Name: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj fluorescencyjną hybrydyzację in situ na preparatach DNA Halo do analizy interakcji genomu z nukleoszkieletem w komórkach nowotworowych i z progerią. Ta metoda umożliwia wizualizację chromosomów i telomerów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Profesorowi Michaelowi Bittnerowi za miły dar w postaci sond do malowania ramion chromosomów. Firma LG otrzymała wsparcie w ramach finansowanego ze środków UE projektu EURO-Laminopathies oraz Funduszu Badawczego Brunel Progeria.

<ol><li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+protein+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li>
<li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li>
<li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li>
<li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+chromatin%3A+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li>
<li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li>
<li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li>
<li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+mapping+by+fiber-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li>
<li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+combing%3A+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li>
<li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li>
<li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface%2C+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475(2017).</li>
<li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li>
<li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+integrity+testing%3A+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li>
<li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively%2C+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li>
<li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR%3A+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li>
<li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li>
<li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+More+Hidden+behind+a+%27Classic+Proliferation+Marker%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%2C+expressing+a+novel+SUN1+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li>
<li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li>
<li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li>
<li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMPdb%3A+Database+of+nuclear+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li>
<li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li>
<li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li>
<li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+glossary%3A+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li>
<li>Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Human+Interphase+Chromosomes%22">Human Interphase Chromosomes</a>. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).</li>
<li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda halo DNA jest doskonałą metodą z wyboru podczas analizy interakcji między nukleoszkieletem a genomem, jednak istnieją pewne krytyczne kroki, których również należy przestrzegać. Jednym z najważniejszych parametrów jest optymalizacja gęstości wysiewu komórek. Jeśli komórki staną się nadmiernie zlewne, aureole DNA będą nakładać się na sąsiednie komórki, uniemożliwiając przeprowadzenie analizy. CSK i ekstrakcyjne muszą być zawsze świeże w dniu użycia, a spermina, spermidyna i digitonina są dodawane do buforu ekstrakcyjnego na końcu procesu przygotowania, aby utrzymać ich aktywność biologiczną. W przypadku wykonywania Halo-FISH niezwykle ważne jest użycie prawidłowej temperatury denaturacji halo DNA, aby umożliwić późniejszą hybrydyzację sondy lub farby.
Mikroskopia elektronowa została wykorzystana do wizualizacji matrycy jądrowej, przy czym zidentyfikowano struktury nitkowate20. Jednak mikroskopia elektronowa jest ograniczona, ponieważ nie można łatwo wydedukować asocjacji matrycy z chromatyną. Rzeczywiście, metoda DNA Halo jest bardziej wszechstronna w porównaniu z mikroskopią elektronową, ponieważ można badać określone geny, chromosomy i stany komórek. Ponadto prowadzona jest analiza proteomiczna białek macierzy jądrowej21,22. Ta metoda jest dobra do porównywania składników macierzy jądrowej, szczególnie podczas porównywania chorych komórek, jednak nie zapewnia rozkładu przestrzennego i przyłączeń podkreślonych przez standardową technikę DNA Halo.
Testy DNA Halo mają ograniczenia. Po pierwsze, podczas ekstrakcji matrycy można to wykonać tylko na stałych komórkach, więc obrazowanie na żywo nie jest możliwe. Chociaż metoda DNA Halo jest stosunkowo szybka i łatwa do wykonania, cały proces może być czasochłonny, jeśli weźmie się pod uwagę hodowlę komórkową, generowanie sondy, Halo-FISH i analizę.
Przechwytywanie obrazów DNA Halo i HALO-FISH przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej znacznie poprawiłoby rozdzielczość sond i przeciwciał specyficznych dla DNA. Ponadto, ponieważ fluorochromy mogą być łatwiej rozdzielone spektralnie, możliwe jest użycie wielu sond DNA w jednym eksperymencie, dostarczając jeszcze więcej informacji. Ulepszenia w technikach biologii molekularnej, takie jak wychwytywanie konformacji chromosomów (3C), zostały wykorzystane do określenia interakcji loci genów i analizy organizacji przestrzennej chromatyny w komórce. Testy DNA Halo i 3C mogą być połączone, termin znany jako M3C23, ponownie demonstrując zdolność adaptacji techniki DNA Halo.
Przedstawione tutaj oryginalne dane mają na celu zademonstrowanie możliwości badania zachowań genomu oraz sposobu prezentacji tych danych. Dzięki tym danym wykazaliśmy, że możliwe jest określenie znaczących różnic w przyłączaniu genomu za pomocą (1) sond do malowania chromosomów, w tym badaniu ujawniając, że chromosom 18 jest najmniej przyłączonym chromosomem spośród analizowanych (Figura 3); (2) Loci genów ze znacznymi różnicami między dwoma loci genów i (ryc. 4) (3) telomerami, które są słabiej przyłączone w komórkach w stanie spoczynku w porównaniu z komórkami proliferacyjnymi i starszymi (ryc. 5). Jesteśmy w stanie rozróżnić komórki proliferujące i nieproliferujące poprzez obecność markera proliferacji antygenu Ki67, który jest białkiem nierozpuszczalnym, więc pozostaje z resztkowymi jądrami lub wykorzystując włączenie nukleotydów do podświetlenia komórek, które przeszły przez fazę S w określonym czasie (ryc. 2). Technika ta umożliwiła nam również analizę zachowania genomu w komórkach, które są naruszone w swoich nukleoszkieletach, tj. komórkach laminopatii, a tutaj i w Bikkul i in., 2018 ujawniamy, że genom może być mniej ściśle związany w porównaniu z komórkami kontrolnymi i może zostać przywrócony podczas leczenia specyficznymi lekami, które łagodzą efekt mutacji laminy A w klasycznych komórkach HGPS15. Jednak pokazujemy tutaj nowe dane dla nietypowych komórek AGO8466 HGPS, pozbawionych mutacji laminy A, ale zawierających niezwykłą formę białka kompleksu LINC SUN119 , w którym chromosom 13 jest mniej ściśle związany (ryc. 6).
HALO-FISH to unikalna metoda, która umożliwia badanie interakcji genomowych z nukleoszkieletem w połączeniu z immunofluorescencją pośrednią w celu rozwiązania białek, które nie zostały usunięte z procedury ekstrakcji. Wykazano, że nukleoszkielet jest modyfikowany w różnych chorobach, takich jak niektóre typy nowotworów19 oraz znaczenie niektórych białek związanych z nukleoszkieletem jako biomarkerów diagnostycznych24,25. Tak więc technika ta odgrywa ważną rolę w badaniu wpływu nukleoszkieletu na organizację/dezorganizację chromatyny w chorobie 15,24,25,27 i nie ogranicza się do komórek ludzkich, z sondami do malowania chromosomów od innych zwierząt, można zastosować ten sam protokół DNA-halo28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

"Matryca jądrowa" została po raz pierwszy opisana przez Berezneya i Coffeya w 1974 roku1. Po przeprowadzeniu ekstrakcji z wysoką molowością soli i leczeniu nukleazą jąder wątroby szczura, zidentyfikowali białkowy szkielet strukturalny. Procedura halo DNA została następnie zaadaptowana z tej metody i polega na usunięciu rozpuszczalnych białek, tak aby przetrwała tylko macierz jądrowa (NM) oraz białka i chromosomy związane z NM. Regiony przyłączania DNA znajdują się u podstawy pętli DNA i nazywane są regionami przyłączonymi do macierzy (MAR) lub regionami przyłączenia rusztowania (SAR), które są odporne odpowiednio na ekstrakcję wysokimi stężeniami soli i jonowym detergentem lit-3,5-dijodosalicylanem (LIS). W halo DNA DNA związane z MAR / SAR jest związane w jądrze resztkowym, podczas gdy pętle DNA rozciągają się od tych miejsc i tworzą halo DNA. Wiemy teraz, że genom jest zakotwiczony poprzez domeny związane z blaszką (LAD) do blaszki jądrowej oraz poprzez regiony związane z jądrami (NAD) i prawdopodobnie przez inne struktury jądrowe, takie jak określone ciała jądrowe.
Metoda halo DNA może być używana do fizycznego mapowania DNA, genów i regionów chromosomowych, ponieważ rozszerzone DNA i chromatyna zapewniają większą rozdzielczość, ponieważ chromatyna jest pozbawiona histonów, a DNA jest rozciągnięte2,3,4,5,6. Istnieją jednak pewne ograniczenia podczas używania aureoli DNA do tego zastosowania. Na przykład, DNA ściśle związane z resztkowymi jądrami halo DNA może być niedostępne dla sond, co wyklucza jego analizę i mapowanie fizyczne6. Inne techniki, takie jak fiber-FISH2,4,5,7 i molekularne combing8 również umożliwiają mapowanie fizyczne i mają tę zaletę, że są stosunkowo szybkie i łatwe do wykonania. Oba są preferencyjnie używane do mapowania DNA genów w porównaniu z halo DNA. Metody te ekstrahują włókna chromatyny za pomocą ekstrakcji rozpuszczalnikiem lub solą z jądra, jednak czesanie molekularne ma zwykle lepszą odtwarzalność8,9.
Istnieje coraz więcej dowodów na to, że nukleoszkielet odgrywa rolę we wspieraniu kluczowych procesów jądrowych, takich jak miejsca przyczepiania się DNA, przebudowa chromatyny, transkrypcja DNA, naprawa DNA i replikacja DNA11,12. W związku z tym technika halo DNA została opracowana w celu zbadania interakcji między nukleoszkieletem a genomem podczas tych czynności komórkowych i jest rutynowo stosowana i opisywana w badaniach. Technika ta została również wykorzystana do zbadania interakcji między genomem a nukleoszkieletem w odniesieniu do postępu choroby z identyfikowanymi zmianami w strukturze jądrowej związanymi z nowotworem złośliwym11.
Technika halo DNA została również wykorzystana do zbadania związku między genomem a nukleoszkieletem podczas rozwoju i różnicowania12. W wielu badaniach wykorzystano odmianę techniki halo DNA znaną jako halosperm13 lub SpermHalo-FISH w połączeniu z FISH14. Chromatyna plemników jest ściśle związana z białkami znanymi jako protaminy, a technika ta została opracowana w celu poprawy dostępu do DNA plemników. Halosperm został wykorzystany do zbadania integralności DNA plemników i określenia, czy występuje uszkodzenie DNA. Plemniki z mniejszymi uszkodzeniami DNA korelują z większym rozmiarem halo DNA, podczas gdy plemniki ze zwiększonym poziomem pofragmentowanego i uszkodzonego DNA miały albo małe aureole, albo nie miały ich wcale. W związku z tym halosperm może być używany jako potencjalny marker prognostyczny jakości zarodka i udanej ciąży z IVF13. Ten przykład podkreśla potencjalne zastosowania kliniczne tej techniki. W naszej pracy wykorzystaliśmy HALO-FISH do oceny zmian w zachowaniu genomu i wpływu określonych terapii lekowych w chorobie przedwczesnego starzenia się Zespół Progerii Hutchinsona-Gilforda (HGPS)15.
Razem te i inne badania podkreślają szeroki zakres procesów/zastosowań, które technika halo DNA może być wykorzystana do badania i użyteczność techniki.

<table><tbody><tr><td>10X</td><td>PBS Thermo Fisher Scientific</td><td>10388739</td><td>Służy do tworzenia aureoli DNA</td></tr><tr><td>5-bromo-2&prime;-deoksy-urydyna&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>znakowany nukleotyd</td></tr><tr><td>5-fluoro-2&prime;-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>znakowany nukleotyd</td></tr><tr><td>Agar Technical</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15562141</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A939-50G</td><td>Sprawdź rozmiar produktu DOP-PCR i translacji nicków</td></tr><tr><td>Nietypowy typ 2 HGPS fibroblasty (AG08466)</td><td>Coriell Institute</td><td>AG08466</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Bacto tryptone</td><td>Thermo Fisher 16269751 naukowe</td><td></td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>Roche Diagnostics&nbsp;</td><td>11093711103</td><td>Znakowane nukleotydy</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Klasyczne fibroblasty zespołu progerii Hutchinsona-Gilforda (HGPS) (AG06297)&nbsp;</td><td>Coriell Institute</td><td>AG0297</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Słoik Coplin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12608596</td><td>Mieści 5 szkiełek lub 8 szkiełek tyłem do siebie</td></tr><tr><td>Cot-1</td><td>DNA Thermo Fisher Scientific</td><td>15279011</td><td>Blok niespecyficznej hybrydyzacji w</td></tr><tr><td>wodzie uzdatnionej HALO FISH DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4030</td><td>Mieszanina hybrydyzacyjna</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Składnik buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-dUTP&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11093088910</td><td>znakowane nukleotydy</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz Cy3</td><td>Jackson Laboratory</td><td>715-165-150</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>Składnik buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>Składnik buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>443611</td><td>Wytrącanie sondy i HALO FISH</td></tr><tr><td>Płodowy układ bydlęcy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Surowica do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10523525</td><td>2D RYBA z aureolami DNA</td></tr><tr><td>Wełna szklana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18421</td><td>Kolumna wirująca</td></tr><tr><td>Plemniki śledzia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7290</td><td>Sonda wytrącająca</td></tr><tr><td>HXP&trade; Lampa (lampa mikroskopu metalohalogenkowego)</td><td>OSRAM</td><td>HXP-R120W45C VIS</td><td>Przechwytywanie obrazu halo DNA</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313680</td><td>Czyszczenie szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Zestaw KAPA HiFi PCR Zestaw</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2103</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Leica DM4000 z kamerą DFC365 FX i oprogramowaniem do akwizycji obrazów LAS AF (wersja: 4.5.0).</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Przechwytywanie obrazu halo DNA</td></tr><tr><td>agaru Luria-Bertani&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13274843</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Składnik buforu CSK</td></tr><tr><td>Metanol Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10284580</td><td>Czyszczenie i sterylizacja szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-BrdU</td><td>BD Pharmingen</td><td>B2531-100UL</td><td>Wizualizacja BrdU</td></tr><tr><td>Surowicy</td> <td>dla noworodkówThermo Fisher Scientific</td><td>16010159</td><td>Surowica do hodowli komórkowych i odczynnik blokujący</td></tr><tr><td>Zestaw do translacji Nicka Woda</td> klasy <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>PCR i izolacja DNA klonów BAC Startery</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>RURY Sigma-Aldrich</tr><tr><td></td><td></td><td>P1851</td><td>Składnik CSK i</td></tr> <tr>ekstrakcyjnych<td>Octan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>QuadriPERM&reg; 4 X 12</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6077.307</td><td>Kwadratowe naczynie do hodowli komórkowych, polistyren z czterema komorami. Ma hydrofobową powierzchnię, jest sterylny, niepirogenny/endotoksyczny i niecytotoksyczny.</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-Ki67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1007-25UL</td><td>Marker proliferacji</td></tr><tr><td>Rnaza A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Cement kauczukowy</td><td>Halford's</td><td>101836</td><td>2D RYBA DNA halos</td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6022-25G</td><td>Kolumna wirowa</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Opady sondy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>Składnik CSK, ekstrakcyjnych i SSC</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td>Składnik buforu SSC</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu&nbsp;</td><td></td><td>L3771-100G</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Składnik buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4264</td><td>Składnik buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Streptawidyna-Cy3&nbsp;</td><td>Amersham Life Sciences Ltd, Laboratorium Naukowe Dostarcza</td><td>pa43001</td><td>Przeciwciało sondy</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Składnik buforu CSK</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Bufor CSK + A66: D68</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe SuperFrost & trade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12372098</td><td>Szkiełka mikroskopowe: grubość 1 mm, długość 76 mm, szerokość 26 mm. Niepowlekane.</td></tr><tr><td>Anty-królik trzody chlewnej TRITC&nbsp;</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TELO-PNA FISH KIT</td><td>Agilent Dako</td><td>K532511-8</td><td>Wyznaczanie telomerów</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253-100G</td><td>Bufor kolumnowy</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>Składnik buforu CSK</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Fisher Izolacja DNA</td><td>10158962</td> DNA <td>klonów BAC</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416- 100ML</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Uchwyt Vectashield zawierający DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>2D RYBA z aureolami DNA</td></tr><tr><td>Sondy chromosomów całych ludzkich</td><td>Calbiochem</td><td></td><td>2D FISH of DNA halo</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10108202</td><td>Izolacja DNA klonów BAC</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach dna halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Genom jest powiązany z kilkoma strukturami wewnątrz jąder komórkowych, w celu regulacji jego aktywności i zakotwiczenia go w określonych miejscach. Struktury te są zbiorczo znane jako nukleoszkielet i obejmują blaszkę jądrową, jąderka i ciała jądrowe. Chociaż istnieje wiele wariantów fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do badania genomu i jego organizacji, są one często ograniczone rozdzielczością i dostarczają niewystarczających informacji na temat związku genomu ze strukturami jądrowymi. Metoda halo DNA wykorzystuje wysokie stężenia soli i niejonowe detergenty do generowania pętli DNA, które pozostają zakotwiczone w strukturach w jądrach poprzez regiony przyłączeniowe w genomie. Tutaj ekstrahowane są rozpuszczalne białka jądrowe, takie jak histony, lipidy i DNA, które nie są ściśle związane z macierzą jądrową. Prowadzi to do powstania aureoli nieprzyłączonego DNA otaczającego szczątkowe jądro, które samo w sobie zawiera DNA ściśle związane z wewnętrznymi strukturami jądrowymi i białkami odpornymi na ekstrakcję. Te rozszerzone nici DNA umożliwiają zwiększenie rozdzielczości i mogą ułatwić mapowanie fizyczne. W połączeniu z FISH, metoda ta ma dodatkową zaletę polegającą na badaniu interakcji genomowych ze wszystkimi strukturami, w których genom jest zakotwiczony. Technika ta, nazwana HALO-FISH, jest bardzo wszechstronna, dzięki której halo DNA może być sprzężone z sondami kwasów nukleinowych w celu ujawnienia loci genów, całych chromosomów, satelity alfa, telomerów, a nawet RNA. Technika ta zapewnia wgląd w organizację i funkcję jądra w normalnych komórkach oraz w postępie choroby, takiej jak rak.

Ta metoda przygotowania halo DNA pomogła nam w dążeniach do określenia różnic w zachowaniu genomu w komórkach młodych i starych, a także w komórkach pochodzących z chorób przedwczesnego starzenia z aberracyjnymi białkami nukleoszkieletu15. Rysunek 1 przedstawia przykłady halo DNA, na których można dostrzec krawędź pozostałego jądra, DNA pozostające wewnątrz jądra resztkowego oraz nieprzypisane DNA, które rozwinęło się do otaczającego obszaru, tworząc halo DNA. Przedstawiono na nim również analizę pokazującą, w jaki sposób uzyskuje się jądro resztkowe, oraz pomiary NE i CTE. Możliwe jest rozróżnienie między komórkami proliferującymi a nieproliferującymi poprzez włączenie znakowanego nukleotydu, takiego jak BrdU, gdy komórki znajdują się w fazie S, lub zastosowanie diagnostycznego markera proliferacji anty-pKi67, który ujawnia jąderka oraz obszary heterochromatyny w komórkach G117,18. Komórki pierwotne hodowane w wysokim stężeniu surowicy bez osiągnięcia konfluencji, które są negatywne pod kątem markerów proliferacji, uznaje się za senescencyjne. Komórki pierwotne hodowane w niskim stężeniu surowicy lub takie, które stały się konfluencyjne, tzn. zahamowane kontaktowo, a są negatywne pod kątem markerów proliferacji, uznaje się za spoczywające (quiescent) i zdolne do ponownego wejścia w cykl proliferacyjny przy zapewnieniu odpowiednich składników odżywczych i warunków. Możliwość rozróżnienia między komórkami Ki67-dodatnimi a Ki67-ujemnymi pozwoliła nam określić różnice między proliferującymi, spoczywającymi i senescencyjnymi ludzkimi fibroblastami skóry. Rysunek 2 przedstawia halo DNA proliferujących ludzkich fibroblastów skóry, wytworzone z komórek, do których podczas replikacji DNA włączono BrdU (mechanizm ten nie zachodzi w komórkach nieproliferujących), a następnie zabarwione przeciwciałem anty-BrdU. Barwienie markerem proliferacji przeciwciałem anty-pKi67 jest również widoczne na Rysunku 2. Jest to stabilny antygen, który przetrwa protokół FISH, zatem barwienie może być wykonane po FISH i przed montowaniem preparatu. W związku z tym komórki proliferujące są dodatnie (czerwone) dla BrdU i anty-pKi67 (czerwone) w lewej kolumnie, natomiast komórki nieproliferujące, a konkretnie komórki senescencyjne na Rysunku 2, są przedstawione w prawej kolumnie. Zielone sygnały to poszczególne telomery ujawnione za pomocą zestawu telomere PNA FISH/FITC. Połączenie immunofluorescencji z halo DNA umożliwia analizę w różnych stanach komórkowych, co pokazano na Rysunku 2 podczas badania komórek proliferujących, spoczywających i senescencyjnych. W zależności od wybranego przeciwciała można badać inne stany, takie jak różnicowanie, uszkodzenia DNA w wyniku napromieniowania itp.
Terytoria chromosomów mogą być również wizualizowane w obrębie halo DNA przy użyciu metody FISH. Ze względu na sposób przygotowania preparatu, który umożliwia rozwijanie się DNA z jąder, kształt terytorium chromosomowego może ulec zaburzeniu, a w halo DNA może znajdować się mniejsza lub większa ilość chromosomu, w zależności od zakotwiczenia genomu wewnątrz pozostałości jądra i jego struktur. Rycina 3 przedstawia panel halo DNA, w którym poszczególne chromosomy zostały uwidocznione za pomocą specyficznych sond do malowania całych ramion chromosomów (czerwony) dla chromosomów 1, 13, 17 i 18. Przeciwciało anti-pKi67 (zielony) zostało użyte do oznaczenia komórek proliferujących, a jego brak w tej samej kulturze, na tym samym szkiełku, wskazuje na komórki senescencyjne. Z obrazów oraz danych przedstawionych jako CTE/NE wyraźnie wynika, że mały, ubogi w geny chromosom 18 posiada niewiele punktów przyczepienia i rozwija się dalej w halo DNA, z dala od pozostałości jąder, znajdując się znacznie dalej od centrum pozostałości jąder niż pozostałe chromosomy. Jest to jednak prawdą również w przypadku chromosomu 1. Dzięki zastosowaniu markera proliferacji anti-pKi67 możliwe było porównanie komórek proliferujących z komórkami senescencyjnymi w obrębie tej samej kultury i na tym samym szkiełku; analiza ta wykazała, że chromosomy w tych dwóch bardzo różnych stanach komórkowych nie różnią się znacząco od siebie pod względem przyczepienia do pozostałych struktur jądrowych.
Interesujące jest to, że geny wykazują również statystycznie istotne różnice między komórkami proliferującymi a starzejącymi się pod względem pozostawania w jądrze resztkowym lub lokalizacji w halo DNA. Rysunek 4 demonstruje to za pomocą loci genowych wyznaczonych przez znakowane sondy BAC w kolorze czerwonym oraz przeciwciała anty-Ki67 w kolorze zielonym. Po przygotowaniu halo DNA nie stwierdzono istotnych różnic w lokalizacji genów między komórkami proliferującymi a starzejącymi się. Jednak w halo DNA znajduje się istotnie więcej loci kateniny alfa 1 CTNNA1 niż loci cykliny D1 CNDD1, których jest bardzo mało. Rysunek 5 przedstawia preparaty halo DNA z telomerami w kolorze zielonym. Tło pozostawiono celowo na wysokim poziomie, aby umożliwić wizualizację sygnałów telomerowych w obrębie halo DNA. W tym zestawie danych uwzględniono komórki spoczynkowe, tj. komórki poddane 7-dniowemu głodzeniu surowiczemu; interesujące jest to, że w komórkach spoczynkowych występuje istotnie więcej nieprzymocowanych telomerów zlokalizowanych w halo DNA niż w komórkach proliferujących i starzejących się. Na Rysunku 5a można zaobserwować proporcję telomerów w halo DNA, szczególnie na obrazie „Experiment 2”. Odpowiada to Rysunkowi 5b, gdzie średni procent telomerów w halo DNA wynosi około 17% w komórkach spoczynkowych. Istnieją dowody na to, że nie wszystkie telomery w komórkach starzejących się są widoczne, ponieważ niektóre z nich mogą być bardzo krótkie.
Ta metoda tworzenia halo DNA pozwoliła nam skutecznie badać zmiany w oddziaływaniach genomowych w obrębie jąder komórek chorobowych15. Rysunek 6 przedstawia różnice w przytwierdzeniu chromosomów w pierwotnych fibroblastach kontrolnych oraz w komórkach chorobowych z typowym (mutacja laminy A) i atypowym zespołem progerii Hutchinsona-Gilforda, wykazujących ekspresję innej izoformy SUN1 i brak mutacji laminy A19. Chromosomy 1 i 13 wykazują statystycznie istotne różnice w przytwierdzeniu w obrębie pozostałych jąder w porównaniu z kontrolnymi halo DNA. Rysunek 6b koreluje położenie całego terytorium chromosomu z pozostałym jądrem i halo DNA. Wartości równe 1 lub mniejsze wskazują, że chromosom znajduje się w obrębie pozostałego jądra, natomiast wartości powyżej 1 wskazują na obecność chromosomów lub ich fragmentów w obrębie halo DNA.
Podsumowując, podkreśla to użyteczność metody HALO-FISH w badaniu interakcji genomicznych całych chromosomów, konkretnych genów i telomerów w różnych warunkach wpływających na cykl komórkowy (proliferację, spoczynek i starzenie się) lub w komórkach chorobowo zmienionych, np. w liniach komórkowych progerii i nowotworów. Różnice w interakcjach między tymi stanami sugerują, że nukleoszkielet odgrywa istotną rolę w regulacji kluczowych procesów wewnątrz jądra komórkowego.
<img alt="Halo DNA, jądro szczątkowe; obraz z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący NE, wyniki analizy spektralnej CTE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ekstrahowane jądro HDF wykazujące jądro szczątkowe i halo DNA oraz przegląd metody analizy. (a) Jądro HDF przygotowane za pomocą testu halo DNA i przeciwbarwione DAPI. Intensywnie zabarwione jądro szczątkowe pokazuje DNA zakotwiczone w cyto-szkielecie jądrowym, otoczone przez niezakotwiczone DNA, które tworzy halo DNA. Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Kanał niebieski rejestruje jądro zabarwione DAPI i otaczające je DNA. Jądro szczątkowe zostaje wyselekcjonowane i usunięte przy użyciu programu ImageJ. Strzałka przedstawia odległość od centrum jądra do krawędzi jądra szczątkowego (NE). (c) Kanał czerwony pokazuje sygnał sondy. (d) Obraz oznaczony jako „Result” jest wynikiem nałożenia kanału czerwonego na obraz z kanału niebieskiego; pozwala to wyznaczyć odległość od centrum jądra do najdalszej krawędzi terytorium chromosomowego (CTE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza proliferacji i starzenia się komórek; mikroskopia fluorescencyjna, barwienie Anti-BrdU, Anti-pKi67." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przygotowanie halo DNA z telomerycznym PNA FISH na proliferujących i starzejących się HDF. Telomeryczny PNA FISH na komórkach HDF poddanych analizie halo DNA. Sygnały telomerów są widoczne na zielono (FITC), pozostałe DNA oraz halo DNA zostały zabarwione DAPI (niebieski), a proliferujące jądra wykryto przy użyciu przeciwciał anti-BrdU lub anti-pKi67 metodą pośredniej immunofluorescencji na czerwono (TRITC). Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, analiza chromosomów, barwienie pKi67, proliferacja, wykres słupkowy starzenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Interakcje nukleoszkielet-chromosom i analiza z wykorzystaniem testu halo DNA. (a) 2D-FISH z sondami specyficznymi dla chromosomów 1, 13, 15, 17 i 18 przeprowadzony na HDF poddanych preparatyce halo DNA. Całe chromosomy zostały zabarwione na czerwono (Cy3), a jądra przebadano pod kątem pKi67, aby określić, czy są one proliferującymi, czy starzejącymi się. Komórki proliferujące (pKi67+) zaznaczono na zielono (FITC), natomiast komórki starzejące się pozostały niezabarwione (pKi67-), tj. nie wykryto sygnału zielonego. Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Zakotwiczenie chromosomów przez nukleoszkielet w proliferujących i starzejących się HDF, które poddano HALO-FISH. Pomiary przedstawiają stosunek krawędzi terytorium chromosomu (CTE) znajdującej się najdalej do odpowiadającej jej krawędzi jądra (NE) dla chromosomów 1, 13, 15, 17 i 18 w komórkach proliferujących (pKi67+) i starzejących się (pKi67-). Słupki błędów reprezentują ± SEM. (c) Zmodyfikowany wykres pudełkowy przedstawiający stosunek krawędzi terytorium chromosomu (CTE) do odpowiadającej jej krawędzi jądra (NE) specyficznych chromosomów w jądrach pKi67+ i pKi67-. Q1 = dolny kwartyl; Min = najniższa odnotowana wartość; Med = mediana; Max = maksymalna odnotowana wartość; Q3 = górny kwartyl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Badanie DNA komórek proliferujących i senescencyjnych, obrazy mikroskopowe, wykres ekspresji genów (CCND1, CTNNA1)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Interakcje specyficzne dla genów w komórkach HDF z wykorzystaniem techniki HALO-FISH. (a) Jądra z wyekstrahowanym halo DNA poddano hybrydyzacji z sondami specyficznymi dla genów (CCND1 oraz CTNNA1) w celu zbadania ich zakotwiczenia w błonie jądrowej (NM) w komórkach proliferujących i senescencyjnych. Sygnały genowe przedstawiono w kolorze czerwonym (Cy3), natomiast przeciwciała anty-pKi67 wyznaczają komórki proliferujące, a sygnał ten jest widoczny w kolorze zielonym (FITC). Na obrazie CCND1 dla komórek proliferujących pozostałość jądra znajduje się wewnątrz białego okręgu, a przestrzeń między białym a zielonym okręgiem przedstawia halo DNA. Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Porównanie sygnałów specyficznych dla genów CCND1 oraz CTNNA1 pomiędzy pozostałością jądra a halo DNA, a także pomiędzy komórkami proliferującymi i senescencyjnymi. Słupki błędu reprezentują ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna jąder komórkowych, ekspresja Ki-67 i wykres słupkowy statusu proliferacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza halo DNA w spoczywających komórkach HDF z zastosowaniem PNA-FISH telomerów. (a) Stan spoczynku HDF indukowano poprzez hodowlę w medium z niską zawartością surowicy przez 7 dni. Przeprowadzono analizę halo DNA, a metoda PNA-FISH umożliwiła wizualizację telomerów za pomocą sygnału FITC (zielony); pozostałe jądro oraz otaczające je halo DNA przeciwbarwiono DAPI (niebieski). Komórki barwiono również przeciwciałem anty-pKi67, aby upewnić się, że jądra nie proliferują. Procedurę powtórzono w dwóch niezależnych seriach. Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Porównanie średniego procentu telomerów zlokalizowanych w obrębie halo DNA w proliferujących, senescencyjnych i spoczywających komórkach HDF. Słupki błędu reprezentują ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie i analiza komórkowa; mikroskopia fluorescencyjna DNA (po lewej), porównawczy wykres słupkowy (po prawej)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Badanie zakotwiczenia całych chromosomów w nukleoszkielecie w komórkach HGPS z wykorzystaniem HALO-FISH26. (a) Jądra kontrolnych HDF (2DD), klasycznego HGPS (AG06297) oraz atypowego HGPS typu 2 (AG08466) poddano przygotowaniu halo DNA, a następnie 2D-FISH z użyciem sond malujących całe chromosomy dla chromosomów 1, 13, 15 i 17. Całe chromosomy przedstawiono w kolorze zielonym (FITC), a DNA zbarwiono DAPI (niebieski). Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Położenie chromosomów wewnątrz ekstrahowanych jąder określono poprzez pomiar stosunku średniej krawędzi terytorium chromosomu (CTE) do krawędzi jądra (NE). Stosunek powyżej 1 wykazuje, że najdalej wysunięta CTE znajduje się poza odpowiadającą jej NE w obrębie halo DNA, natomiast stosunek poniżej 1 oznacza, że najdalej wysunięta CTE znajduje się w obrębie NE w pozostałości jądra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składniki</td>
			<td>ObjętośćμL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor do PCR 5XDOP</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszanina dNTP (bez dTTP) (2 mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP(2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotyna-16-dUTP lub Digoksigenina-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPprimer(20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polimeraza Taq DNA (1 U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda do PCR stopnia czystości analitycznego</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szablon</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela przedstawiająca składniki i objętości DOP-PCR dla reakcji 1x
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok </td>
			<td>Cykle </td>
			<td>Temp. (stopnie Celsjusza)</td>
			<td>Czas </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja wstępna </td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja </td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przyłączanie starterów </td>
			<td>62</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie </td>
			<td>72</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ostateczna elongacja </td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 min </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chłodzenie </td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Przytrzymać</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Tabela przedstawiająca cykle, temperatury i profile czasowe DOP-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Objętość(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x bufor NT (0.5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M beta-merkaptoetanol</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X stężenie nukleotydów (0.5 mM dATP, 0.5 mM dCTP, 0.5 mM dGTP, 0.5 mM dTTP, 0.5 mg/ml biotin-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polimeraza I</td>
			<td>5U na μg DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matryca DNA (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda traktowana DEPC</td>
			<td>do 50 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Tabela przedstawiająca składniki i objętości reakcji translacji nacięć dla jednej sondy.

Połączenie preparatów halo DNA z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ umożliwia analizę interakcji genomowych z nukleoszkieletem w wysokiej rozdzielczości. Przyłączony genom prowadzi do zhybrydyzowanych sygnałów fluorescencyjnych zlokalizowanych w resztkowych wyekstrahowanych jądrach, podczas gdy nieprzyłączony genom znajduje się w halo DNA otaczającym resztkowe jądra.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Protokół ten może być używany do oceny przyczepów do nukleoszkieletu, a nie do sekwencjonowania DamID i jest to test pojedynczej komórki. Główną zaletą korzystania z tej metody jest to, że jest ona opłacalna i łatwo dostępna. Może uwypuklić różnice funkcjonalne między genami i chromosomami, które normalnie mogą nie wystąpić w przypadku innych technik wizualizacji.Za pomocą tego protokołu można ocenić przestrzenne i funkcjonalne organizacje w genomie w leczonych komórkach nowotworowych i progerii oraz genomowe różnice behawioralne w komórkach starczych. Metoda ta może być stosowana do każdego typu komórki lub tkanki przez całe życie i każdej choroby. Może być również stosowany w organizmach modelowych, w których dostępne są sondy.Na początek przygotuj 500 mililitrów 10% kwasu solnego i wlej go do dużej zlewki. Wrzuć szkiełka mikroskopowe pojedynczo do kwasu i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce ustawionej na dwa G. Zdekantuj kwas ze zlewki i umyj szkiełka 10 razy w wodzie z kranu. Następnie kolejne 10 razy w wodzie dejonizowanej.Dwukrotnie opłucz szkiełka w metanolu i przechowuj je w metanolu do czasu sterylizacji. Przełóż szkiełka na ręcznik papierowy do wyschnięcia i zawiń je w folię do sterylizacji w autoklawie lub gorącym piekarniku. Hoduj komórki w odpowiednim podłożu z surowicą przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia 60 do 70% zgryzu.Zbierz każdy typ komórek i policz je za pomocą hemocytometru. Wysiewaj się jeden razy 10 do pięciu komórek w 10 mililitrach podłoża na szkiełko. Wyjąć z inkubatora naczynie hodowlane zawierające szkiełka i dołączone komórki.Wyrzuć podłoże i oznacz slajdy ołówkiem. Następnie umieść je w słoiku z kopeliną zawierającym 50 mililitrów lodowatego buforu cytoszkieletu. Inkubuj słoik przez 15 minut na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyrzuć bufor cytoszkieletu i szybko przepłucz szkiełka w 50 mililitrach jednorazowego buforu halo DNA trzy razy, zanurzając je w słoiku z kopiną z buforem. Przenieść szkiełka do słoika z kopinem zawierającego 50 mililitrów buforu ekstrakcyjnego i inkubować przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Następnie kolejno inkubuj szkiełka w 50 mililitrach po 10 razy, pięć razy, dwa razy i jeden raz bufor halo DNA przez jedną minutę każdy.Po zakończeniu zanurz szkiełka w sekwencyjnej serii etanolu 10, 30, 70 i 95% etanolu. Przeprowadź szkiełka przez sekwencyjną serię 50 mililitrów etanolu po 70, 90 i 100% etanolu przez pięć minut każda. Wysuszyć je na powietrzu na płycie grzewczej.Następnie piecz w piekarniku o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Denaturować szkiełka, umieszczając je w 70% roztworze formamidu dwa razy w roztworze SSC na dwie minuty w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Umieść zdenaturowane szkiełka w 50 mililitrach lodowatego 70% etanolu na pięć minut.Następnie przenieś je przez serię etanolu 90, 95 i 100% w temperaturze pokojowej przez pięć minut każda. Po zakończeniu wysusz szkiełka na powietrzu na płycie rozgrzewającej. Denaturacja sond DNA w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 10 minut w gorącym bloku lub łaźni wodnej.Następnie inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie pipetuj 10 mikrolitrów na odpowiednie szkiełko. Przykryj sondę szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 21 na 21 milimetrów i uszczelnij ją cementem gumowym. Inkubuj szkiełka przez minimum 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze hybrydyzacyjnej.Po inkubacji ostrożnie usuń cement gumowy za pomocą kleszczy. Następnie inkubować szkiełka w 50 mililitrach 50% formamidu, dwukrotnie roztworu SSC o pH siedem, który został wstępnie podgrzany do 45 stopni Celsjusza przez trzy pięciominutowe inkubacje. Następnie umieść szkiełka w 50 mililitrach roztworu 0,1 razy SSC, który został wstępnie podgrzany do 60 stopni Celsjusza, ale umieszczony w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza.Inkubować przez pięć minut i dwukrotnie wymieniać bufor na pięciominutowe inkubacje. Umieścić szkiełka w słoiku z kopinem zawierającym 50 mililitrów czterokrotnego roztworu SSC w temperaturze pokojowej i inkubować przez 15 minut z trzema zmianami buforu. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał, nałóż 100 mikrolitrów 4%BSA czterokrotnego roztworu SSC na każde szkiełko i nałóż na nie kawałek folii parafinowej.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie inkubować szkiełka ze 100 mikrolitrami streptawidyny Cy3 rozcieńczonej jeden na 200 przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby wykryć znakowaną sondę. Umieścić szkiełka w słoiku z kopinem zawierającym 50 mililitrów czterokrotnego roztworu SSC w temperaturze pokojowej i inkubować przez 15 minut z trzema zmianami buforu.Zamontuj szkiełka w 20 mikrolitrach roztworu montażowego zawierającego DAPI i nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 50 milimetrów. Wizualizuj halo DNA i terytoria chromosomów za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem olejowym 100X. Przygotowanie halo DNA umożliwia zobaczenie krawędzi jądra resztkowego, DNA pozostałego w jądrze resztkowym oraz nieprzyłączonego DNA, które wydostało się na otaczający obszar.Aureale DNA proliferujących ludzkich fibroblastów skórnych zostały stworzone z komórek z włączonym BRDU, a następnie wybarwione przeciwciałem anty-BRDU. Proliferujące komórki były dodatnie dla BRDU i anty-pKi-67. Protokół ten został wykorzystany do wizualizacji terytoriów chromosomów w halo DNA.Poszczególne chromosomy oznaczono specyficznymi sondami do malowania chromosomów całego ramienia dla chromosomów 1, 13, 17 i 18. Anty-pKi-67 stosowano do oznaczania proliferujących komórek i ich braku w tej samej hodowli. Preparaty halo DNA z telomerami w kolorze zielonym są pokazane tutaj.Możliwe jest zaobserwowanie proporcji telomerów w halo DNA, szczególnie na obrazie z drugiego eksperymentu. Średni odsetek telomerów wynosił około 17% w komórkach w stanie spoczynku. Różnice w przyczepianiu chromosomów wykryto w pierwotnych fibroblastach kontrolnych oraz w chorych komórkach z typowym i atypowym zespołem progerii Hutchinsona-Gilforda, wykazującymi ekspresję innej izoformy Sun1 i brak mutacji Laminy A.Chromosomy pierwszy i 13 wykazują statystycznie istotne różnice w ich przyczepieniu w obrębie jąder resztkowych w porównaniu z kontrolowanymi halo DNA. Położenie całego terytorium chromosomu było skorelowane z resztkowym jądrem i halo DNA. Wypróbowując ten protokół, upewnij się, że komórki są wysiewane w odpowiedniej gęstości i ekstrahowane we właściwym czasie.Po tej procedurze można przeprowadzić immunofluorescencję pośrednią i RNA FISH.

fluorescence-situ-hybridization-on-dna-halo-preparations-to-reveal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Ten protokół ilustruje chemicznie indukowany system dimeryzacji białek w celu tworzenia kondensatów na chromatynie. Pokazano tworzenie ciała jądrowego białaczki promielocytowej (PML) na telomerach za pomocą chemicznych dimeryzatorów. Wzrost, rozpuszczanie, lokalizacja i skład kropel są monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek, immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach

Raportujemy protokół DNA-FISH metafazowej dystrybucji, który wizualnie wykrywa liczbę kopii lokusu i jego lokalizację w genomie. To podejście umożliwia rozdzielczość pojedynczych komórek stanów amplifikacji, szczególnie w liniach komórek nowotworowych zawierających DNA pozachromosomowe i jednorodnie barwiące regiony.

Rozmazy metafazowe DNA-FISH w celu odróżnienia dodatkowego DNA chromosomowego od jednolicie barwiących się regionów w ludzkich liniach komórek nowotworowych

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Poznaj fluorescencyjną hybrydyzację in situ na preparatach DNA Halo do analizy interakcji genomu z nukleoszkieletem w komórkach nowotworowych i z progerią. Ta metoda umożliwia wizualizację chromosomów i telomerów.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów

Przeglądaj więcej filmów