBS. Owiń probówkę folią aluminiową, jeśli komórki są fluorescencyjne.Inkubować probówkę pod kątem 37 stopni pod ciągłym mieszaniem w wytrząsarce orbitalnej w momencie G przez 10 do 20 minut, aby całkowicie oddzielić komórki od tkanki. W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj pipety serologicznej, aby rozbić wszelkie pozostałe grudki komórek w probówce. I przefiltruj próbkę przez sitko tkankowe o średnicy 250 mikrometrów do nowej 15-mililitrowej probówki.Przepłucz sitko jednym mililitrem PBS, aby zebrać pozostałe komórki. Odwiruj próbki w temperaturze 500 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby oddzielić adipocyty, które będą unosić się w górnej warstwie, od komórek rakowych i ASC zmieszanych ze sobą w osad. Przenieś warstwę adipocytów do nowej rurki za pomocą tępo naciętej końcówki pipety.Ponownie odwirować próbkę i za pomocą strzykawki i igły usunąć pozostały roztwór spod adipocytów. Odessać pozostały roztwór z probówki zawierającej ASC i komórki rakowe, nie przerywając pracy osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad w pożywce PBS lub BC-MPS i użyć cytometrii przepływowej do posortowania komórek na podstawie fluorescencji.Wzór wspomagany prążkiem zlewającego się arkusza ASC jest pokazany tutaj. Wyporna ludzka tkanka piersiowa była nadal stabilna, zakotwiczona przez arkusze komórek ASC na dnie studni po 14 dniach hodowli. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykazują stabilność BC-MPS z liniami komórkowymi MDA-MB-231 eksprymującymi RFP po 14 dniach i z potrójnie ujemnym PDX eksplantacji guza przez co najmniej sześć dni.BC-MPS zawierający tkankę piersi hodowano in vitro przez 14 dni, barwiono i obrazowano w celu zademonstrowania natywnych elementów tkanki przy 100-krotnym i 20-krotnym powiększeniu. Barwienie markerów makrofagów zastosowano w celu wykazania zachowania pierwotnych makrofagów po trzech i siedmiu dniach w hodowli. Analiza cytometrii przepływowej komórek MDA-MB-231 barwionych metodą Bodipy po 14 dniach wykazała minimalną akumulację lipidów w hodowli 2D oraz rozległą akumulację lipidów i BC-MPS.Odsetek lipidowo-dodatnich komórek MDA-MB-231 był 26,2 razy większy w hodowli BC-MPS niż w 2D. Komórki hodowane w BC-MPS wykazywały zwiększoną liczbę kropelek lipidów w porównaniu z komórkami hodowanymi w standardowej hodowli 2D. Zdjęcia poklatkowe RFP oznaczone BC-MPS komórkami MDA-MB-231 wykazały ruch ameboidalny 231 komórek z pseudostrąkami i wysoką ruchliwością.Tkanka piersi musi być rozdrobniona na tyle drobno i na tyle oddzielona, aby można ją było rozprowadzić na dnie studzienki. Tkanka piersi jest bardzo wyporna i jeśli kawałki są zbyt duże lub skupione zbyt blisko siebie, arkusze komórek ASC nie będą w stanie zakotwiczyć tkanki piersi na dnie studzienki. Powstałe w ten sposób konstrukty raka tkanki piersi mogą być poddawane trawieniu enzymatycznemu w celu wyizolowania określonych typów komórek będących przedmiotem zainteresowania.Pozwoli to na znalezienie odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak to, w jaki sposób komórki rakowe w tkance piersi reagują inaczej na chemioterapię w porównaniu z tradycyjną hodowlą 2D lub organoidami.

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowaliśmy oparty na kolagenie test in vitro, który stymuluje proliferację i inwazję w próbkach wszystkich podtypów raka piersi. Do wizualizacji i kwantyfikacji ekspansji guza wykorzystano optyczną tomografię projekcyjną, będącą techniką mikroskopii trójwymiarowej. Test ten może być wykorzystywany do ilościowej oceny odpowiedzi na leki w poszczególnych próbkach guzów.

Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Opracowaliśmy nowatorski model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi. Opiera się na mikrostrukturach tkankowych wyizolowanych z chirurgicznych próbek tkanki piersi, które zachowują architekturę tkanki, interakcje międzykomórkowe i sygnalizację parakrynną.

Model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Aby zbadać progresję guza jajnika w fizjologicznie istotnym modelu, wielokomórkowe sferoidy zostały wyhodowane w mikrourządzeniu pod symulowanym przepływem płynu. Ten dynamiczny model 3D emuluje środowisko wewnątrzotrzewnowe z komponentami komórkowymi i mechanicznymi, w których dochodzi do przerzutów raka jajnika.

Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Poznaj mikrofizjologiczny system do modelowania raka piersi w tkance piersi u ludzi. Ta metoda umożliwia utrzymanie tkanki żywej ex vivo i badanie interakcji z nowotworem, co ma znaczenie dla medycyny spersonalizowanej.

Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

Przeglądaj więcej filmów