Name: Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj test przecieku fluorescencyjnego do badania destabilizacji błon przez peptydy penetrujące komórkę. Ta metoda wykorzystuje liposomy z barwnikami fluorescencyjnymi do analizy interakcji peptydów z błonami lipidowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Emilie Josse za krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te były wspierane przez fundację "La Ligue contre le Cancer", "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" oraz "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

1. Przygotowanie dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV)
<ol>
	<li>Przygotuj LUV do użycia jako naśladownictwo błony komórkowej do testu nieszczelności fluorescencji.</li>
	<li>Wymieszać szklaną strzykawką Hamilton fosfatydylocholinę (DOPC, 786,11 g/mol), sfingomielinę (SM, 760,22 g/mol) i cholesterol (Chol, 386,65 g/mol) w stosunku molowym 4:4:2. Roztwór lipidów otrzymuje się z roztworu podstawowego każdego lipidu rozpuszczonego w rozpuszczalniku metanol/chloroform (3/1; objętość/objętość) w stężeniu 25 mg/ml w szklanej kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml. Na podstawie 4 μmol DOPC, 4 μmol SM i 2 μmol Chol, roztwór lipidów otrzymuje się z roztworu podstawowego przez zmieszanie odpowiednio 126 μl, 117 μl i 31 μl. 
	UWAGA: Metanol jest toksycznym i łatwopalnym rozpuszczalnikiem, a chloroform jest toksyczny i rakotwórczy. Oba powinny być obsługiwane z odpowiednią ochroną pod maską.</li>
	<li>Odparować metanol/chloroform za pomocą wyparki obrotowej w próżni przez 45-60 minut w temperaturze 60 °C, aż do powstania wysuszonego filmu lipidowego.</li>
	<li>Przygotować dwa podstawowe roztwory buforowe HEPES. Przygotować bufor HEPES 1, mieszając 20 mM HEPES (238,3 g/mol) i 75 mM NaCl (58,44 g/mol) i dostosować pH do 7,4. Przygotować bufor HEPES 2, mieszając 20 mM HEPES i 145 mM NaCl i dostosować pH do 7,4. HEPES mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc. 
	UWAGA: Zaleca się sprawdzenie osmolarności za pomocą osmometru.</li>
	<li>Przygotować roztwór hydratacji lipidów, rozpuszczając nieprzepuszczalną dla błony parę fluorescencyjną z wygaszaczem barwników, kwas 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy, sól disodową w stężeniu 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) i bromek p-ksylen-bispirydyny w stężeniu 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) w roztworze buforowym HEPES. Zmieszanie ANTS z DPX prowadzi do powstania roztworu o żółtym zabarwieniu. Aby osiągnąć stężenia 12,5 mM ANTS i 45 mM DPX, rozpuść odpowiednio 21,4 mg i 76 mg w 4 ml buforu HEPES 1, 
	UWAGA: Roztwór hydratujący lipidy można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C, owijając probówkę folią aluminiową.</li>
	<li>Rozpuść pęcherzyki wielopłytkowe (MLV) poprzez ponowne zawieszenie wysuszonego filmu lipidowego z 1 ml roztworu lipidowego i wirowanie aż do rozpuszczenia wysuszonego filmu lipidowego. Upewnij się, że roztwór jest całkowicie rozpuszczony, ponieważ małe agregaty lipidowe negatywnie wpłyną na poprzednie kroki. Sprawdź również ściankę szklanej kolby okrągłodennej, aby upewnić się, że nie pozostał film lipidowy. 
	UWAGA: Po rozpuszczeniu roztwór będzie opalizujący i jasnożółty.</li>
	<li>Poddaj pęcherzyki pięciu cyklom zamrażania/rozmrażania, aby uzyskać pęcherzyki jednopłytkowe. Wykonaj każdy cykl, umieszczając szklaną kolbę okrągłodenną na 30 s w ciekłym azocie do etapu zamrażania, a następnie pozostawiając ją w łaźni wodnej na 2 minuty w celu etapu rozmrażania. 
	UWAGA: Temperatura wody w kąpieli powinna być o 5-10°C wyższa niż temperatura topnienia lipidów.</li>
	<li>Przygotuj wytłaczarkę lipidową, wkładając dwie podpory filtracyjne wstępnie nawilżone buforem HEPES w każdym elemencie wytłaczarki z politetrafluoroetylenu (PTFE) umieszczonym w metalowym kanistrze wytłaczarki.</li>
	<li>Umieść nawilżaną membranę poliwęglanową HEPES (wielkość porów 0,1 μm, średnica 25 mm) na jednym wsporniku filtra.</li>
	<li>Zmontuj dwa metalowe kanistry wytłaczarki i przykręć je.</li>
	<li>Umieść zmontowaną wytłaczarkę w uchwycie i wprowadź strzykawkę o pojemności 1 ml do odpowiedniego otworu na końcu każdego elementu wytłaczarki z politetrafluoroetylenu. Wytłaczanie odpowiada przejściu badanej cieczy z jednej strzykawki do drugiej przez membranę poliwęglanową.</li>
	<li>Przetestuj wytłaczarkę z 1 ml buforu HEPES załadowanym do jednej ze strzykawek o pojemności 1 ml, aby upewnić się, że nie ma wycieków ani problemów.</li>
	<li>Zastąp 1 ml bufor HEPES próbką MLV.</li>
	<li>Przeprowadzić ekstruzję, przepuszczając próbkę MLV z jednej strzykawki do drugiej przez membranę poliwęglanową co najmniej 21 razy, aby uzyskać jednolite LUV o tym samym rozmiarze. 
	UWAGA: Wytłaczanie powinno odbywać się w temperaturze wyższej niż temperatura topnienia mieszaniny lipidów.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie LUV
<ol>
	<li>Przygotuj oczyszczanie kolumny, aby usunąć nadmiar niezamkniętych w kapsułkach ANTS i DPX.</li>
	<li>Wprowadzić usieciowany żel dekstranowy (G-50) zawieszony w środowisku wodnym z 0,01% NaN3 (65 g/mol) w kolumnie do chromatografii cieczowej (Luer Lock, bez płaszcza, 1,0 cm x 20 cm, objętość złoża 16 ml) do 1 cm poniżej górnej części bezbarwnej części kolumny.</li>
	<li>Otwórz kran i pozwól płynowi spłynąć, aby osadzić usieciowany żel dekstranowy.</li>
	<li>Przemyć kolumnę przez elucję 20 ml buforu HEPES 2 i odrzucić wyjściowy przepływ kolumny.</li>
	<li>Zamknąć kran, gdy martwa objętość rozpuszczalnika nad kolumną zostanie zminimalizowana (<100 μl), ale wystarczająca, aby uniknąć wysuszenia usieciowanego żelu dekstranowego.</li>
	<li>Umieść świeżo wytłaczane LUV (żółte) na kolumnie i pozwól im wejść do usieciowanego żelu dekstranowego.</li>
	<li>Ciągle dodawaj bufor HEPES 2 do kolumny, aby przeprowadzić oczyszczanie LUV.</li>
	<li>Eluować około 2 ml buforu HEPES 2 (nie zapomnij regularnie napełniać górnej części kolumny, aby uniknąć wysuszenia usieciowanego żelu dekstranowego): wolny żółty roztwór ANTS i DPX migruje wolniej niż liposomy.</li>
	<li>Zacznij zbierać oczyszczone LUV w probówkach (1,5 ml).</li>
	<li>Obserwuj krople eluentu z kolumny, a gdy staną się opalizujące, zawierają liposomy. Wymień probówkę, aby odzyskać frakcję zawierającą LUV.</li>
	<li>Eluty, aż krople przestaną opalizować (~1 ml). Następnie eluuj kolejne 0,5 ml w oddzielnej frakcji, a następnie przestań eluować. 
	UWAGA: Wzorce są teraz dostępne w szerokim zakresie mas cząsteczkowych, jako zestawy lub indywidualne masy cząsteczkowe do kalibracji objętości elucji LUV.</li>
	<li>Owiń probówki z LUV folią aluminiową, aby uniknąć wybielania barwnika fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 20 ml buforu HEPES 2.</li>
	<li>LUV można następnie przechowywać przez tydzień w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ponieważ stabilność LUV może zależeć od stężenia i składu LUV, a także od siły jonowej, rozmiar LUV powinien być kontrolowany za pomocą przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (patrz rozdział 4. Charakterystyka wielkości i jednorodności LUV) przed każdym badaniem.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja stężenia LUV
<ol>
	<li>Oszacuj stężenie LUV za pomocą zestawu do kwantyfikacji fosfolipidów, który umożliwia ocenę stężenia choliny19. Test ten może być stosowany, gdy fosfolipidy z choliną zawierającą głowę polarną są znaczne (>50% LUV).</li>
	<li>Przygotować odczynnik barwiący, rozpuszczając 18 mg substratu chromogenu w 3 ml dostarczonego buforu.</li>
	<li>Załaduj kuwetę polistyrenową o wymiarach 10 x 10 x 45 mm 3 ml odczynnika barwiącyego.</li>
	<li>Użyj odczynnika o czystym kolorze jako stanu ślepej (ślepej). Dodać 20 μl próbki LUV (test) lub 20 μl roztworu wzorcowego o znanym stężeniu choliny (wzorzec).</li>
	<li>Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C we wszystkich warunkach (ślepa próba, test i standardowa).</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję (gęstość optyczną, OD) badanej próbki i roztworu wzorcowego za pomocą roztworu ślepej próby jako próby kontrolnej przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Sprawdź wartości OD, które pozwalają oszacować stężenie lipidów w LUV, C[LUV], w ekwiwalencie choliny w porównaniu ze wzorcem znanego stężenia.</li>
	<li>Obliczenia należy wykonać, korzystając z następującego równania: 
	C[LUV] (mol / l) = (próbka OD / wzorzec OD) x C[Wzorzec] (mol / l) 
	UWAGA: Zestaw do oznaczania ilościowego fosfolipidów zawierał roztwór wzorcowy chlorku choliny (139,6 mg / l) o stężeniu 54 mg / dl, co odpowiada stężeniu molowemu C [Standard] = 3,87 mmol / L. Próbka OD i wzorzec OD to absorbancje mierzone przy 600 nm odpowiednio dla roztworów LUV i choliny.</li>
</ol>
4. Charakterystyka wielkości i jednorodności LUV
<ol>
	<li>Wykonaj pomiar za pomocą przyrządu DLS w celu określenia wielkości LUV (w nm) i wskaźnika polidyspersyjności (PdI).</li>
	<li>Zaprogramuj odpowiednią "standardową procedurę operacyjną" (SOP), wskazując lepkość rozpuszczalnika/buforu i użytej kuwety.</li>
	<li>Umieścić 500 μl roztworu LUV w polistyrenowej półmikrokuwecie.</li>
	<li>Włóż polistyrenową półmikrokuwetę do instrumentu DLS.</li>
	<li>W temperaturze pokojowej należy zmierzyć rozkład wielkości pod względem średniej wielkości (Z-średniej) rozkładu cząstek i jednorodności (wskaźnik polidyspersyjności, PdI).</li>
	<li>Wszystkie wyniki uzyskano z dwóch niezależnych pomiarów wykonanych każdy w trzech powtarzających się cyklach. 
	UWAGA: Standardowe wartości dla LUV będą miały średnią wielkość 137 ± 7 nm przy PdI 0,149 ± 0,041.</li>
</ol>
5. Przygotowanie roztworów peptydowych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy peptydu, który należy przeanalizować do testu nieszczelności.</li>
	<li>Rozpuść peptyd w proszku (czystość >95%) w czystej wodzie (np. 1 mg peptydu w 500 μl czystej wody). 
	UWAGA: Zaleca się rozcieńczanie peptydów w czystej wodzie i unikanie rozpuszczania dimetylosulfotlenku (DMSO), które mogłoby wywołać artefakty (np. przepuszczalność błony20).</li>
	<li>Wiruj roztwór peptydowy przez 5 sekund.</li>
	<li>Sonikować roztwór peptydu w wodnej kąpieli sonizacyjnej przez 5 minut, a następnie wirować przez 5 minut przy 12,225 x g. Zebrać szwadron nad osadem w celu oznaczenia stężenia.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 280 nm trzech niezależnych rozcieńczeń peptydów, a następnie obliczyć stężenie peptydu, korzystając z jego molowego współczynnika ekstynkcji ε (w zależności od zawartości tryptofanu i tyrozyny w sekwencji peptydowej) i reguły Beera-Lamberta. 
	UWAGA: Jeśli peptyd zawiera tryptofan i tyrozynę, współczynnik ekstynkcji molowej ε oblicza się na podstawie tryptofanu ε = 5,690 M-1 cm-1 i tyrozyny ε = 1,280 M-1 cm-1. Jeśli sekwencja peptydowa nie zawiera tryptofanu ani tyrozyny, można przeprowadzić inne testy kolorymetryczne w celu zmierzenia stężenia (np. BCA lub Bradford).</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór peptydu w czystej wodzie do końcowego roztworu 100 μM i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W czystej wodzie podczas przechowywania w 4 °C nie dochodzi do degradacji peptydów. Jednak stężenie peptydów należy mierzyć co 2 tygodnie, aby upewnić się, że nie dojdzie do parowania wody.</li>
</ol>
6. Test nieszczelności fluorescencji
<ol>
	<li>Test nieszczelności fluorescencji mierzy się na spektrofluorometrze w temperaturze pokojowej. Długość fali wzbudzenia i emisji jest ustalona odpowiednio na Ex = 360 nm ± 3 nm i Em = 530 nm ± 5 nm.</li>
	<li>Rozcieńczyć LUV w 1 ml buforu HEPES 2 do końcowego stężenia 100 μM w kwarcowej kuwecie fluorescencyjnej. Dodaj mieszadło magnetyczne, aby homogenizować roztwór podczas eksperymentu.</li>
	<li>Zmierz same LUV w ciągu pierwszych 100 s, między t = 0 s a t = 99 s, aby uzyskać dostęp do fluorescencji tła. 
	UWAGA: Podczas całego eksperymentu (15 minut) można również zmierzyć same LUV, aby uzyskać dostęp do fluorescencji tła i potencjalnych wycieków.</li>
	<li>Następnie zmierz nieszczelność jako wzrost intensywności fluorescencji po dodaniu podwielokrotności roztworu peptydu przez następne 900 s (15 min). Protokół ten przeprowadza się dla każdego stężenia badanego peptydu od 0,1 μM do 2,5 μM.</li>
	<li>Ostatecznie 100% fluorescencję osiągnięto poprzez solubilizację LUV przez dodanie 1 μl Triton X-100 (0,1%, v/v), w wyniku czego uzyskano całkowicie niewygaszoną sondę między t = 1000 s a t = 1,100 s.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja wycieku
<ol>
	<li>Pomijaj wartości uzyskane po t = 1,090 s, aby zachować tę samą liczbę punktów dla każdego badanego warunku.</li>
	<li>Obliczyć minimalną fluorescencję, Fmin, uzyskując średnią z 50 punktów między t = 0 s a t = 49 s (same LUV).</li>
	<li>Obliczyć maksymalną fluorescencję, Fmax, uzyskując średnią z 50 punktów między t = 1,041 s a t = 1,090 s (LUV z Triton X-100).</li>
	<li>Obliczyć procent wycieku (%Leak) w każdym punkcie czasowym (t = x), zgodnie z następującym równaniem: 
	%Leak(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla wartości uzyskanych przy różnym przygotowaniu LUV (n ≥ 2) dla tego samego stanu.</li>
	<li>Wykreślić procent wycieku, %Leak(t=x), w funkcji czasu (s).</li>
</ol>

<ol><li>Langel, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangel%2C+U+%22Handbook+of+Cell-Penetrating+Peptides%22">Handbook of Cell-Penetrating Peptides</a>. , CRC Press. (2006).</li>
<li>Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+tools+for+intracellular+delivery+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+CMLS%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).</li>
<li>Richard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides.+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2003).</li>
<li>Jones, A., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides%3A+tales+of+tails+wagging+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).</li>
<li>Tünnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li>
<li>Jiao, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+and+endocytosis+for+cell-penetrating+peptide+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).</li>
<li>Deshayes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+internalization+mechanism+of+WRAP%3AsiRNA+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252(2020).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+vectorisation+property%3A+A+comparative+study+for+a+secondary+amphipathic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide.</a> International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).</li>
<li>Lehto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+determines+the+exon+skipping+activity+of+Pip6a-PMO+in+mdx+skeletal+and+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).</li>
<li>Hoyer, J., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+vectors+for+the+nonviral+delivery+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids.</a> Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).</li>
<li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+classes%2C+origin%2C+and+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li>
<li>Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cellular+uptake+using+22+CPPs+in+4+different+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).</li>
<li>Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+penetrating+peptides%3A+a+comparative+transport+analysis+for+474+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs.</a> Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).</li>
<li>Maget-Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monolayer+technique%3A+a+potent+tool+for+studying+the+interfacial+properties+of+antimicrobial+and+membrane-lytic+peptides+and+their+interactions+with+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).</li>
<li>Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+in+cancer%3A+The+relevance+of+drug-membrane+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-based+nanoparticles+to+rapidly+and+efficiently+%22Wrap+%27n+Roll%22+siRNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).</li>
<li>Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+evaluate+the+cellular+uptake+of+CPPs+with+fluorescence+techniques%3A+Dissecting+methodological+pitfalls+associated+to+tryptophan-rich+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li>
<li>Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+enzymatic+method+for+determination+of+serum+choline-containing+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3B+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids.</a> Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).</li>
<li>Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+Dimethylsulfoxide+%28DMSO%29+action+on+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+cellular+uptake+mechanism+of+a+secondary+amphipathic+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).</li>
<li>Vaissière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retro-inverso+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34(2017).</li>
<li>Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structure+of+cell-penetrating+peptides+controls+membrane+interaction+and+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domains+of+HIV-1+and+SIV+TAT+interact+with+charged+lipid+vesicles.+Binding+mechanism+and+thermodynamic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li>
<li>Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li>
<li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li>
<li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+assay+in+column+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li>
<li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li>
<li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571(2012).</li>
<li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell-Penetrating+Peptides%22%5BJournal%5D)">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li>
<li>Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li>
<li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+permeabilization+by+oligomeric+%CE%B1-Synuclein%3A+in+search+of+the+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292(2010).</li>
<li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li>
<li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291(2012).</li>
<li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Przedstawiony test nieszczelności fluorescencji jest prostą i szybką metodą radzenia sobie z destabilizacją błony przez peptyd penetrujący komórki. Łatwe do wykonania, umożliwia również pośrednie porównanie różnych peptydów oddziałujących z błoną lub innych cząsteczek oddziałujących z błoną. Jeśli chodzi o krytyczne etapy protokołu, ponieważ test ten zapewnia względne wartości między linią bazową (same LUV) a maksymalnym uwalnianiem fluorescencji (warunek Trytona), zwykle oceniamy stężenie LUV za pomocą zestawu do kwanty...

Po ich odkryciu w latach dziewięćdziesiątych, opracowano peptydy penetrujące komórki (CPP), aby promować efektywne komórkowe dostarczanie ładunków przez błonę plazmatyczną1,2. CPP to zwykle krótkie peptydy, zwykle od 8 do 30 aminokwasów, o różnorodnym pochodzeniu. Po raz pierwszy zdefiniowano je jako nosicieli "bezpośrednio translokujących", co oznacza, że były w stanie przekroczyć błonę plazmatyczną i przenieść ładunek do komórek niezależnie od jakiegokolwiek szlaku endocytotycznego, ani zapotrzebowania na energię, ani zaangażowania receptora. Jednak dalsze badania wykazały, że te pierwsze obserwacje pochodziły głównie z przeszacowania fluorescencji spowodowanego artefaktem eksperymentalnym i/lub protokołami utrwalania przy użyciu metanolu3. Obecnie powszechnie przyjmuje się, że wychwyt CPP odbywa się zarówno przez endocytozę, jak i translokację niezależną od energii4,5,6,7 w zależności od różnych parametrów, takich jak charakter ładunku, użyte ogniwo między CPP a ładunkiem, badana linia komórkowa itp.
CPP mogą być używane jako środki transfekcyjne zgodnie z dwiema strategiami, albo obejmującą połączenie chemiczne (strategia kowalencyjna), albo interakcje elektrostatyczne/hydrofobowe (strategia niekowalencyjna) między CPP a jego ładunkiem8,9,10,11. Chociaż obie strategie wykazały swoją skuteczność w przenoszeniu komórek kilku ładunków, zrozumienie mechanizmu internalizacji przez CPP jest nadal przedmiotem kontrowersji, a równowaga między szlakami endocytozy a bezpośrednią penetracją jest nadal trudna do zmierzenia12,13. Chociaż dostępny jest zestaw narzędzi i strategii eksperymentalnych, które wyraźnie odnoszą się do udziału procesów endocytarnych, bezpośrednia translokacja wydaje się jednak trudniejsza do scharakteryzowania, ponieważ implikuje bardziej dyskretne interakcje ze składnikami błony plazmatycznej. Błony biologiczne zwykle składają się z wielu składników, od fosfolipidów po białka błonowe, które mogą się różnić w zależności od typu komórki i/lub środowiska (warunki stresowe, podział komórek itp.). Ta różnorodność składu, a co za tym idzie brak uniwersalnego modelu błony komórkowej, nie pozwala na jednoznaczne badania. Jednak, aby obejść te ograniczenia, opracowano metody krok po kroku z wykorzystaniem sztucznej błony lub ekstraktów z błony. Od małych pęcherzyków jednowarstwowych po podejścia jednowarstwowe, każdy model był wyraźnie trafny, aby odpowiedzieć na konkretne pytania14,15. Wśród nich duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) stanowią odpowiedni model naśladujący błonę do badania interakcji peptyd/błona jako kluczowego punktu w procesie internalizacji.
W tym kontekście, poniższy protokół opisuje badanie wpływu peptydów i interakcji peptyd/błona na integralność LUV poprzez monitorowanie zarówno anionowego barwnika fluorescencyjnego, jak i odpowiadającego mu polikationowego tłumika zamkniętego w liposomach. Narzędzie to służy do badania interakcji CPP/błona w celu zrozumienia, czy są one w stanie przeprowadzić bezpośrednią translokację błony. Chociaż zwykle stosuje się go do porównywania różnych peptydów oddziałujących z błoną, ten test nieszczelności fluorescencji LUV może być również wykorzystany do badania zarówno koniugatów CPPs-ładunek (strategia kowalencyjna), jak i kompleksów CPP: cargo (strategia niekowalencyjna).
Obecny protokół zostanie więc po raz pierwszy zilustrowany za pomocą niedawno opracowanych peptydów amfipatycznych bogatych w tryptofan (W) i argininę (R) (WRAP)16. WRAP jest w stanie tworzyć nanocząstki na bazie peptydów, aby szybko i skutecznie dostarczać małe interferujące RNA (siRNA) w kilku liniach komórkowych16. Monitorowano właściwości wycieku fluorescencji samego peptydu WRAP lub nanocząstek na bazie SIRNA na bazie WRAP w celu scharakteryzowania ich mechanizmu internalizacji komórkowej. Wykazaliśmy, że ich mechanizm internalizacji obejmował głównie bezpośrednią translokację7. W drugim przykładzie peptyd WRAP został kowalencyjnie sprzężony z peptydem interferującym białko/białko iCAL36 (WRAP-iCAL36)17, a jego zdolność do destabilizacji błon porównano w teście wycieku fluorescencji z iCAL36 sprzężonym z Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), innym CPP.
Na koniec, zalety i ograniczenia tej metody zostaną omówione zarówno z technologicznego punktu widzenia, jak i w odniesieniu do znaczenia biologicznego.

<table><tbody><tr><td>Szklana kolba okrągłodenna 25 ml</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy, sól disodowa (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Chronić przed światłem&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoylfosfatydylocholina)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Chronić przed dostępem powietrza</td></tr><tr><td>Wytłaczarka</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorymetr</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; Szklana strzykawka L</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Test laboratoryjny Fosfolipid&nbsp;</td><td>WAKO&nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>kolumna do chromatografii cieczowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa Nuclepore (0,1 &mikro; m Rozmiar porów, średnica 25 mm)</td><td>Kuweta polistyrenowa Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenowa półmikrokuweta, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>bromek p-ksylenu i bispirydyniowy (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Chronić przed światłem&nbsp;</td></tr><tr><td>kwarcowa kuweta fluorescencyjna</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor&nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 żywica</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel Sonicator USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Chronić przed dostępem powietrza</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Peptydy penetrujące komórki (CPP) są zdefiniowane jako nośniki, które są w stanie przejść przez błonę plazmatyczną i przenieść ładunek do komórek. Jedna z głównych wspólnych cech wymaganych dla tej aktywności wynikała z interakcji CPP z błoną plazmatyczną (lipidami), a w szczególności ze składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej samej błony (siarczan heparanu). Rzeczywiście, niezależnie od bezpośredniej translokacji lub internalizacji zależnej od endocytozy, dwuwarstwy lipidowe biorą udział w procesie internalizacji zarówno na poziomie błony plazmatycznej, jak i na poziomie ruchu wewnątrzkomórkowego (pęcherzyki endosomalne). W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół opisujący różne etapy formułowania, oczyszczania, charakterystyki i zastosowania dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV) w teście nieszczelności fluorescencji w celu wykrycia możliwej destabilizacji/interakcji błony CPP i zajęcia się ich rolą w mechanizmie internalizacji. LUV o składzie lipidowym odzwierciedlającym zawartość błony plazmatycznej są wytwarzane w celu enkapsulacji zarówno barwnika fluorescencyjnego, jak i wygaszacza. Dodanie peptydów do podłoża pozapęcherzykowego i indukcja oddziaływań peptyd-błona na LUV może zatem wywołać w sposób zależny od dawki znaczny wzrost fluorescencji ujawniający nieszczelność. Przykłady przedstawiono tutaj z niedawno opracowanymi peptydami amfipatycznymi bogatymi w tryptofan (W) i argininę (R), które wykazały szybkie i wydajne dostarczanie siRNA w różnych liniach komórkowych. Na koniec omówiono naturę tych interakcji i powinowactwo do lipidów, aby zrozumieć i poprawić translokację błony i/lub ucieczkę endosomalną.

Zasada testu wycieku fluorescencji została przedstawiona na Rysunku 1. Szczegółowo: duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUVs) zawierające barwnik fluorescencyjny i wygaszacz (brak sygnału fluorescencji) poddaje się działaniu badanej biomolekuły. W wyniku oddziaływania peptydu z błonami lipidowymi, co może prowadzić do zmiany przepuszczalności błony, jej reorganizacji lub nawet przerwania, barwnik fluorescencyjny i wygaszacz są uwalniane z LUVs. Następujące rozcie...

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Ten test nieszczelności fluorescencji jest prostą metodą radzenia sobie z destabilizacją błony za pomocą biomolekuł. Używając liposomów otoczonych barwnikami fluorescencyjnymi, można go użyć do porównania różnych peptydów oddziałujących na błony. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania destabilizacji błony przez peptydy penetrujące komórki w celu zrozumienia mechanizmu internalizacji komórkowej i oceny ich udziału w bezpośredniej translokacji błony.W porównaniu z błonami biologicznymi, liposomy umożliwiają kontrolę składu fosfolipidów w celu naśladowania różnych wartości lipidów, takich jak błony osocza, endosomalne lub mitochondrialne. Aby przygotować LUV do użycia jako naśladownictwo błony komórkowej do testu nieszczelności fluorescencji, użyj szklanej strzykawki Hamiltona do wymieszania fosfatydylocholiny, sfingomieliny i cholesterolu w stosunku molowym 4:4:2. Za pomocą wyparki obrotowej odparowywać chloroform metanolu w próżni przez 46 do 50 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aż utworzy się wysuszony film lipidowy.Aby odtworzyć pęcherzyki wieloblaszkowe, należy ponownie zawiesić wysuszony film lipidowy jednym mililitrem roztworu lipidowego i dokładnie wymieszać, aż wysuszony film lipidowy się rozpuści. Po upewnieniu się, że wszystkie lipidy zostały włączone i że na bokach kolby nie pozostał żaden film, zamrozić i rozmrozić pęcherzyki pięć razy przez 30 sekund w ciekłym azocie i dwie minuty w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni na cykl. Aby przygotować wytłaczarkę lipidową, włóż dwie wsporniki filtrów z buforem HEPES do każdego elementu wytłaczarki PTFE w metalowym kanistrze wytłaczarki i umieść nawilżaną membranę poliwęglanową HEPES o porach 0,1 mikrona na górze jednego wspornika filtra.Przykręć ze sobą dwa metalowe kanistry ekstrudera i umieść zmontowaną wytłaczarkę w uchwycie. Aby sprawdzić, czy wytłaczarka nie jest szczelna lub nie ma innych problemów, należy wprowadzić pustą strzykawkę o pojemności jednego mililitra do odpowiedniego otworu na jednym końcu elementu wytłaczarki PTFE i drugą strzykawkę o pojemności jednego mililitra załadowaną jednym mililitrem buforu HEPES na drugim końcu, a następnie dostarczyć próbkę pęcherzyków wielopłytkowych do wytłaczarki w ten sam sposób i przepchnąć próbkę z jednej strzykawki do drugiej przez membranę poliwęglanową co najmniej 21 razy, aby uzyskać jednolite LUV. Aby oczyścić LUV, dodaj świeżo wytłaczane LUV do kolumny chromatografii cieczowej i pozwól pęcherzykom dostać się do usieciowanego żelu dekstranowego.Ciągle dodawaj bufor HEPES dwa do kolumny i rozpocznij elucję około dwóch mililitrów buforu HEPES dwa. Wolny żółty roztwór ANTS i DPX będzie migrować wolniej niż liposomy. Po wymyciu jednego mililitra zacznij zbierać oczyszczone LUV w 1,5-mililitrowych probówkach.Gdy krople eluentu staną się opalizujące, zmień probówkę, aby odzyskać frakcję zawierającą LUV. Gdy krople nie są już opalizujące, wymyj kolejne 500 mikrolitrów w oddzielnej frakcji przed zatrzymaniem elucji. Aby określić wielkość LUV i wskaźnik polidyspersyjności, należy wskazać lepkość rozpuszczalnika w polistyrenowej półmikrokuwecie, która ma być użyta w eksperymencie, oraz system dynamicznego rozpraszania światła i dodać 500 mikrolitrów roztworu LUV do kuwety, a następnie załadować kuwetę na przyrząd i zmierzyć rozkład wielkości pod względem średniej wielkości rozkładu cząstek i jednorodności.Aby zmierzyć wyciek fluorescencji, rozcieńczyć LUV w jednym mililitrze buforu HEPES dwa w kwarcowej kuwecie fluorescencyjnej do końcowego stężenia 100 mikromoli i dodać mieszadło magnetyczne, aby ułatwić homogenizację roztworu podczas eksperymentu. Zmierz same LUV w ciągu pierwszych 100 sekund, aby ocenić fluorescencję tła przed pomiarem wycieku jako wzrostu intensywności fluorescencji po dodaniu podwielokrotności roztworu peptydu w ciągu następnych 900 sekund. Aby zmierzyć 100% wyciek kwiatostanu jako kontrolę pozytywną, dodaj jeden mikrolitr Triton X-100 do LUV w celu rozpuszczenia pęcherzyków, co spowoduje całkowite wygaszenie sondy w ciągu ostatnich 100 sekund analizy.Następnie użyj wzoru, aby obliczyć procent wycieku w każdym punkcie czasowym. W przypadku braku peptydów nie obserwuje się wycieku fluorescencji z LUV. Dodanie WRAP do LUV indukuje znaczny wzrost fluorescencji, ujawniając ważny wyciek LUV i uwolnienie ANTS.Po 15 minutach uzyskuje się wyciek około 67% w obecności 2,5 mikromolowego WRAP w porównaniu z kontrolą pozytywną Triton. W przeciwieństwie do tego, gdy WRAP jest łączony w tym samym stężeniu z małymi interferującymi RNA, tworząc nanocząstki na bazie peptydów, wyciek jest 1,5 raza słabszy w porównaniu z wolnym peptydem. W przypadku stosowania sprzężonego peptydu Penetratin-iCAL nie wykrywa się znaczącego wzrostu fluorescencji, natomiast dodanie peptydu WRAP-iCAL wywołuje wyciek netto charakteryzujący się bardzo silnym sygnałem fluorescencyjnym przy tym samym stężeniu 2,5 mikromolowym.Wyniki te wskazują, że test nieszczelności fluorescencji może być wykorzystany do ujawnienia zdolności niektórych peptydów penetrujących komórki do przeprowadzania interakcji błony peptydowej, prowadzących do mniej lub bardziej wyraźnej przepuszczalności błony. Metoda ta sprzyja szybkiej identyfikacji interakcji peptydów błonowych, które prowadzą do destabilizacji błony, w celu rozszyfrowania mechanizmu internalizacji peptydów penetrujących komórki lub innych peptydów aktywnych błonowo, takich jak peptydy fotogenne lub przeciwdrobnoustrojowe. W przypadku interakcji peptyd-lipid bez indukcji przecieku wymagane są inne podejścia, takie jak eksperymenty z fluorescencją tryptofanu.Ten test wycieku fluorescencji jest szeroko stosowany w dziedzinie CPP i może dostarczyć ważnych informacji na temat translokacji komórek lub ucieczki endosomalnej.

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego pomiaru translokacji peptydów do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych. Metoda ta dostarcza również informacji o szybkości translokacji przez błonę i może być wykorzystana do identyfikacji peptydów, które w sposób wydajny i spontaniczny przenikają przez dwuwarstwy lipidowe.

Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Ten film opisuje test mikropłytek in vitro oparty na fluorescencji w celu zbadania kinetyki degradacji znakowanego fluorescencyjnie, nieprawidłowo sfałdowanego zmutowanego białka lucyferazy, ulegającego ekspresji w jądrach transfekowanych komórek ssaków. Test polega na traktowaniu komórek eksprymujących zmutowane białko fluorescencyjne za pomocą inhibitora translacji i inhibitora proteasomu w celu oceny degradacji nieprawidłowo sfałdowanego białka za pośrednictwem proteasomu.

Test pościgowy cykloheksymidu oparty na mikropłytkach fluorescencyjnych: technika monitorowania kinetyki degradacji fluorescencyjnych nieprawidłowo sfałdowanych białek jądrowych

Ten film omawia test wycieku fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydów penetrujących komórki z błonami komórkowymi za pomocą mimiki błony komórkowej - dużych pęcherzyków jednopłytkowych lub LUV, otoczonych barwnikiem fluorescencyjnym i gaszącym.

Test nieszczelności fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydu przenikającego przez komórkę z błoną

Ten film demonstruje test do badania skuteczności uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory, która tworzy pory w błonie komórkowej. W obecności zewnątrzkomórkowych jonów wapnia pory powodują napływ wapnia, wywołując zdarzenia ponownego uszczelniania błony. Skuteczność ponownego zamykania ocenia się za pomocą barwnika jodku propydyny wiążącego DNA, który dostaje się do komórek tylko bez ponownie uszczelnionej błony.

Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Poznaj test przecieku fluorescencyjnego do badania destabilizacji błon przez peptydy penetrujące komórkę. Ta metoda wykorzystuje liposomy z barwnikami fluorescencyjnymi do analizy interakcji peptydów z błonami lipidowymi.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Przeglądaj więcej filmów