Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego
23 kwietnia 2021
Ten protokół opisuje budowę mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi in vitro przy użyciu pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z gotowych materiałów.
Jest to pierwszy protokół, który pozwala na utrzymanie ludzkiej tkanki piersi przy życiu ex vivo przez dłuższy czas, bezpośrednio umożliwiając badanie interakcji między ludzką tkanką piersi a ludzkim rakiem piersi. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na utrzymanie przy życiu makroskopowych fragmentów ludzkiej tkanki piersi, w tym adipocytów piersi, komórek odpornościowych, struktur naczyniowych, struktur przewodowych i macierzy zewnątrzkomórkowej. Technika ta ma poważne implikacje dla kilku obszarów badań nad rakiem piersi, w tym medycyny spersonalizowanej, rozwoju farmaceutycznego oraz patofizjologii inicjacji nowotworu i wolniejszych procesów raka piersi, takich jak zwłóknienie i przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej.
Demonstrują tę procedurę Katherine Hebert, absolwentka Tulane i Rakesh Gurrala, student medycyny z Tulane z mojego laboratorium. Na początek rozpuść przygotowany roztwór żelatyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj pięcio- lub dziesięciomililitrowej pipety serologicznej, aby dozować 2,5 mililitra tego roztworu na każdy tłok do dołków z sześciodołkową płytką.
Gdy żelatyna zastygnie, przenieś płytki ASC z kodem pNIPAAm do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie umieścić tłoki w dołkach tych płytek tak, aby żelatyna zetknęła się z ASC. Umieść metalową podkładkę na tłoku, aby go obciążyć, tak aby żelatyna pozostawała w bezpośrednim kontakcie z arkuszem ASC przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Delikatnie przenieś płytkę z tłokami do sterylnego pudełka w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść na niej pokrywkę. Przenieś pudełko do lodówki o czterech stopniach lub umieść talerz na lodzie i wiaderku na lód w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umyj ludzką tkankę piersi trzykrotnie 10 mililitrami sterylnego PBS.
Użyj sterylnych kleszczyków i żyletki, aby grubo zmielić BC-MPS i spróbuj usunąć jak najwięcej powięzi i tkanki łącznej. Po usunięciu tkanki łącznej użyj sterylnej żyletki, aby na koniec zmielić tkankę, aż uzyska jednorodną płynną konsystencję. Odetnij końcówkę końcówki pipety P1000, aby ułatwić pipetowanie zmielonej tkanki.
W probówce o pojemności 1,5 mililitra połącz tkankę mieloną, linie komórek rakowych i pożywkę BC-MPS, jak opisano w rękopisie tekstowym. Przenieś płytkę ACS, która będzie używana do dolnego arkusza komórek, z inkubatora do szafy bezpieczeństwa biologicznego i odessaj pożywkę z płytki. Za pomocą naciętej końcówki pipety odpipetować przygotowaną mieszaninę tkanek piersi na środek dołka dolnej płytki ACS, a następnie przesunąć pudełko zawierające górną płytkę ACS z tłokami do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
Delikatnie wyjąć tłoki żelatyny z płytki pokrytej pNIPAAm i umieścić je na wierzchu mieszaniny tkankowej. Dodaj pożywkę BC-MPS do studzienki i ostrożnie przenieś dolne płytki ACS z mieszaniną BC-MPS i tłokami do sterylnego plastikowego pudełka. Umieść pokrywę pudełka na czas transportu, uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia kultury.
Inkubować dolną płytkę w pudełku i inkubator o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż żelatyna się rozpuści, a górna warstwa ACS zacznie przylegać do dolnej warstwy. Następnie przenieś pudełko z płytkami do szafki bezpieczeństwa biologicznego, delikatnie wyjmij tłoki z dolnych płytek, aby obserwować tkankę z komórkami rakowymi zakotwiczonymi na dnie studni. Umieścić pokrywkę płytki sześciodołkowej z powrotem na dolnej płytce i inkubować w temperaturze 37 stopni, aby całkowicie stopić żelatynę i pozwolić górnej warstwie zakotwiczyć się w dolnej warstwie.
Delikatnie przenieś płytki do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odessaj pożywkę od krawędzi studzienki za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej. Dodaj dwa mililitry świeżego podłoża na krawędź każdego dołka, aby uniknąć przemieszczenia tkanki. Utrzymuj BC-MPS w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez żądany czas.
Wymiana nośnika co dwa do trzech dni. Przenieś płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego, gdy BC-MPS jest gotowy do analizy. Usunąć pożywkę za pomocą pipety serologicznej, aby uniknąć przypadkowego przemieszczenia się jakiejkolwiek tkanki.
Dodaj jedną objętość PBS do każdej studzienki. Następnie usunąć PBS za pomocą pipety serologicznej. Dodaj jeden mililitr roztworu do dysocjacji komórek do każdej studzienki i przenieś płytkę z powrotem do inkubatora na pięć minut, aby umożliwić odłączenie komórek.
Po inkubacji użyj skrobaka do komórek, aby całkowicie odłączyć komórki i tkankę od płytki hodowlanej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś roztwór z tkanką do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i zbierz pozostałe komórki, dodając dwa mililitry PBS. Owiń probówkę folią aluminiową, jeśli komórki są fluorescencyjne.
Inkubować probówkę pod kątem 37 stopni pod ciągłym mieszaniem w wytrząsarce orbitalnej w momencie G przez 10 do 20 minut, aby całkowicie oddzielić komórki od tkanki. W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj pipety serologicznej, aby rozbić wszelkie pozostałe grudki komórek w probówce. I przefiltruj próbkę przez sitko tkankowe o średnicy 250 mikrometrów do nowej 15-mililitrowej probówki.
Przepłucz sitko jednym mililitrem PBS, aby zebrać pozostałe komórki. Odwiruj próbki w temperaturze 500 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby oddzielić adipocyty, które będą unosić się w górnej warstwie, od komórek rakowych i ASC zmieszanych ze sobą w osad. Przenieś warstwę adipocytów do nowej rurki za pomocą tępo naciętej końcówki pipety.
Ponownie odwirować próbkę i za pomocą strzykawki i igły usunąć pozostały roztwór spod adipocytów. Odessać pozostały roztwór z probówki zawierającej ASC i komórki rakowe, nie przerywając pracy osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad w pożywce PBS lub BC-MPS i użyć cytometrii przepływowej do posortowania komórek na podstawie fluorescencji.
Wzór wspomagany prążkiem zlewającego się arkusza ASC jest pokazany tutaj. Wyporna ludzka tkanka piersiowa była nadal stabilna, zakotwiczona przez arkusze komórek ASC na dnie studni po 14 dniach hodowli. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykazują stabilność BC-MPS z liniami komórkowymi MDA-MB-231 eksprymującymi RFP po 14 dniach i z potrójnie ujemnym PDX eksplantacji guza przez co najmniej sześć dni.
BC-MPS zawierający tkankę piersi hodowano in vitro przez 14 dni, barwiono i obrazowano w celu zademonstrowania natywnych elementów tkanki przy 100-krotnym i 20-krotnym powiększeniu. Barwienie markerów makrofagów zastosowano w celu wykazania zachowania pierwotnych makrofagów po trzech i siedmiu dniach w hodowli. Analiza cytometrii przepływowej komórek MDA-MB-231 barwionych metodą Bodipy po 14 dniach wykazała minimalną akumulację lipidów w hodowli 2D oraz rozległą akumulację lipidów i BC-MPS.
Odsetek lipidowo-dodatnich komórek MDA-MB-231 był 26,2 razy większy w hodowli BC-MPS niż w 2D. Komórki hodowane w BC-MPS wykazywały zwiększoną liczbę kropelek lipidów w porównaniu z komórkami hodowanymi w standardowej hodowli 2D. Zdjęcia poklatkowe RFP oznaczone BC-MPS komórkami MDA-MB-231 wykazały ruch ameboidalny 231 komórek z pseudostrąkami i wysoką ruchliwością.
Tkanka piersi musi być rozdrobniona na tyle drobno i na tyle oddzielona, aby można ją było rozprowadzić na dnie studzienki. Tkanka piersi jest bardzo wyporna i jeśli kawałki są zbyt duże lub skupione zbyt blisko siebie, arkusze komórek ASC nie będą w stanie zakotwiczyć tkanki piersi na dnie studzienki. Powstałe w ten sposób konstrukty raka tkanki piersi mogą być poddawane trawieniu enzymatycznemu w celu wyizolowania określonych typów komórek będących przedmiotem zainteresowania.
Pozwoli to na znalezienie odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak to, w jaki sposób komórki rakowe w tkance piersi reagują inaczej na chemioterapię w porównaniu z tradycyjną hodowlą 2D lub organoidami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje konstrukcję in vitro mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi z wykorzystaniem pierwotnej ludzkiej tkanki piersi oraz ogólnodostępnych materiałów. Technika ta umożliwia utrzymanie żywotności ludzkiej tkanki piersi ex vivo, co ułatwia badanie interakcji związanych z rakiem piersi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad rakiem piersi
- Systemy mikrofizjologiczne
- Utrzymanie tkanek ex vivo
Wstęp
- Jest to pierwszy protokół umożliwiający przedłużone utrzymanie tkanki piersi ludzkiej ex vivo.
- Technika ta pozwala na zachowanie różnych składników tkanki piersi, w tym adipocytów i komórek odpornościowych.
- Ma ona istotne znaczenie dla medycyny personalizowanej oraz rozwoju farmaceutyków.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie inicjacji nowotworów oraz procesów takich jak włóknienie.
Cel badania
- Umożliwienie badania interakcji tkanki piersiowej człowieka z rakiem piersi.
- Opracowanie systemu utrzymującego żywotność tkanki na potrzeby badań.
- Poszerzenie wiedzy na temat patofizjologii raka piersi.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu żelatyny do utrzymania tkanki.
- Rozlewanie roztworu do dołków płytki sześciodołkowej.
- Utrzymywanie tkanki w temperaturze 37 °C w celu zapewnienia optymalnych warunków.
- Wykorzystanie pierwotnej tkanki piersi człowieka do ustawień eksperymentalnych.
Główne wyniki
- Protokół ten pozwala na skuteczne utrzymanie żywotności ludzkiej tkanki piersi ex vivo.
- Interakcje między tkanką piersi a nowotworem mogą być skutecznie badane.
- Technika ta zachowuje integralność struktur tkankowych.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w zakresie biologii nowotworów i strategii terapeutycznych.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi istotny postęp w metodologii badań nad rakiem piersi.
- Umożliwia on szczegółowe badania oddziaływań między tkanką a nowotworem.
- Zastosowane podejście może prowadzić do lepszego zrozumienia oraz skuteczniejszego leczenia raka piersi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten mikrofizjologiczny system wypełnia krytyczną lukę w opracowywaniu leków na raka piersi, umożliwiając przedłużoną hodowlę ex vivo pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z zachowaniem natywnych komponentów mikrośrodowiska. Model ten pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki poprzez bezpośrednią obserwację oddziaływań między guzem a zrębem w systemie odpowiadającym warunkom ludzkim. Dzięki zachowaniu adipocytów, komórek odpornościowych, fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej, system zwiększa pewność predykcyjną w ocenie przedklinicznej i ogranicza zależność od słabo przekładalnych modeli 2D lub mysich.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie interakcji w mikrośrodowisku guza z wykorzystaniem pierwotnej tkanki piersi człowieka z natywnymi adipocytami, komórkami zrębowymi i komórkami odpornościowymi.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie mobilności komórek BC oraz metabolicznej komunikacji krzyżowej w kontekście istotnym dla człowieka.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu, wykazując akumulację lipidów i ruch ameboidalny komórek nowotworowych w warunkach fizjologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia stabilną, powtarzalną platformę do wysokorozdzielczego obrazowania time-lapse zachowania komórek nowotworowych przez okres 14 dni.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie tkanki i tworzenie kanapki z arkuszami ASC w celu spójnego odtworzenia mikrośrodowiska w różnych eksperymentach.
- Gotowość do analizy: Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników, takich jak formowanie się kropli lipidowych i mobilność komórek, na potrzeby screeningu związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Wykorzystuje pierwotne ludzkie adipocyty gruczołu piersiowego oraz komórki raka piersi do modelowania interakcji metabolicznych, których nie obserwuje się w kokulturach adipocytów mysich.
- Ciągłość przedkliniczna: Utrzymuje żywotność tkanki przez 14 dni, co umożliwia prowadzenie podłużnych badań nad inicjacją guza, włóknieniem oraz przebudową macierzy pozakomórkowej.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Pozwala na porównanie odpowiedzi komórek rakowych na chemioterapię w warunkach tkanki natywnej w zestawieniu z hodowlami 2D.
Integracja potoku i przepływu pracy
System BC-MPS wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, stanowiąc pomost o istotności ludzkiej pomiędzy modelami in vitro a badaniami in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oddziaływań między guzami a zrąbkiem poprzez zachowanie natywnej architektury i składu komórkowego tkanki piersi.
- Screening: Umożliwia standaryzację analiz dzięki powtarzalnemu rozdrabnianiu tkanki, formowaniu arkuszy ASC oraz zakotwiczeniu na bazie żelatyny.
- Analityka: Ułatwia pomiary ilościowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej i barwienia lipidów w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie specyficznych dla ludzi procesów wzajemnego oddziaływania metabolicznego oraz przebudowy tkanki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania patofizjologii raka piersi i odpowiedzi na leki w zestandaryzowanym mikrośrodowisku.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez modelowanie interakcji między rakiem piersi a zrąbem u ludzi z zachowaniem naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej i heterogeniczności komórkowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu tkanki, integracji arkuszy ASC i kontroli warunków środowiskowych (37°C, 5% CO₂).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wykazanie różnic w odpowiedzi na leki w systemach natywnych tkankowo w porównaniu do kultur 2D.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich efektów w złożonym, istotnym dla człowieka mikrośrodowisku.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkankami pierwotnymi, stosowania technik sterylnych oraz montażu mikrofizjologicznych systemów.
- Zależny od dostępu do świeżej tkanki piersi człowieka, mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej oraz linii komórkowych nowotworowych.
- Wymaga aparatury do mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej i dysocjacji tkanek.
- Obejmuje etapy optymalizacji rozdrabniania tkanki oraz kotwiczenia w żelatynie w celu zapobiegania odrywaniu się z powodu wyporności.
- Ograniczony dostępnością tkanki oraz oknem żywotności, co wymaga skoordynowanej logistyki w celu terminowego przetworzenia materiału.
