Name: Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Poznaj metodę separacji komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego przy użyciu szklanej kapilary. Technika ta minimalizuje uszkodzenia oocytów i umożliwia badania biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca badawcza była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [32060170, 31601205 i 31560334], projekt naukowy wspierany przez Chińską Radę Stypendialną oraz fundusz Państwowego Kluczowego Laboratorium Ekologii Słodkowodnej i Biotechnologii [2020FB05].

Wszystkie procedury wykonywane w eksperymentach na rybach są zgodne z przepisami Komisji Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Northwest Normal University.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>zwierzęta
	<ol>
		<li>Użyj dorosłej samicy danio pręgowanego o długości ciała 4-6 cm. 
		UWAGA: Użyliśmy danio pręgowanego z lokalnego targu.</li>
		<li>Danio pręgowany należy przechowywać w systemie z cyrkulacją wody o 14-godzinnym cyklu świetlnym i 10-godzinnym cyklu ciemnym w temperaturze około 28 °C.</li>
		<li>Karm ryby dwa razy dziennie nowo wyklutymi krewetkami solankowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ciągnięta szklana kapilara
	<ol>
		<li>Użyj szklanej kapilary o średnicy 15 cm i umieść jej głowicę w palniku alkoholowym, aby ją podgrzać. Chwyć jeden koniec szklanej kapilary ręką, a drugi koniec przytrzymaj kleszczami.</li>
		<li>Po podgrzaniu 5-10 sekund szkło na ogniu palnika alkoholowego staje się czerwone i miękkie. Rozciągnij główkę szklanej kapilary za pomocą kleszczyków, aby otwór kapilarny miał wymaganą średnicę. 
		UWAGA: Średnica zależy od średnic pęcherzyków: prewitellogenne (PV; o średnicy ok. 0,30 mm), wczesne, witellogenne (EV; o średnicy ok. 0,40 mm), midwitellogenne (MV; o średnicy ok. 0,50 mm), późno witellogenne (LV; o średnicy ok. 0,60 mm) i w pełni rozwinięte, ale niedojrzałe (FG; o średnicy ok. 0,65 mm).</li>
		<li>Rozciągnij otwór szklanej kapilary do odpowiedniej średnicy, która jest nieco mniejsza od wielkości oddzielonych pęcherzyków. Szklana kapilara z otworem znacznie większym niż rozmiar pęcherzyków jajnikowych nie może dokonać separacji, ale znacznie mniejsze pękłyby pęcherzyki podczas separacji. Przećwicz kilkakrotnie rozciąganie szklanej kapilary. 
		UWAGA: Czas nagrzewania zależy od wielkości szklanej kapilary. Nie rozciągaj bezpośrednio szklanej kapilary na ogniu palnika alkoholowego. Spowoduje to rozbicie szklanej kapilary.</li>
		<li>Przeciąć szklaną kapilarnę za pomocą noża do ampułek i rozbić szklaną kapilarnę kleszczami, aby uzyskać gładkie nacięcie. 
		UWAGA: Ostry lub złamany otwór szklanej kapilary uszkodziłby mieszki włosowe.</li>
		<li>Za pomocą plastikowej rurki o długości 30 cm włóż końcówkę do pipety o pojemności 1 ml z elementem filtrującym na jednym końcu, włóż ciągniętą szklaną kapilarnę na końcu pipety, a na drugim końcu podłącz końcówkę do pipety o pojemności 200 μl.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Separacja oocytów danio pręgowanego i komórek pęcherzykowych na różnych etapach
<ol>
	<li>Rozwarstwienie jajnika danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Napełnij wiadro z lodem do 4/5 objętości lodem z gnojowicy i dodaj tyle wody dla ryb, aby gnojowica mogła unosić się na wodzie. Odczekaj 2-5 minut, sprawdź temperaturę wody i upewnij się, że temperatura wynosi 2-4 °C.</li>
		<li>Dorosłe samice należy znieczulić, umieszczając ryby w lodowatej wodzie na co najmniej 2-5 minut, aż ryby przestaną poruszać skrzelami. Odetnij głowę rybie, przecinając rdzeń kręgowy za pomocą ostrych nożyczek, aby zapewnić śmierć.</li>
		<li>Umieść rybę na płycie preparacyjnej za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Użyj nożyczek do preparowania, aby ciąć w następujący sposób. Rozetnij od kloaki do skrzeli wzdłuż linii środkowej brzucha. Wyciąć z tyłu kloaki. Przeciąć od przedniego końca do strony grzbietowej. Delikatnie usuń skórę i mięśnie po jednej stronie ciała. Odsłoń narządy wewnętrzne i wyjmij cały jajnik za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Natychmiast delikatnie umieścić jajniki w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm zawierającym 60% pożywki L-15 (L-15) firmy Leibovitz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja pęcherzyków jajnikowych 
	UWAGA: Przyjęty przez nas system etapowania jest oparty na oryginalnej definicji Selman et al.4.
	<ol>
		<li>Ręcznie wyizoluj mieszki włosowe na różnych etapach za pomocą pary cienkich kleszczy, jak opisano wcześniej8.</li>
		<li>Pęcherzyki jajnikowe należy podzielić na następujące etapy: PV, EV, MV, LV i FG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytu od pęcherzyków jajnikowych
	<ol>
		<li>Umieść pęcherzyki jajnikowe na różnych etapach na czystej szalce Petriego zawierającej 60% pożywki L-15.</li>
		<li>Używając wyciągniętej szklanej kapilary z kroku 1.2, zassaj mieszki włosowe do szklanej kapilary na 2-3 cm i wydmuchaj je. 
		UWAGA: Gdy średnica otworu szklanych naczyń włosowatych jest odpowiednia, pęcherzyk można jednokrotnie oddzielić od oocytu przez inhalację.
		<ol>
			<li>Jeśli warstwa komórek pęcherzykowych jest mocno przymocowana do oocytu, powtórz 2-3 razy, aby uzyskać całkowite oddzielenie. Unikaj wielokrotnych prób przepchnięcia pęcherzyka przez mniejszą naczynkę, co mogłoby uszkodzić pęcherzyk. 
			UWAGA: W procesie wdychania i wydmuchiwania warstwa pęcherzykowa odpada i oddziela się od oocytu, a na końcu komórki pęcherzykowe i ogołocone oocyty są oddzielane (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Połącz ogołocone, ale nienaruszone oocyty i zbierz ocalałe oocyty pozbawione do dalszych testów.</li>
		<li>Aby zbadać, czy komórki pęcherzykowe zostały oddzielone od nienaruszonych pęcherzyków, należy wybarwić nienaruszone pęcherzyki i oddzielone oocyty 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI).
		<ol>
			<li>Utrwalić próbki w 4% buforowanym paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Przemyć kilkakrotnie za pomocą PBS.</li>
			<li>Bejca przez DAPI w RT przez 30 min. Kilkakrotnie umyta PBS. Oglądaj i fotografuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (np. Leica DFC7000 T).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby potwierdzić zakończoną separację, utrwal nienaruszone pęcherzyki i oddzielone oocyty w 4% buforowanym paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C i zanurz w pożywce do zamrażania tkanek (np. Leica) w temperaturze -25 °C.
		<ol>
			<li>Wytnij utrwalone tkanki na mikrotomie i zamontuj na szkiełkach podstawowych.</li>
			<li>Umyj skrawki w PBS i uwidocznij jądra komórkowe za pomocą DAPI. Oglądaj i fotografuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dojrzewanie in vitro (IVM) i zapłodnienie in vitro (IVF)
UWAGA: Procedura IVM in vitro została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem z drobną modyfikacją 11,12,13.
<ol>
	<li>Przygotuj świeżą pożywkę do dojrzewania (+pożywkę DHP) przed wycięciem jajników od dorosłej samicy danio pręgowanego. Aby przygotować świeżą pożywkę do dojrzewania, dodaj 9 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz o pH 9,0 do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Dodać 10 μl 17α-20β-dihydroksy-4 pregnen-3-onu (DHP) (5 mg/ml), 490 μldH2O i 500 μl 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Przygotuj wcześniej roztwór Hanka i roztwór E3. Przygotuj roztwór Hanksa zgodnie z opisem Baarsa i wsp.14. Przygotuj pożywkę E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4 i 1-5% błękitu metylenowego.</li>
	<li>Wykonaj sekcję jajnika danio pręgowanego i izolację pęcherzyków jajnikowych, jak w kroku 2.</li>
	<li>Zbierz w pełni rozwinięte pęcherzyki i użyj jako niedojrzałych oocytów. Dla każdej dorosłej samicy danio pręgowanego można wyizolować co najmniej 150-200 w pełni rozwiniętych pęcherzyków etapowych. Wybierz nienaruszone i zdrowe mieszki włosowe do IVM.</li>
	<li>Inkubuj w pełni rozwinięte pęcherzyki w pożywce +DHP na płytkach 12-dołkowych, okresowo sprawdzając, czy oocyty pozostają nienaruszone. Usunąć wszelkie lityczne oocyty za pomocą pipety Pasteura. 
	UWAGA: Podczas dojrzewania oocytów oocyty stają się stopniowo przezroczyste. Większość oocytów staje się przezroczysta po leczeniu DHP przez 2 godziny. Można to zaobserwować pod mikroskopem preparacyjnym z optyką światła przechodzącego.</li>
	<li>Usunąć najbardziej zewnętrzne komórki pęcherzykowe z każdego dojrzałego oocytu, jak opisano w kroku 2.3.</li>
	<li>Przenieś ogołocone oocyty na szalkę Petriego z kilkoma kroplami pożywki hodowlanej i przystąp do zapłodnienia.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór nasienia, używając jąder wyciętych od co najmniej trzech samców w 500 μl roztworu Hanksa. Umieść roztwór nasienia na lodzie, gdzie może utrzymać swoją moc zapłodnienia do 2-3 godzin.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu nasienia do ogołoconych i dojrzałych oocytów na szalce Petriego. Delikatnie dodaj roztwór nasienia do jaj i zakręć plemniki i komórki jajowe razem za pomocą końcówki pipety.</li>
	<li>Natychmiast dodaj 1 ml roztworu pożywki E3, aby aktywować jaja i ponownie delikatnie zawiruj jaja i plemniki za pomocą końcówki pipety.</li>
	<li>Po około 1 minucie po zapłodnieniu (mpf) zalej płytkę roztworem pożywki E3. Pełne rozszerzanie kosmówki można zaobserwować w granicach 10-15 mpf.</li>
	<li>W przedziale 35-45 mpf wybierz zarodki, które przechodzą symetryczny podział na stadium 2-komórkowe i które są zatem zapładniane. Usuń zarodki, które nie przechodzą rozszczepienia komórek.</li>
	<li>Pozwolić zarodkom rozwinąć się na szalce Petriego w temperaturze 28 °C, przy czym limit wynosi 80 zarodków na 10 cm płytkę. Oglądaj i fotografuj rozwój zarodka.</li>
</ol>

<ol><li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine%2Fparacrine+control+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endocrine/paracrine control of zebrafish development.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).</li>
<li>Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrafollicular+paracrine+communication+in+the+zebrafish+ovary%3A+the+state+of+the+art+of+an+emerging+model+for+the+study+of+vertebrate+folliculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).</li>
<li>Li, J., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+studying+ovarian+development%3A+Recent+advances+from+targeted+gene+knockout+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication+in+the+mammalian+ovary%3A+oocytes+carry+the+conversation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation.</a> Science. 296, 2178-2180 (2002).</li>
<li>Liu, L., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor+9+and+its+spatiotemporal+expression+and+regulation+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary.</a> Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).</li>
<li>Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+%28PACAP%29+and+its+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+evidence+for+potentially+dual+roles+of+PACAP+in+controlling+final+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).</li>
<li>Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+3+is+involved+in+oocyte+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish.</a> Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Thomas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+G+protein-coupled+estrogen+receptor+1%2C+GPER%2C+in+inhibition+of+oocyte+maturation+by+endogenous+estrogens+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish.</a> Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).</li>
<li>Peyton, C., Thomas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+in+estrogen+inhibition+of+oocyte+maturation+mediated+through+the+G+protein-coupled+estrogen+receptor+%28Gper%29+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio).</a> Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).</li>
<li>Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+manipulation+of+maternal+gene+products+using+in+vitro+oocyte+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55213(2017).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).</li>
<li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135, 285-292 (2008).</li>
<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+heat+shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54492(2016).</li>
<li>Xie, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+based+on+in+vitro+oocyte+injection+to+improve+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 34555(2016).</li>
<li>Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+PDE9a+in+meiotic+maturation+of+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy tutaj nowatorską metodę prostego i szybkiego oddzielania komórek pęcherzykowych i oocytów od pęcherzyków jajnikowych danio pręgowanego. Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z metodą konwencjonalną. Najważniejszym z nich jest znacznie zwiększona łatwość separacji przy wysokiej wydajności i skuteczności, ponieważ wymagana jest tylko jedna i zewnętrzna manipulacja. Ten punkt zwiększa możliwość zastosowania dla badaczy, którzy nie są dobrzy w anatomii mikroskopowej. Z naszego doświadczenia wynika, że za pomocą szk...

Danio pręgowany jest głównym organizmem modelowym do badań nad rozwojem i fizjologią kręgowców. Danio pręgowany może służyć jako dobry model do badania molekularnych mechanizmów rozwoju jajników1,2,3. Wiele cech rozwoju jajników jest w dużym stopniu zachowanych podczas ewolucji od ryb do ssaków1,2. Podobnie jak inne kręgowce, dorosłe rybki danio pręgowanego mają asynchroniczne jajniki, zawierające pęcherzyki jajnikowe wszystkich etapów rozwoju4. Pęcherzyk jest podstawowym elementem rozrodczym jajnika. Pęcherzyk składa się z oocytu, który jest otoczony jedną lub kilkoma warstwami komórek somatycznych zwanych komórkami pęcherzykowymi. Rozwój pęcherzyków zależy od dwukierunkowej komunikacji między oocytami a komórkami pęcherzykowymi5. Niezbędne jest oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów od pęcherzyków jajnikowych do różnych celów badawczych, takich jak hodowla pierwotna komórek pęcherzykowych, analiza ekspresji genów, dojrzewanie oocytów i zapłodnienie in vitro.
Tradycyjne metody separacji obejmują mechaniczne rozdzielanie za pomocą kleszczy i trawienie enzymatyczne6,7,8,9,10. Jednak mechaniczne oddzielanie za pomocą kleszczy jest czasochłonne i pracochłonne. Spowoduje to również duże uszkodzenie oocytu podczas separacji. Chociaż metoda trawienia enzymatycznego jest prosta w obsłudze i wymaga krótkiego czasu, czas leczenia i stężenie enzymu powinny zostać zweryfikowane, a integralność i przeżywalność izolowanych oocytów nie są idealne. Dlatego opracowaliśmy prostą metodę oddzielania obu przedziałów na różnych etapach rozwoju za pomocą ciągniętych szklanych rurek kapilarnych.

<table><tbody><tr><td>17&alpha;,20&beta;-DHP</td><td>Cayman</td><td>16146-5 (5 mg)</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Obcinacz do ampułek</td><td>AS ONE</td><td>5-124-22 1 worek (100 sztuk)</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny Na2HPO4</td><td>Kaixin Chemical</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Krewetki solankowe</td><td>Hongjie</td><td>250 g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane</td><td>Biosharp</td><td>BS-90-D (10PCS/PK)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>S2110 (25mL)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>VETUS</td><td>HRC30</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Kefu</td><td>160 mm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara</td><td>szklana IWAKI</td><td>IK-PAS-5P (200 sztuk / opakowanie)</td><td></td></tr> <tr><td>Hoechst 33342</td><td>Solarbio</td><td>C0031 (1 mg)</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Kaixin Chemical</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 średni</td><td>Gibco</td><td>41300-039 (10 razy; 1L)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Penicilia-streptomycia</td><td>Gibco</td><td>#15140122 (100 mL)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>ZEISS</td><td>Odkryj.v20</td><td></td></tr></tbody></table>

oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Danio pręgowany stał się idealnym modelem do badania rozwoju jajników kręgowców. Pęcherzyk jest podstawową jednostką jajnika, która składa się z oocytów i otaczających komórek pęcherzykowych. Niezbędne jest oddzielenie zarówno komórek pęcherzykowych, jak i oocytów do różnych celów badawczych, takich jak pierwotna hodowla komórek pęcherzykowych, analiza ekspresji genów, dojrzewanie oocytów i zapłodnienie in vitro itp. Konwencjonalna metoda wykorzystuje kleszcze do oddzielenia obu przedziałów, co jest pracochłonne, czasochłonne i powoduje duże uszkodzenie oocytu. Tutaj opracowaliśmy prostą metodę oddzielenia obu komór za pomocą ciągniętej szklanej kapilary. Pod mikroskopem stereoskopowym oocyty i komórki pęcherzykowe można łatwo oddzielić przez pipetowanie w wyciągniętej cienkiej szklanej kapilarze (średnica zależy od średnicy pęcherzyka). W porównaniu z metodą konwencjonalną, ta nowa metoda ma wysoką skuteczność w oddzielaniu zarówno oocytów, jak i komórek pęcherzykowych oraz ma niewielkie uszkodzenia oocytów. Co ważniejsze, metoda ta może być stosowana do pęcherzyków we wczesnym stadium, w tym na etapie prewitellogenezy. W ten sposób ta prosta metoda może być stosowana do oddzielania komórek pęcherzykowych i oocytów danio pręgowanego.

Niniejszą metodę można wykorzystać do oddzielenia komórek mieszkowych i oocytów na różnych etapach rozwoju pęcherzyków jajnikowych u danio pręgowanego. Rycina 1 przedstawia oddzielanie oocytów i komórek mieszkowych z pęcherzyków jajnikowych danio pręgowanego za pomocą szklanej rurki kapilarnej (Rycina 1). Aby sprawdzić, czy komórki mieszkowe zostały oddzielone od nienaruszonych pęcherzyków, nienaruszone pęcherzyki oraz oddzielone oocyty z pęcherzyków na różnych ...

Tutaj prezentujemy prostą metodę rozdzielania komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajników danio pręgowanego, która ułatwi badania rozwoju jajników u danio pręgowanego.

Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzyku jajnikowym danio pręgowanego. Pęcherzyk jest podstawową jednostką jajnika, która składa się z oocytów i otaczających komórek pęcherzykowych. Jest to szerokie narzędzie do oddzielania zarówno komórek pęcherzykowych, jak i przedziałów zewnętrznych dla dobrze prowadzonych polityk badawczych, w tym pierwotnego wychwytywania komórek pęcherzykowych i wzrostu ekspresji genów, nasycenia i zapłodnienia in vitro.Ostatnio danio pręgowany stał się potężnym modelem Nissana, który bada kontrolę nad już opracowanym produktem. Tutaj przedstawiamy prostą metodę, dzięki której oddziela się komórki pęcherzykowe i oocyty pęcherzyka danio pręgowanego, co ułatwi badania już rozwoju u danio pręgowanego Komercyjna, bez masy lub dwie separacje o komórkach pęcherzykowych i wszystkich stronach spinów są używane do słupka, który ma labirynt, czasochłonny i miał duże uszkodzenia na zewnątrz. Tutaj ustaliliśmy prostą metodę na dwie oddzielne komory za pomocą lub rozdzielenie okularów Tamela pod czystą rafą.Nasz oscyloskop Metro, zarówno na zewnątrz, jak i komórki pęcherzykowe, można łatwo wyprodukować, wpisując wyciągnięt

separation-follicular-cells-oocytes-ovarian-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Zoptymalizowany protokół dojrzewania in vitro oocytów danio pręgowanego, używany do manipulacji produktami genów matki, jest prezentowany tutaj.

Funkcjonalna manipulacja matczynymi produktami genowymi z wykorzystaniem dojrzewania oocytów in vitro u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji tkanki gonad larw danio pręgowanego, który ułatwi badania różnicowania i utrzymania płci danio pręgowanego.

Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

Postęp w badaniach nad folikulogenezą preantralną wymaga skutecznych metod izolacji pęcherzyków z pojedynczych jajników. Przedstawiono uproszczony, mechaniczny protokół izolacji pęcherzyków z jajników bydlęcych za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizatora. Metoda ta pozwala na pobranie dużej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych z jednego jajnika.

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną procedurę szybkiego izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych, zapewniając tym samym wygodną metodę do badań specyficznych dla oocytów.

Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych

Tutaj opisujemy protokół separacji żółtka, komórek ziarnistych i komórek osłonki w ptasich pęcherzykach przedowulacyjnych. Ta precyzyjna obsługa umożliwia krytyczne badania nad rolą tych warstw w funkcjach rozrodczych, pomagając w zrozumieniu rozwoju pęcherzyków włosowych, regulacji hormonalnej i badań nad chorobami w celu zwiększenia plonów rolnych i wglądu biomedycznego.

Oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Prezentujemy techniki wymagane do wyizolowania zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysich pachwinowych (podskórnych) i okołogonadalnych (trzewnych) magazynów tkanki tłuszczowej w celu oceny ich ekspresji genów i aktywności kolagenolitycznej. Metoda ta obejmuje wzbogacanie komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.

Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalne podejście do morfologicznego i biochemicznego charakterystyki oocytów koni. W szczególności niniejsza praca ilustruje, w jaki sposób zbierać niedojrzałe i dojrzałe oocyty koni za pomocą ultrasonograficznego pobierania komórek jajowych (OPU) oraz jak badać segregację chromosomów, morfologię wrzeciona, globalną acetylację histonów i ekspresję mRNA.

Analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni

Poznaj metodę separacji komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego przy użyciu szklanej kapilary. Technika ta minimalizuje uszkodzenia oocytów i umożliwia badania biologii rozrodu.

Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów